一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法，所述伪狂犬灭活疫苗的病毒株为伪狂犬病毒PRV-HB株，其保藏号为CGMCC?NO.8758，保藏日期为2014年01月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明制备的伪狂犬病灭活疫苗具有良好的安全性，免疫犬后可并产生理想的免疫保护效果，可作为防控犬科动物伪狂犬的候选疫苗株。
【专利说明】一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法，具体涉及一株伪狂犬病毒PRV-HB制备的用于犬科动物伪狂犬防控的灭活疫苗，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的经济动物和家畜的一种急性传染病。其特征是发热、奇痒、脑脊髓炎等。犬和猪的伪狂犬病已屡见报道。该病最早在1813年流行于美国的牛群中，1902年匈牙利学者奥叶兹基(Aujeszky)第一次较为详细的描述了该病，故命名为奥叶兹基病(又称Aujeszky氏病，Aujeszky’ s disease, AD), 1910年,Schmiedhofer通过过滤试验证实本病病原为病毒首先分尚出病毒。
[0003]1947年刘永纯发现猫的伪狂犬病以来，我国已有20多个省市先后报道该病。1995年，首次有貉感染PRV的报道。自2012年以来，山东，河南，河北等相继出现犬、狐和貉大规模感染PRV并死亡的报道。
[0004]随着我国经济动物及毛皮动物养殖规模的逐年扩大，切实做好PR防控已迫在眉睫。由于PR造成的死亡率几乎高达100%，对养殖业危害巨大。疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，因而研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效疫苗具有重要的意义。目前，在规模化猪场，一般采用PRV基因缺失疫苗进行防制PR。但是没有针对犬、狐和貉的PR疫苗，鉴于此本发明开展相关疫苗研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法，所述的伪狂犬灭活疫苗为伪狂犬病毒PRV-HB株保藏号为CGMCC N0.8758，分类命名为伪狂犬病毒，保藏曰期为2014年01月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0006]本发明目的之二是提供一种伪狂犬(PR)灭活疫苗的制备方法。
[0007]伪狂犬病毒株的分离与鉴定:2012年，病料采集自河北省某经济动物养殖场发病死亡狐和貉脑、扁桃体及肝脏组织，病料经过研磨后，接种已长成单层的猪肾上皮细胞(PK15细胞)，对组织培养物用伪狂犬病(PRV)特异性引物进行PCR扩增鉴定gE和gB基因，扩增gE基因引物分别为gE - F和gE - R，其核苷酸序列分别SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 ；扩增gB基因引物分别为gB - F和gB - R，其核苷酸序列分别SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。并进行兔体致病性试验，证明分离的病毒为PRV，命名PRV-HB-12株，简称为PRV-HB株。
[0008]由犬科动物(犬、狐、貉等)伪狂犬灭活疫苗病毒PRV-HB株制备的伪狂犬灭活疫苗。所述伪狂犬灭活疫苗中含伪狂犬病毒PRV-HB株> 106TCID50/头份
[0009]本发明伪狂犬病灭活疫苗的制备方法:
[0010]伪狂犬病毒PRV-HB株增殖后进行病毒滴定，依所含免疫剂量，加入灭活剂，及佐剂后制备疫苗。
[0011]进一步的，上述制备方法中，所述的伪狂犬病毒PRV-HB株的增殖包括以下步骤:
[0012]在已长成单层的PK15细胞中，按2 %比例接种伪狂犬病毒种毒，置于37°C，5 % C02培养箱中，培养96h，反复冻融3次后收获，置_20°C保存，应不超过6个月。
[0013]更进一步的，在上述制备方法中，所述的灭活剂为丙内酯，所述的佐剂为Montanide PET GEL A (简称 GEL Α)。
[0014]本发明伪狂犬病灭活疫苗的制备，具体包括以下步骤:
[0015]将检验合格的伪狂犬病毒PRV-HB株，在ΡΚ15细胞中大量增殖，经0.2% β -丙内酯灭活48h，加入8% GEL A，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下，乳化lOmin，制备常规
灭活疫苗。
[0016]本发明PR灭活疫苗的安全性和免疫原性试验结果表明，本发明对犬具有良好的安全性，免疫犬后可并 产生理想的免疫保护效果，可作为防控犬科动物伪狂犬的候选疫苗株。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为PRV-HB株gE和gB基因扩增结果图，其中，M为DL2000DNA Marker, I为阴性对照，2为gB基因片段扩增产物，3为阴性对照，4为gE基因片段扩增产物；
[0018]图2为疫苗免疫后，各组犬抗体水平图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0020]实施例1本发明PRV-HB株的分离鉴定
[0021]材料与方法
[0022]I病料和细胞病料采集自河北省某经济动物养殖场发病死亡狐和貉脑、扁桃体及肝脏组织，PK15细胞由哈尔滨兽医研究所提供。
[0023]2病毒增殖发病死亡狐、貉的脑、扁桃体及肝脏组织，用组织匀浆器研磨后，用Hanks’液作1:5稀释制成悬液,加入青/链霉素至1000U/mL，反复冻融3次，经12000rpm离心10min，取上清，接种已长成单层的PK15细胞，于5% CO2, 37°C培养箱培养96h，反复冻融3次，离心取上清，_70°C保存备用。
[0024]3分子生物学试剂DNA提取试剂盒购自Omega公司；PCR扩增所用的LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)公司；胶回收(小量)试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
[0025]4载体和菌种PMD18-T克隆载体和DH5 α大肠杆菌感受态细胞购自宝生物工程(大连)公司。
