黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法
【专利摘要】一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法，包括以下步骤：（1）黑曲霉经过逐级扩大培养，获得成熟的孢子；（2）孢子液接种至种子培养基，培养成为成熟的种子液；（3）成熟的种子液转接至发酵培养基F1；（4）发酵培养后，分割发酵液为两部分；其中一部分发酵液继续发酵完毕，获得柠檬酸；（5）分割出的另一部分发酵液经分散器分散处理，获得分散菌丝的发酵液；（6）将分散菌丝发酵液接入发酵培养基F2；发酵培养后，回到步骤（4），如此重复实现连续发酵。本发明显著降低生产成本与运行成本，显著缩短生产周期，提高生产效率；同时提高设备利用率，降低劳动强度，过程简便易操作，可以广泛应用于柠檬酸的生产。
【专利说明】黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及发酵工程【技术领域】，尤其是涉及一种采用黑曲霉连续发酵生产柠檬酸 的工艺。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸具有无毒、无臭、溶解性高、螯合力强的特性，广泛应用于食品、医药、化工 等领域。随着世界经济的发展和人民生活水平的提高，柠檬酸市场需求也在快速增长，每年 以：Γ5%的速度增长。
[0003] 全球80%的柠檬酸产量是黑曲霉通过深层发酵法得到的，普遍采用分批发酵方 式。但分批发酵方式存在非生产周期长，设备利用率低，生产效率低等缺点，已成为柠檬酸 产业发展的技术瓶颈。连续发酵工艺无疑是解决此问题的良好途径。
[0004] 然而，柠檬酸连续发酵生产过程比较困难，由于柠檬酸合成是部分生长偶联型，且 黑曲霉特殊的菌丝结构，不利于连续过程的形成。国内外关于柠檬酸连续发酵或半连续发 酵相关文献集中在酵母菌，但是发酵过程会产生大量的异柠檬酸（59Γ10%)，造成柠檬酸分 离纯化困难，此缺陷严重限制了酵母菌的推广应用。
[0005] 黑曲霉具有酶系丰富、底物广泛，产率高等优势，实现黑曲霉连续发酵工艺，是柠 檬酸发酵发展的重要方向，也是提高柠檬酸生产率的重要途径。因此，如何实现黑曲霉连续 发酵工艺，缩短生产周期，降低劳动强度，提高生产效率，是柠檬酸生产中亟待解决的一个 重要问题。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的上述问题，本 申请人:提供了一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸 的方法。本发明显著降低生产成本与运行成本，显著缩短生产周期，提高生产效率；同时提 高设备利用率，降低劳动强度，过程简便易操作，可以广泛应用于柠檬酸的生产。
[0007] 本发明的技术方案如下： 一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法，包括以下步骤： (1) 黑曲霉经过逐级扩大培养，获得成熟的孢子； (2) 孢子液接种至种子培养基，培养成为成熟的种子液； (3) 成熟的种子液转接至发酵培养基F1 ; (4) 发酵培养后，分割发酵液为两部分；其中一部分发酵液继续发酵完毕，获得柠檬 酸； (5) 分割出的另一部分发酵液经分散器分散处理，获得分散菌丝的发酵液； (6) 将分散菌丝发酵液接入发酵培养基F2 ;发酵培养后，回到步骤（4)，如此重复实现 连续发酵。
[0008] 步骤（4)中发酵培养16~48h。步骤（5)分割出的发酵液量彡总量的1/5。
[0009] 步骤（5)经过分散器分散处理的菌球或菌块平均直径< 200um。
[0010] 种子培养基种后总糖控制在8~12%，总氮0. 15~0. 4%。发酵培养基F1种后总糖控制 在14?16%，总氮为0. 05?0. 2%。发酵培养基F2种后总糖控制在14?16%，总氮为0. 1(Γ〇. 25%。 toon] 本黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的具体方法如下： (1) 步骤101、步骤102 :将培养成熟的黑曲霉孢子移种入种子培养基；移种后孢子液浓 度为3(Γ60万个/ml料液，种子培养基种后总糖为8~12%，总氮0. 15~0. 4% ; (2) 步骤103 :种子培养2(T36h，得到成熟的种子液； (3) 步骤104 :配制发酵培养基F1，种后总糖控制在14~16%，总氮为0. 05、. 2% ;将成熟 的种子液以1(Γ20% (v/v)的接种量转接入发酵培养基F1; (4) 步骤106 :成熟的种子液在发酵培养基F1中发酵培养16~48h ; (5) 步骤107、步骤108 :分割步骤106获得的发酵液，发酵液的分割量>总量的1/5,分 割出的发酵液经分散器处理，分散后的菌球直径< 200um ; (6) 步骤105 :第（5)步中分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原 糖浓度低于〇. 5%时，发酵结束，得到柠檬酸； (7) 步骤109 :配制发酵培养基F2,种后总糖控制在14?16%，总氮为0. 1(Γ〇. 25% ;将第 (5)步分散处理后的发酵液转接下一级发酵培养基F2,进行发酵培养； (8) 步骤110 :发酵培养至16~48h的发酵液，回到第（5)步，如此重复上述操作，实现连 续发酵。
[0012] 所述种子培养基、发酵培养基F1、发酵培养基F2为淀粉质原料液化液配制的培养 基，包括玉米粉，木薯，红薯。凡提及经过分割发酵液或菌丝分散处理技术实现微生物连续 发酵方法，均适用本发明技术。
