一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法

一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种腺苷蛋氨酸的合成方法，所述方法为：将腺苷蛋氨酸工程菌经发酵培养获得的发酵液过滤，取湿菌体在60～65℃干燥2～3h进行活化处理，获得的活化菌体加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸盐、硫酸盐、蛋氨酸和水构成反应体系，在33～37℃条件下进行转化反应，反应结束，获得的反应液即为含腺苷蛋氨酸的混合液；本发明构建了SAM工程菌，使用该菌种可以在已有腺嘌呤合成ATP反应液中添加蛋氨酸，从而省去了SAM合成酶的菌种培养、SAM合成酶的提取以及在反应中添加SAM合成酶等操作，使生产更为简便；腺嘌呤等原料都可以从市场大量较低价购得，利用本发明方法可以高效、大规模合成SAM。
【专利说明】一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法
(—)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种腺苷蛋氨酸的合成方法，特别涉及利益工程菌进行生物合成腺苷蛋氨酸的合成方法。
(二)【背景技术】
[0002]S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)又名S-腺苷甲硫氨酸,在生物体内主要起着转甲基、转硫和转氨丙基的作用，参与众多重要的生化反应，从而具有多种治疗作用，对抑郁症、关节炎、肝胆疾病、胰腺炎等均有较好疗效。在欧洲一直将其作为忧郁症和关节炎的处方治疗药物。从1999年美国FDA批准其作为食品营养补充剂上市到现在，SAM的功效已经逐渐为大众了解。由于生产技术水平所限，目前SAM的价格还比较昂贵，因此研究开发低成本的SAM生产技术仍然具有现实意义。
[0003]由于SAM结构复杂，化学合成法原料价格昂贵、合成困难，因此国内外的合成研究和实际生产都集中在生物合成方法。生物合成SAM主要有两类方法:一类是采用添加蛋氨酸的发酵法；另一种是采用腺苷、腺苷三磷酸(ATP)等和蛋氨酸两种前体物的转化合成法。
[0004]在转化合成法中，发明专利CN1217002C(2005.08.31)、CN101285085B(2011.04.27)等公开了一种采用克隆了 SAM合成酶的大肠杆菌工程菌，将ATP和蛋氨酸两种前体物转化合成SAM的方法；发明专利CN100363499C(2008.01.23)公开了一种采用ATP合成菌种，以腺苷合成分泌ATP，并添加蛋氨酸和SAM合成酶，偶联转化合成SAM的方法。
[0005]米用腺嘌呤合成ATP已经有许多报道(Akihiko Maruyama and Tatsuro Fujl0.Biosc1.Biotechnol.Biochem.2001，65(3):644-650)，腺嘌呤比 ATP 和腺苷的相对分子量都小，采用腺嘌呤合成SAM，在相同分子转化率情况下，相同重量的腺嘌呤可以产生较多SAM，而且腺嘌呤的价格也较低，因此采用腺嘌呤合成ATP进而合成SAM，有望进一步降低SAM生产成本。
(三)
【发明内容】

[0006]本发明目的是提供一种利用ATP合成菌种构建的SAM工程菌，以腺嘌呤和蛋氨酸等原料转化合成腺苷蛋氨酸的方法，使该工程菌用腺嘌呤大量合成ATP的同时，高效转化合成分泌腺苷蛋氨酸的方法。
[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]本发明提供一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法，所述方法为:将SAM工程菌经发酵培养获得的发酵液过滤，取湿菌体在60-65°C干燥2-3h进行活化处理，获得活化菌体，活化菌体加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸盐、硫酸盐、蛋氨酸和水构成反应体系，在33~37°C条件下进行转化反应，反应结束后，获得的反应液即为含腺苷蛋氨酸的混合液；所述反应体系中活化菌体的用量为70~100g/L(即终浓度)，腺嘌呤的用量为2~4g/L(终浓度)、葡萄糖的用量为80~100g/L(终浓度)，磷酸盐的用量为70~90g/L(终浓度)，硫酸盐的用量为3~5g/L (终浓度)，蛋氨酸的用量为3~5g/L (终浓度)；