[0026]5引物设计利用01igo6.0软件设计合成扩增PRV中gE和gB基因的特异性引物，扩增gE基因引物分别为gE - F和gE - R，其核苷酸序列分别SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 ；扩增gB基因引物分别为gB - F和gB - R，其核苷酸序列分别SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。
[0027]6gE和gB基因的PCR扩增PCR扩增程序:
[0028]94。0预变性411^11，
[0029]94 O 变性 30 秒，
[0030]55 O 退火 3O 秒，
[0031]72°C延伸 Imin,
[0032]循环扩增30次；
[0033]72O延伸 IOmin。
[0034]PCR产物用上海华舜公司胶回收(小量)试剂盒回收。
[0035]7连接与转化将胶回收的PCR产物与pMD18-T载体连接后，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，然后取出100 μ L菌液涂布于含有氨苄青霉素(SOyg/mL)的LB平板上，37°C培养16h。挑取白色孤立菌落,接种于5mL含有氨节青霉素(50yg/mL)的液体LB培养基中，37°C 培养 12h。
[0036]8目的基因测序将经过鉴定为阳性的菌液，送Invitrogen公司进行序列测定。
[0037]9兔体致病性试验 取取6只3月龄家兔(由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供)分2组，攻毒组4只，每只兔颈部皮下注射ImL含PRV细胞培养上清，对照组2只，每只颈部皮下注射Iml Hanks’液，48h观察家兔发病情况。
[0038]试验结果:
[0039]IPCR结果gE和gB基因片段的大小分别约为0.4kb和0.3kb，与预期的大小相符，结果见图1所示。
[0040]2兔体致病性试验结果攻毒48h后，攻毒组家兔舔咬后肢直至掉毛、破损和出血，继而出现体温升高、四肢麻痹，抽搐、角弓反张乃至瘫痪，最后衰竭死亡；对照组未见可见临床症状。
[0041]实施例2本发明犬科动物PR灭活疫苗的制备及其免疫效力评价
[0042]I材料与方法
[0043]1.1病毒增殖及滴定在已长成单层的PK15细胞中，以2%比例接种PRV-HB种毒，置于37°C，5% CO2培养箱中，培养96h，反复冻融3次后收获，12000rpm离心10min，取上清，滴定后置_20°C保存，应不超过6个月。
[0044]1.2病毒灭活及乳化将细胞培养制得的上清加入0.2 %的β -丙内酯，灭活48h，经检测灭活完全后，加入8%的GEL A，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下，乳化lOmin。
[0045]I.3犬体免疫效力评价
[0046]1.3.1免疫与攻毒将8只10周龄PRV抗体检测阴性比格犬(购自广州医药研究总院有限公司实验动物研究开发中心)随机分为2组。第I组(5只)为疫苗免疫组，皮下注射单剂量佐剂疫苗，免疫2次，每次间隔14d ;第2组(3只)为对照组皮下注射Iml PBS。二免后14d，通过肌肉注射攻毒lml(106TCID5Q/ml)PRV-HB。攻毒前，所有犬均通过肌肉注射
0.15mL/kg的犬眠宝进行麻醉。
[0047]1.3.2临床症状攻毒后ld-lOd，每日定时观察各组犬的临床症状。
[0048]1.3.3病毒排毒检测攻毒后ld-lOd，每天采集各组犬的鼻咽拭子，通过PCR方法检测犬的排毒情况。[0049]1.3.4抗体检测各组犬在免疫前0d，及免疫后lw(l周)、2w、3w、4w采血，分离血清，用IDEXX抗体阻断ELISA试剂盒测定抗体水平。
[0050]2试验结果
[0051]2.1疫苗免疫后犬的抗体水平
[0052]疫苗免疫组在一免后2w出现低水平抗体；二免后Iw出现较高针对PRV特异性水平抗体(阻断率< 0.6为阳性)，对照组犬未产生抗体，见图2所示。
[0053]2.2攻毒后犬的临床症状
[0054]整个攻毒阶段，疫苗免疫犬未出表现可视临床症状。对照犬在攻毒后第2d开始表现精神沉郁、食欲下降、流涎、啃咬注射部位等症状，第3d出现犬只死亡，攻毒第4天对照组犬全部死亡。
[0055]2.3攻毒后的排毒情况
[0056] 疫苗免疫所有犬未检测到病毒排出；阴性对照组在攻毒后第2d开始出现排毒，持续到攻毒后第4d至所有犬死亡。
【权利要求】
1.一种伪狂犬灭活疫苗病毒株，其特征在于:所述伪狂犬灭活疫苗的病毒株为伪狂犬病毒PRV-HB株，其保藏号为CGMCC N0.8758，保藏日期为2014年Ol月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.由如权利要求1所述的伪狂犬灭活疫苗病毒株制备的伪狂犬灭活疫苗。
3.根据权利要求2所述的伪狂犬灭活疫苗,其特征在于:所述伪狂犬灭活疫苗中含伪狂犬病毒PRV-HB株≥IO6TCID50/头份。
4.如权利要求2所述的伪狂犬灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 伪狂犬病毒PRV-HB株增殖后进行病毒滴定，依所含免疫剂量，加入灭活剂，及佐剂后制备疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的伪狂犬病毒PRV-HB株的增殖包括以下步骤: 在已长成单层的PK15细胞中，按2%比例接种伪狂犬病毒种毒，置于37°C，5%C02培养箱中，培养96h，反复冻融3次后收获，置_20°C保存，应不超过6个月。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于:所述的灭活剂为β-丙内酯，所述的佐剂为称GEL A0
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于:具体包括以下步骤: 将检验合格的伪狂犬病毒PRV-HB株，在ΡΚ15细胞中大量增殖，经0.2% β -丙内酯灭活48h,加入8%GELA，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下，乳化lOmin，制备常规灭活疫苗。
【文档编号】C12N7/00GK103981151SQ201410142612
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】刘大飞, 刘春国, 程景, 张洪英, 曲连东 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所