一株高产电的拜氏梭菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株高产电的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium?beijerinckii），菌株号M13，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC?NO：M2013424，保藏日期为2013年9月14日。本发明还公开了上述高产电的拜氏梭菌在产电中的应用。本发明的拜氏梭菌在1g/L葡萄糖种子液中，0.15g/L甲基紫精（MV）为电子介体时，最大输出电压高达230mV，最大输出功率密度为79.2mW/m2。本发明的工艺简单、操作方便、无污染、成本低，其燃料利用普较广，电子回收率较高，缓解了能源危机，是一株适合于微生物燃料电池研究及应用的优良菌株。
【专利说明】一株高产电的拜氏梭菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境与新能源【技术领域】，具体涉及一种拜氏梭菌及其在利用葡萄糖等碳源在微生物燃料电池发电上的应用。
【背景技术】[0002]能源枯竭与有机废弃物的处理是当前世界面临的两大难题，然而随着人类进步与发展，对能源的需求及全球变暖问题却日益严峻。为了解决这些问题，科学家们把目光投向了微生物，利用微生物产电，解决能量短缺问题；同时，利用微生物降解周围有机物以供能量维持生长的能力，来处理日益庞大的有机废弃物的问题。由此，微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell, MFC)的重要性日益显现。
[0003]MFC是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。在此系统中，产电微生物是核心要素。但是由于绝大多数微生物的细胞外包裹的一层油脂性膜是非导电性材料，尤其是革兰氏阳性菌，细胞膜中富含肽聚糖等一些绝缘性物质，从而严重阻碍了微生物与电极之间的电子交换，减小了 MFC的效率。所以，当使用微生物作为催化剂时，要使用适当的电子传递介质以促进微生物与电极之间的电子交换。理论上，电子传递介质的氧化态和还原态均有很强的亲脂性，自由的透过细胞膜。
[0004]微生物产电能力相差很大，产电微生物决定着MFC的功能及应用，目前已发现的产电微生物主要集中在希瓦氏菌属(Shewanella)和地杆菌属(Geobacter) (EnergyEnviron.Sc1., 2011, 4, 4366 - 4379)等一些革兰氏阴性菌，随着对产电微生物的研究，近来韩国 HyungSoo Park 等分离出一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum EG3)(Anaerobe (2001) 7，297 - 306)在缺乏电子介体时利用IOmM葡萄糖产电220mV。SophiePeguin 等人(Biotechnology and Bioengineering, Vol.51, Pp.342-348 (1996))利用三电极系统报道了丙酮丁醇梭菌在有甲基紫精参与的情况下的MFC。Juliane Niessen等人(Electrochemistry Communications6 (2004) 955 - 958)对丁酸梭菌进行 MFC 产电，利用10g/L葡萄糖作为燃料得到最大输出电压473mV，然而关于拜氏梭菌进行详细MFC产电的报道甚少。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一株经过ARTP等离子体诱变得到的具有高活性产电能力的拜氏梭菌。
[0006]本发明还要解决的技术问题是提供上述拜氏梭菌在微生物燃料电池产电方面的应用。
[0007]为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下:
[0008]一株高产电的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii ),菌株号M13，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013424，保藏日期为2013年9月14日。[0009]本发明的拜氏梭菌Clostridium bei jerinckiiM13的筛选方法,将拜氏梭菌出发菌株NCMB8052 (购于美国菌种保藏中心(ATCC))经等离子体诱变后，利用WO3显色技术筛选得到能够产电的菌株，再经过双室MFC进行筛选高产电能的菌株。
[0010]其具体步骤如下:
[0011](I)等离子体诱变:将拜氏梭菌原始菌株8052活化培养，培养温度33~37°C，25mL的肖特厌氧瓶装液量为10~15mL，培养时间12~18h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD6tltl=0.1~1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以80~120W作为射频功率，以10~30SLM作为气体流量，以10~1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变。
[0012](2)三明治式培养技术初筛选:将诱变后的菌株分别在固体培养基中培养16~24h，37°C培养，长出菌落后，再涂布25mL无菌的WO3琼脂悬浮液，37°C培养，培养时间24~36h，观察颜色变化，挑取蓝色部分菌落，种子培养，保存。
[0013](3) 96孔平板显色技术复筛选:将上述收集的菌株接种于种子培养基中，37°C恒温箱培养12h后,达到对数期菌液,在4000rpm下离心5min收集菌体,用无菌乳酸钠最小盐溶液悬浮，调细胞0D_=1.0备用。取IOOul含有乳酸钠最小盐溶液的备用菌液加入96孔平板中，再分别加入80ul无菌含WO3簇状物(5g/L)的乳酸钠最小盐溶液和0.10g/L甲基紫精，立即加入80ul凡士林确保无氧状态，放入30°C厌氧箱，0.5、l、3、5h观察颜色变化。
