结核分枝杆菌的固态药敏试验标本的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种结核分枝杆菌的固态药敏试验标本，包括以下步骤制得：对提供的标本进行前处理，制成浓集标本；向浓集标本中加入液体增菌培养基，制成液态增菌培养标本，增菌培养0～7天；将固体培养基加温熔化，制成液态的固体培养基，然后将其温度降至与上述液态增菌培养标本相应的培养温度；所述的固体培养基具有50℃～95℃的熔化温度，25℃～45℃的凝固温度；所述的固体培养基包括有琼脂或琼脂糖，以及营养物质；将液态增菌培养标本与液态的固体培养基混合，制成液态药敏试验标本；将液态药敏试验标本凝固，制成带有药敏纸片的固态药敏试验标本；将固态药敏试验标本培养5～15天，即可，本发明能缩短结核分枝杆菌药敏试验的时间。
【专利说明】结核分枝杆菌的固态药敏试验标本
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对结核分枝杆菌的耐药性进行试验的医学检验领域，具体为一种结核 分枝杆菌的固态药敏试验标本。
【背景技术】
[0002] 结核病的耐药性是一个日益严重的公共卫生问题，严重威胁着结核病的控制。中 国工程院院士钟南山在两会期间曾称，中国其有450万活动性结核病人，带菌者高达5. 5 亿，而带菌者一生中有10 %的可能性会发病。2009年4月，中国卫生部部长陈竺在北京举行 的"耐多药/广泛耐药结核病高负担国家"部长级会议上通报了中国耐药结核病的情况：中 国疾病防控中心的抽样调查显示，中国结核病人中，耐多药发病率为8. 32%，总计约为12 万人，居世界第二位，广泛耐药发病率为0. 68%，总计大约1万人，其危害远远超过艾滋病。 药敏试验是对结核分枝杆菌的耐药性进行检测的重要试验。现有的结核分枝杆菌药敏试验 方法，一般有纸片检验法和浓度检验法。纸片检验法是通过观察由于贴在固体培养基表面 上药物纸片形成的药物抑菌圈来确定结核分枝杆菌对药物的敏感性；浓度检验法是通过观 察检测不同药物和不同药物浓度试验容器中结核分枝杆菌的生长情况来确定结核分枝杆 菌对药物的敏感性。不管是纸片检验法还是浓度检验法，其整个药敏试验过程一般可分为 标本前处理、增殖或分离培养和药敏检验三个阶段。现有的纸片检验法，标本前处理阶段的 步骤为：①用吸管吸取提供的标本置于试验容器中；②向试验容器中加入消化液，对标本 粘液进行消化，使标本中粘液和杂质包裹的细菌充分暴露；③离心分离，倒掉上清液，获得 浓集的标本；在获得浓集的标本后再进行增殖或分离培养。增殖或分离培养阶段的步骤为： ④取已经浓集的标本少部分制成浓菌液；⑤将浓菌液接种于固体培养基例如罗氏培养基上 进行增殖或分离培养，一般需在37°C培养箱中培养1月左右，把单个细菌培养成细菌菌落； 在获得细菌菌落后再进入药敏检验阶段。药敏检验阶段的步骤为：⑥取少量的细菌菌落，一 般是取1 一一 3个细菌菌落，将其溶解分散制成浓菌液；⑦将浓菌液接种于固体培养基例如 琼脂培养基表面上；⑧在固体培养基表面上贴上药物纸片；⑨放入37°C培养箱中培养1个 月左右，观察药物抑菌圈，确定结核分枝杆菌对药物的敏感性。现有的纸片检验法的优点是 操作方便、设备简单、投资小；但其存在以下缺点：⑴整个检验所需的时间太长：增殖或分 离培养阶段需要1个月左右，药敏检验阶段大约需要1个月左右，整个试验过程大约需要2 个月左右。⑵不安全。整个试验需要两次人工接种，由于结核分枝杆菌具有传染性，这样对 操作人员形成安全隐患，对环境形成污染隐患。
[0003] 现有的浓度检验法，其在增殖培养阶段采用固体培养基，其标本前处理、增殖或分 离培养二个阶段的步骤与现有的纸片检验法相同，但药敏检验阶段的步骤与现有的纸片检 验法不同，具体为：从固体培养基上取增殖或分离培养获得的细菌菌落，一般是取1个或数 个细菌菌落，一一将其溶解分散制成菌悬液一一将菌悬液倒入按不同的药物和不同的浓度 配制成的多个试验容器中，制成对比试验标本一一观察检测试验容器中细菌生长情况，确 定结核分枝杆菌对药物的敏感性。这种检验方法的优点是设备简单、投资小；但其存在以下 缺点：⑴所需的时间长。增殖或分离培养阶段的方法和步骤与现有的纸片检验法的方法和 步骤相同，因此，仅增殖或分离培养阶段所需的时间就需要1个月左右；⑵操作麻烦、不安 全且容易造成错误的检验结果。由于需要配制多个试验容器，配制过程很麻烦且不安全，对 操作人员形成安全隐患，对环境也形成污染隐患；在配制多个试验容器过程中比较容易被 其他细菌污染，这样就可能造成错误的检验结果。