[0009]所述SAM工程菌是指将酿酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)的SAM合成酶基因2 (sam2)克隆至雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) ZGBl中，构建的腺苷蛋氨酸工程菌，即SAM工程菌。具体，本发明采用SAM工程菌是选用能够大量合成ATP菌种为SAM工程菌的出发菌株，具体选用从腺嘌呤大量合成分泌ATP的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGBl (详见专利CN102154117A)为出发菌株；再选用SAM合成酶基因，具体选用基因数据库GeneBank所公布的酿酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)来源的SAM合成酶基因2(sam2,登陆号M23368)，依其序列设计引物，通过PCR扩增得到sam2 ;然后将sam2装配入重组质粒pCB1004-PgpdA (详见专利CN1285721C)，得到由强启动子PgpdA驱动的sam2基因的重组表达质粒pCB1004-PgpdA-sam2，将pCB1004-PgpdA-sam2线性化，转化上述雅致放射毛霉ZGBl菌株，筛选验证得到SAM工程菌。
[0010]进一步，优选所述磷酸盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。
[0011]进一步，优选所述硫酸盐为硫酸镁。
[0012]进一步，优选所述反应体系中活化菌体的用量为80~90g/L(终浓度)，腺嘌呤的用量为3~3.5g/L (终浓度)、葡萄糖的用量为80~90g/L (终浓度)，磷酸盐的用量为70~80g/L(终浓度)，硫酸盐的用量为3.5~4.0g/L(终浓度)，蛋氨酸的用量为4.0~4.5g/1(终浓度)。
[0013]进一步，优选所述湿菌体在60~65°C干燥2~2.5h活化处理。
[0014]本发明反应结束后，SAM产量测定采用高效液相色谱法(HPLC)进行，具体条件:Inertsil 0DS-SP 柱(5 μ m，4.6X 250mm)，流动相 15% 甲醇-85%缓冲液(含 0.6% 乙酸铵、
0.01 %辛烷磺酸钠的水溶液)，用甲酸调至PH3.0，流速0.5mL/min,检测波长254nm。
[0015]SAM合成酶基因2(sam2，登陆号M23368)序列为SEQ ID N0.1所示。
[0016]本发明的有益效果主要体现在:
[0017]1、本发明选用能够从腺嘌呤大量合成分泌ATP的菌株为出发菌株，构建SAM工程菌，使所构建的SAM工程菌能够从分子量较小、价格较低的腺嘌呤大量合成ATP进而合成SAM,以降低SAM合成成本；并且选用的出发菌株为毛霉菌，菌丝体培养和分离操作简便，有利于转化合成反应与产物分离操作；
[0018]2、本发明构建了上述SAM工程菌，使用该菌种可以在已有腺嘌呤合成ATP反应液中添加蛋氨酸,参照已有合成ATP技术直接大量合成分泌SAM，不用外加SAM合成酶，从而省去了 SAM合成酶的菌种培养、SAM合成酶的提取以及在反应中添加SAM合成酶等操作，使生产更为简便。
[0019]3、腺嘌呤等原料都可以从市场大量较低价购得，利用本发明方法可以高效、大规模合成SAM。
(四)【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1为重组质粒pCB1004-PgpdA_sam2的构建示意图。
(五)【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0022]实施例1工程菌的构建
[0023]本发明采用的含有酿酒酵母SAM合成酶基因2(sam2)的SAM工程菌的具体构建方法如下(雅致放射毛霉原生质体制备，目的基因的克隆、酶切验证、重组质粒构建及转化、原生质体再生及转化子筛选的具体条件和方法，详见论文《ATP合成关键酶基因APTl在雅致放射毛霉中的克隆表达》(朱家荣、杨善岩、陈丽芬等.食品与发酵工业，2012，38(6)，43-47.):
[0024]1、实验材料
[0025]雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)ZGBl已在专利 CN102154117A 中公开。
[0026]E.coli DH5 α购于生工生物工程(上海)有限公司；
[0027]酿酒酵母1964(Saccharomyces cerevisiael964)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；
[0028]质粒pCB1004_PgpdA (详见专利 CN1285721C)；
[0029]pMD19_T simple vector 购于 Takara 公司。
[0030]蜗牛酶(BR)、纤维素酶(BR)购自国药集团化学试剂有限公司；BamH I,Kpn I等限制酶及所有分子试剂均购自TaKaRa公司；孟加拉红购于生工生物工程(上海)有限公司；潮霉素B购于上海宝曼生物科技有限公司；其他常用试剂为国产生化或分析纯试剂。
[0031]LB培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，NaCllO,(琼脂20)，溶剂为水，ρΗ7.0 ；
[0032]高渗缓冲液(mol/L):山梨醇1.0, Tris0.01，ρΗ7.0 ；