[0014](4)双室MFC技术筛选:将步骤(3)筛选出来的菌株接入种子液，培养温度37°C，厌氧培养时间12h。然后进行双室MFC技术，接种量10%(v/v)，培养温度30°C，产电检测时间48h ;考察步骤(3)筛选出的菌株的产电量，同时选出产电量最高的菌株。
[0015](5)在上述筛选方法中:步骤(1)中所述的等离子体诱变方法中，优选100W作为射频功率，10SLM作为气体流量，180s作为辐照时间。
[0016]在上述筛选方法中:步骤(2)所述的固体培养基，碳源为淀粉或者葡萄糖中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，甲基紫精，琼脂；无菌的WO3琼脂悬浮液包含WO3族状物、纳盐、琼脂、甲基紫精。
[0017]在上述筛选方法中:步骤(3)所述的种子液不加琼脂其他成分同上所述；乳酸钠最小盐溶液包含乳酸钠、钠盐、钾盐、磷酸盐、羟乙基哌嗪乙磺酸及微量无机盐化合物，分别为NTA、镁盐、锰盐。钠盐、亚铁盐、钙盐、钴盐、锌盐、铜盐、铝盐、镍盐、钨化物、硼酸的一种或多种，WO3簇状物的乳酸钠最小盐溶液，为乳酸钠最小盐溶液中添加WO3簇状物。
[0018]在上述筛选方法中:步骤(4)所述双室MFC装置中，阳极液为种子培养基及甲基紫精作为电子介体，碳源为葡萄糖，氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。阴极液为钾盐、磷酸盐、铁氰化合物。
[0019]其中，所述的双室MFC技术产电方法包含如下步骤:
[0020](I)菌株活化:将拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiM13接种到种子培养基中，培养温度33~37°C，培养时间12~18h ；
[0021](2)装置搭建:安置阳极室的阳极，安置阴极室的阴极，安置介于阳极隔室和阴极隔室之间用于分隔阳极室和阴极室的质子交换膜，进行灭菌处理；[0022](3)MFC技术:向阳极室中加入阳极液及甲基紫精，通入N23min以上，接入拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M13,接种量10v/v%,再通入N23min以上，迅速密封阳极室，向阴极室加入阴极液，迅速密封阴极室，至于30°C恒温箱，进行电压数据采集器采集数据，采集时间48h。
[0023]所述的种子培养基包含碳源为淀粉或者葡萄糖中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。
[0024]所述的阳极和阴极均为PAN基石墨软毡(5X5cm)，以钛丝作为外接电路，外接电阻为1000 Ω，质子交换膜为杜邦NafionNl 17。
[0025]所述的阳极液为种子培养基，包含碳源为淀粉或者葡萄糖中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。阴极液为磷酸盐、钾盐及铁氰化物。
[0026]对突变株Clostridium bei jerinckii M13进行30g/L葡萄糖发酵培养基ABE发酵，得到结果如表1所示:
[0027]表1
【权利要求】
1.一株高产电的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii ),菌株号M13，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013424，保藏日期为2013年9月14日。
2.权利要求1所述的拜氏梭菌在产电中的应用。
3.权利要求1所述的拜氏梭菌作为微生物燃料电池在产电中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，拜氏梭菌作为微生物燃料电池进行产电的方法，包括如下步骤: (1)构建微生物燃料电池:将含有燃料的阳极液及甲基紫精加入到阳极室中，以高产电拜氏梭菌CCTCC NO:M2013424菌体作为阳极室接种物，再向阳极室通入氮气除去溶解氧；将阴极液加入到阴极室中； (2)利用微生物燃料电池产电:将微生物燃料电池放入28~30°C的温室中静置培养，进行产电。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的含有燃料的阳极液为以葡萄糖和/或淀粉为碳源的种子培养基。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤(1)中，甲基紫精占阳极液的浓度为0.13 ~0.15g/L。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的高产电拜氏梭菌CCTCCNO:M2013424菌体预先经过如下方式活化:由28~30v/v%甘油水溶液冷冻保藏的菌种接种于淀粉种子培养基中，充氮气3min，于33~37°C恒温箱活化菌体12~18h，达到指数生长期，停止活化。
8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤(1)中，高产电拜氏梭菌CCTCCNO:M2013424菌体作为阳极室接种物，接种量为10v/v%。
9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的阴极液为38~40mM铁氰化钾的水溶液。
10.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤(1)中，高产电拜氏梭菌CCTCCNO:M2013424菌体接种前阳极室通入氮气3min以上，接种后阳极室通入氮气3min以上，迅速封闭阳极室。
【文档编号】C12N1/20GK103898031SQ201410161604
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】应汉杰, 刘俊, 郭亭, 王冬, 华莹, 谢婧婧, 陈勇, 吴菁兰, 陈晓春, 朱晨杰, 庄伟
申请人:南京工业大学