[0004] 此外，还有利用仪器鉴定药物敏感性的方法，例如BACTEC - ΤΒ460系统及BACTEC 960系统，其优点是操作简单，试验过程时间短，平均检出时间为14. 4天，最快10天左右。 但其存在的主要缺点是仪器设备的价位高，投资大；使用成本高，一是仪器设备的使用成本 高，二是需要多个对比试验标本，试剂的成本较高，其费用较大，一般医院难以承受，难以推 广普及。
[0005] 从上面详细分析现有的结核分枝杆菌药敏试验方法可以看出，现有的纸片检验法 和浓度检验法存在以下缺点：（1)整个检验过程所需的时间长。（2)操作麻烦。（3)不安全。 (4)容易出现误检。而利用仪器鉴定药物敏感性的方法投资大，使用成本高，难以推广普及。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种能缩短结核分枝杆菌药敏试验过程时间的结核分枝杆 菌的固态药敏试验标本；另一个目的是投资少、使用成本低；再一个目的是使用安全方便。
[0007] 为实现上述目的，本发明结核分枝杆菌的固态药敏试验标本，包括以下步骤制得 (1) 对提供的标本进行前处理，制成浓集标本； (2) 向浓集标本中加入液体增菌培养基，制成液态增菌培养标本，增菌培养0?7天； (3) 将固体培养基加温熔化，制成液态的固体培养基，然后将其温度降至与上述液态增 菌培养标本相应的培养温度； 所述的固体培养基具有50°C?95°C的熔化温度，25°C?45°C的凝固温度； 所述的固体培养基包括有琼脂或琼脂糖，以及营养物质； (4) 将液态增菌培养标本与液态的固体培养基混合，制成液态药敏试验标本； (5) 将液态药敏试验标本凝固，制成带有药敏纸片的固态药敏试验标本； (6) 将固态药敏试验标本培养5?15天，即可。
[0008] 所述的固态药敏试验标本，其固体培养基每一份固体培养基含有卵黄液50ml- 100ml，可溶性淀粉2g -8g, L一酪蛋白0. lg -0. 8g,酚红2ml-8ml,琼脂或琼脂糖0. 5g- 3. 5g，抑菌剂适量。
[0009] 所述的结核分枝杆菌的固态药敏试验标本，其固体培养基中加入尿素，尿素在每 一份固体培养基中的加入量为：〇. lg?〇. 5g。
[0010] 所述的结核分枝杆菌的固态药敏试验标本，在液态药敏试验标本中，固体培养基 与液体增菌培养基混合配比为：每l〇〇ml液体增菌培养基加一份固体培养基。
[0011] 利用本发明做结核分枝杆菌药敏试验，与现有的纸片检验法和浓度检验法相比， 整个试验过程时间短的原因是：①提供的标本中的待检结核分枝杆菌得到了充分利用。由 于提供的标本中的结核分枝杆菌被浓集后绝大部分用于制作液态增菌培养标本，而液态增 菌培养标本又全部被用于做固态药敏试验标本，因此，提供的标本中的待检结核分枝杆菌 得到了充分的利用。②增殖培养阶段的时间短。由于本发明的增菌培养是在液态增菌培 养基中进行，相对而言，细菌在液态增菌培养基中的增殖速度比在固体培养基上的增殖速 度快；再加上充分利用了提供标本中的待检结核分枝杆菌，使增殖培养前的初始数量大，因 此，增殖培养阶段的时间短，最多只需7天。如果所提供的标本中的结核分以杆菌的数量很 大，在制作本发明固态药敏试验标本的过程中可以省略掉增殖培养。③形成抑菌圈的时间 短。采用本发明，是将增殖培养后的液态增菌培养标本与液态的固体培养基混合，采用倾注 法制成带药敏纸片的固态药敏试验标本，这样，增殖培养后的结核分枝杆菌全部都用于制 作本发明固态药敏试验标本，因此其起始菌量大，只需5到15天即可形成药物抑菌圈，比现 有的纸片检验法所需的时间短。④使用了指示剂。由于本发明在固体培养基中加入尿素， 结核分枝杆菌会产生尿素酶分解尿素，使固态药检试验标本呈粉红色或淡黄色，通过观察 固态药敏试验标本的颜色，可以初步判断固态药敏试验标本中结核分枝杆菌生长情况，在 固态药敏试验标本呈粉红色或淡黄色后，说明固态药敏试验标本中的结核分枝杆菌数量达 到了形成抑菌圈需要的数量，同时由于粉红色或淡黄色的指示形成明显的抑菌圈，这样就 可以缩短形成明显抑菌圈的时间。综上所述，与现有的纸片检验法和浓度检验法相比，利用 本发明进行结核分枝杆菌药敏试验实现了缩短试验过程时间的目的。