[0033]转化缓冲液(mol/L):山梨醇1.0, Tris0.01，CaCL225, ρΗ7.0 ；
[0034]种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏5，NaC15，溶剂为水，ρΗ6.0~6.2,(固体培养加20g/L琼脂)；
[0035]菌体培养基(g/L):葡萄糖40，酵母膏3，玉米浆10，NH4Cl3, MgSO4.7H201，FeSO4.7Η200.2，K2HPO4.3Η203，溶剂为水，ρΗ6.0 ~6.5 ;
[0036]再生培养基:以高渗缓冲液配制的种子培养基。
[0037]2、实验方法
[0038]2.1目的基因sam2的获得
[0039]重组质粒pCB1004_PgpdA在Not I/BamH I位点已连接构巢曲霉(Aspergillusnidutans)甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的强启动子PgpdA，可将目的基因克隆至该启动子下游，强化目的基因的表达。此外，该质粒上含有潮霉素和氯霉素抗性基因，可用于阳性转化子的抗性筛选。
[0040]选用GeneBank所公布的酿酒酵母(Saceharomucescerevisiae)来源的SAM合成酶基因2 (sam2,登陆号M23368)，依其序列和pCB1004_PgpdA的PgpdA下游BamH I/Kpn I酶切位点设计引物:
[0041]sam-F5，~CGCGGATCCATGTCCAAGAGCAA~3，(BamH I)，
[0042]sam-R5，~CGGGGTACCTTAAAATTCCAATTTC~3，(Kpn I)
[0043]氯化苄法(参见:钟铃，汪天虹.氯化苄提取染色体DNA.微生物学杂志，1997(3):62-63.)提取酿酒酵母总DNA，PCR扩增sam2基因(见表1、表2，sam2基因片段回收、纯化采用生工生物工程(上海)有限公司胶回收试剂盒)，T/A克隆至pMD19-T simplevector (见表3)，转化E.coli DH5 α (利用Takara公司的感受态细胞制备试剂盒制备DH5 α感受态细胞，42°C水浴90s热击转化)，转化细胞涂布含x_gal40 μ g/ml与IPTG40 μ g/ml的氨苄青霉素100 μ g/ml的LB培养基平板，37°C培养12_16h (蓝白斑试验)，挑出白斑转化子，转化子SDS碱裂解法(杨献光；齐志广；赵宝存等.碱裂解法提取质粒DNA的研究[J].生物技术通报2003 (6): 24-26)提取质粒，BamH I/Kpn I双酶切(见表4)，I %琼脂糖凝胶电泳验证后，由生工生物工程(上海)有限公司完成测序，其序列与GeneBank所公布sam2序列完全相同，双酶切回收sam2基因片段即获得目的基因sam2。
[0044]表1PCR 体系
[0045]
【权利要求】
1.一种腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述方法为:将腺苷蛋氨酸工程菌经发酵培养获得的发酵液过滤，取湿菌体在60~65°C干燥2~3h进行活化处理，获得的活化菌体加入腺嘌呤、葡萄糖、磷酸盐、硫酸盐、蛋氨酸和水构成反应体系，在33~37°C条件下进行转化反应，反应结束，获得的反应液即为含腺苷蛋氨酸的混合液；所述反应体系中活化菌体的用量为70~100g/L，腺嘌呤的用量为2~4g/L、葡萄糖的用量为80~100g/L，磷酸盐的用量为70~90g/L，硫酸盐的用量为3~5g/L，蛋氨酸的用量为3~5g/L ； 所述腺苷蛋氨酸工程菌是指将来源于酿酒酵母(Saceharomuces cerevisiae)的SAM合成酶基因2克隆至雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)ZGBl中，构建的腺苷蛋氨酸工程菌；所述来源于酿酒酵母的SAM合成酶基因2在GeneBank的基因登陆号为M23368。
2.如权利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述磷酸盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。
3.如权利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述硫酸盐为硫酸镁。
4.如权利要求1所述腺苷蛋氨酸的合成方法，其特征在于所述反应体系中活化菌体的用量为80~90g/L，腺嘌呤的用量为3~3.5g/L、葡萄糖的用量为80~90g/L，磷酸盐的用量为70~80g/L，硫酸盐的用量为3.5~4g/L，蛋氨酸的用量为4~4.5g/L。
【文档编号】C12R1/645GK103993055SQ201410163487
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】朱家荣, 郑计瑞, 陈丽芬, 杨善岩 申请人:浙江工业大学