[0012] 利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试验投资少、使用成本低的原因是：利用本发 明进行结核分枝杆菌药敏试验所需的设备只需配套离心装置、培养箱、加热恒温机等。上述 离心装置、培养箱、加热恒温机等制造简单、生产成本低，因此，完成整个试验所需要的设备 投资少；利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试验需要配套使用一次性试验容器以及包括培 养基、指示剂等试剂，这些一次性试验容器和试剂的成本低且使用的数量少，加上本发明仪 器设备的投资少使用成本低，进一步减少了利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试验的使用 成本。因此，与利用仪器鉴定药物敏感性的方法相比，利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试 验有效地实现了投资少、使用成本低的目的。
[0013] 利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试验使用安全方便的原因是：利用本发明进行 结核分枝杆菌药敏试验过程的浓集待检标本、结果伴读均可以在一次性密闭容器内进行， 不会污染其他器材，操作完成后进行统一消毒处理，并且整个检验过程手工操作的程序很 少且简单，这样就减少了结核分枝杆菌对工作人员和环境的影响，大大地提高了试验的生 物安全性；减少了被其他细菌的污染，有效地减少了出现错误的检验结果。因此，与现有的 纸片检验法和浓度检验法相比，利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试验能有效地实现使用 安全方便的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明 图1所示为利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试验的加热恒温机俯视图示意图。
[0015] 图2为图1所示加热恒温机的A- A剖视图示意图。
[0016] 图3所示为利用本发明进行结核分枝杆菌药敏试验的培养盒去掉盒盖后的俯视 图不意图。
[0017] 图4为图3所示培养盒的剖视图示意图。
[0018] 1、机壳，2、倒板卡槽，3、混合杯卡孔，4、导热块，5、隔热墙，6、高温杯卡孔，7、控制 面板，8、恒温杯卡孔，9、电加热装置，10、盒体，11、药敏纸片，12、标尺，13、盒盖。
【具体实施方式】
[0019] 图1、图2所示为加热恒温机，在机壳1上安装有导热块4,导热块4分为高温区和 恒温区，高温区的温度为在50°C - 95°C范围内可调；其中最佳温度为90°C，恒温区的温度 为在25°C-45°C范围内可调，其中最佳温度为42°C ;在高温区中设有高温杯卡孔6和控制 面板7,在恒温区中设有恒温平衡区和混合区，在恒温平衡区中设有恒温杯卡孔8,在混合 区中设有混合杯卡孔3和倒板卡槽2,在高温区和恒温区之间设有隔热墙5,在导热块4中 设有电加热装置9,在机壳1中设有温度控制装置。
[0020] 图3、图4所示为培养盒，盒体10为周壁和底部封闭、上端敞开的结构形式，在盒体 10的底部设有标尺12,在盒体10底部的上侧面上贴有药敏纸片11，在盒体10的敞开端配 套有盒盖13。
[0021] 下面给出本发明的实施例： 本实施例的培养盒，在盒体10底部的上侧面上贴有六片药敏纸片11，盒体10的容积为 30 ml。
[0022] 1、将标本痰5ml用2%氢氧化钠和0. 5%NALC混合液消化； 2、 置于尚心机中，以4500转/分钟的转速尚心分尚10分钟，将标本中结核分枝杆菌充 分沉淀； 3、 去掉上清液，制成浓集标本，完成标本的前处理； 4、 用10ml液体增菌培养基将浓集标本洗脱制成液体菌悬液形式的液态增菌培养标 本； 5、 将液态增菌培养标本放入37°C的培养箱中增菌培养，具体培养时间视标本痰中的含 菌量定； 6、 制作液态结核分枝杆菌药检试验标本： (1) 将加热恒温机中的高温区温度设定为90°C，恒温区温度设定为42°C ; (2) 将固体培养基放入加热恒温机高温区中的高温杯卡孔6中加热熔化至液态；液态 增菌培养标本与液态的固体培养基混合后的体积为30ml ;固体培养基的物理性能为：在温 度上升到90°C时，固体培养基从固态熔化为液态；而当温度下降时到40°C后，又从液态凝 固成固态； (3) 将液态的固体培养基放入加热恒温机恒温区中的恒温杯卡孔8中降温，使液态的 固体培养基的温度降至42°C，此时，固体培养基仍呈液态； (4) 将增菌培养后的液态增菌培养标本放入加热恒温机恒温区中的恒温平衡区中的恒 温杯卡孔8中，使其温度上升到42°C。
[0023] (5)将温度为42°C的液态固体培养基和温度为42°C的液态增菌培养标本倒入混 合杯中混合，制成液态药敏试验标本。为了确保混合期间固体培养基呈液态，混合杯应放入 加热恒温机恒温区中的混合杯卡孔3中进行混合； 7、 制作固态药检试验标本： (1) 将去掉盒盖13后的盒体10放入加热恒温机恒温区中的倒板卡槽2中，使其温度上 升到42°C。； (2) 将液态药敏试验标本倒入盒体10中； (3)盖上盒盖13,取出培养盒，放在常温下使液态药敏试验标本凝固，制成固态药检试 验标本； 8、将固态药敏试验标本放入37 °C的培养箱中培养，观察固态药敏试验标本的颜色和抑 菌圈，根据抑菌圈大小判断药物对细菌的作用效果。
[0024] 本实施例中的液体增菌培养基采用7H9。
[0025] 本实施例中的固体培养基与液体增菌培养基混合配比比例为：每100ml7H9加一 份固体培养基。每一份固体培养基含卵黄液75 ml，可溶性淀粉4 .6g，L一铬蛋白0.25g， 酚红4ml，琼脂糖1. 25g，尿素 0. 2g，抑菌剂孔雀绿适量。
[0026] 本实施例中的指示剂的还可以选用亚碲酸钠。
[0027] 本发明固体培养基中的琼脂的糖的作用是使药敏试验时的培养基凝固，还可以用 琼脂。
[0028] 本发明中的固体培养基的物理性能为：在常温下为固态；当温度上升直到低于熔 化温度前仍为固态，当温度上升到高于熔化温度后，才熔化成液态；当温度下降直到高于熔 化温度前仍为液态，当温度下降到低于凝固温度后，才凝固为固态。
[0029] 本发明中的固体培养基的熔化温度的选择标准为：①当固体培养基的温度上升达 到熔化温度时，其中的营养成份不被破坏；②当固态药敏试验标本放入37°C的培养箱中培 养时，药敏试验标本仍呈固态；③方便操作。根此，本发明中的固体培养基的熔化温度选择 为 50°C-95°C。
[0030] 本发明中的固体培养基的凝固温度的选择标准为：①当固体培养基的温度下降达 到凝固温度前，结核分枝杆菌与其混合时，其温度应为结核分枝杆菌能够存活的温度；②能 较快达到37°C的结核分枝杆菌培养温度；③方便操作。根此，本发明中的固体培养基的凝 固温度选择为25°C - 45°C。如果凝固温度太低就可能低于室温，特别在天气较热的时候， 需要放入冷藏设备中才能凝固，不方便操作；同时，距37°C的结核分枝杆菌培养温度相距 较大，不便于尽快达到结核分枝杆菌培养温度。如果凝固温度太高，不利于结核分枝杆菌的 存活。
【权利要求】
1. 一种结核分枝杆菌的固态药敏试验标本，其特征在于，包括以下步骤制得 (1) 对提供的标本进行前处理，制成浓集标本； (2) 向浓集标本中加入液体增菌培养基，制成液态增菌培养标本，增菌培养0?7天； (3) 将固体培养基加温熔化，制成液态的固体培养基，然后将其温度降至与上述液态增 菌培养标本相应的培养温度； 所述的固体培养基具有50°C?95°C的熔化温度，25°C?45°C的凝固温度； 所述的固体培养基包括有琼脂或琼脂糖，以及营养物质； (4) 将液态增菌培养标本与液态的固体培养基混合，制成液态药敏试验标本； (5) 将液态药敏试验标本凝固，制成带有药敏纸片的固态药敏试验标本； (6) 将固态药敏试验标本培养5?15天，即可。
2. 根据权利要求1所述的固态药敏试验标本，其特征在于，固体培养基每一份固体培 养基含有卵黄液50ml - 100ml，可溶性淀粉2g - 8g，L一酪蛋白0. lg - 0.8g，酚红2ml- 8ml，琼脂或琼脂糖0. 5g - 3. 5g，抑菌剂适量。
3. 根据权利要求2所述的固态药敏试验标本，其特征在于，固体培养基中加入尿素，尿 素在每一份固体培养基中的加入量为：0. lg?0. 5g。
4. 权利要求1-3任一项所述的固态药敏试验标本，其特征在于，在液态药敏试验标本 中，固体培养基与液体增菌培养基混合配比为：每l〇〇ml液体增菌培养基加一份固体培养 基。
【文档编号】C12Q1/02GK104195212SQ201410304254
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2010年8月23日 优先权日:2010年6月2日
【发明者】彭钧 申请人:湖南省天骑医学新技术有限公司