[0013] 本发明有益的技术效果在于： 传统分批发酵方式存在非生产周期较长，生产效率低的缺点；并且由于频繁杀菌，检测 装置损伤严重，每次培养均要接种，增加了生长成本。本发明针对这些缺点，基于菌丝球分 散技术与营养调节技术，通过分割发酵方式，实现黑曲霉连续发酵生产柠檬酸。本发明的优 点有： (1) 黑曲霉连续发酵工艺，直接减少种子培养过程，降低种子培养的原料成本与运行成 本； (2) 采用连续发酵工艺，缩短生产周期，提高生产效率；自动化程度高，降低劳动强度； (3) 黑曲霉菌丝体处理后，获得更适宜发酵的菌丝体形态，利于传质与溶氧，提高产酸 效率。
[0014] 本发明提供的黑曲霉连续发酵工艺缩短了生产周期，提高了生产效率。本发明连 续发酵10批次以上，糖酸转化率> 98%，发酵周期< 72h，柠檬酸发酵水平正常。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为本发明黑曲霉连续发酵生产柠檬酸工艺流程图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图1，对本发明进行具体描述。
[0017] 在下面所有的实施方案中，总糖、还原糖采用菲林试剂滴定法，柠檬酸的测定采用 0. 1429mol/L的NaOH滴定，孢子计数采用血球计数板。菌丝分散采用高速分散机处理。其 它无特殊说明，均采用本领域常用的知识和方法。下面实施例中的黑曲霉种子的来源是宜 兴协联生物化学有限公司生产菌种。
[0018] 实施例1 :葡萄糖与豆柏粉分别配制种子培养基(总氮8%，总氮0. 15%)与发酵培养 基（F1 :总糖15. 2%，总氮0. 08% ;F2?F10 :总糖15. 2%，总氮0. 25%);培养成熟的黑曲霉孢子 接种种子培养基，移种后孢子液浓度为30万个/ml ;培养20h，得到成熟的种子液，然后以 20%接种量转接发酵培养基；发酵培养48h，分割出1/3发酵液，分割后剩余的发酵液继续在 F1中发酵，当发酵培养基中还原糖浓度低于0. 5%时，发酵结束，得到柠檬酸。分割出的发酵 液经分散器分散处理，处理后菌球平均直径为90um，转接下一级发酵培养基； 发酵培养48h，分割出1/3发酵液，经分散器分散处理，处理后菌球平均直径为98um，转 接下一级发酵培养基，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中还原糖浓 度降至0. 5%以下发酵结束，糖酸转化率> 99. 6%，发酵周期< 72h，柠檬酸发酵水平正常。
[0019] 实施例2 :玉米粉与去离子水按1:3比例在60°C左右的配料罐中混合均匀，加入 氢氧化钙将pH调至6. 0,按25U/g玉米粉加入高温α -淀粉酶，经过二次喷射液化，碘试合 格(浅棕色)，得到玉米液化混液；70%的混液经过板框过滤得到玉米液化清液。玉米液化 混液与清液按一定的比例混合配制种子培养基（总糖12%，添加一定量的硫酸铵调节总氮 0. 25%)与发酵培养基（F1 :总糖16%，总氮0. 05% ;F2?F10 :总糖16%，总氮0. 15%)。培养成 熟的黑曲霉孢子接种种子培养基，移种后孢子液浓度为45万个/ml ;培养28h，得到成熟的 种子液，然后以10%接种量转接发酵培养基；发酵培养16h，分割出1/4发酵液，分割后剩余 的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原糖浓度低于0. 5%时，发酵结束，得到柠檬 酸。分割出的发酵液经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径为190um，转接下一级发 酵培养基； 发酵培养16h，分割出1/4发酵液，经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径为 150um，转接下一级发酵培养基，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中 还原糖浓度降至〇. 5%以下发酵结束，糖酸转化率彡98. 3%，发酵周期< 72h，柠檬酸发酵水 平正常。
[0020] 实施例3 :同实施例2,玉米粉与水按照一定的比例混合均匀，经过二次喷射液化 得到液化混液，液化液与水按照一定的比例混合，添加一定比例的硫酸铵配制种子培养基 (总糖9. 5%，0. 26%)。木薯粉与水按照1:4比例在60°C左右的配料罐中混合均匀，加入氢 氧化钙将pH调至5. 8,按30U/g木薯粉加入高温α -淀粉酶，经过二次喷射液化，得到木 薯液化液；木薯液化混液全部经过板框过滤得到木薯液化清液。木薯液化清液与水按照一 定的比例混合，添加一定量的玉米粉液化液，配制发酵培养基（F1 :总糖14%，总氮0. 15%; F2~F10 :总糖14%，总氮0. 25%)。培养成熟的黑曲霉孢子接种种子培养基，移种后孢子液浓 度为60万个/ml ;培养36h，得到成熟的种子液，然后以15%接种量转接发酵培养基；发酵培 养24h，分割出1/5发酵液，分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原糖 浓度低于〇. 5%时，发酵结束，得到朽1檬酸。分割出的发酵液经分散器分散处理，分散处理后 菌球平均直径为105um，转接下一级发酵培养基； 发酵培养24h，分割出1/5发酵液，经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径为 88um，转接下一级发酵培养基，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中还 原糖浓度降至0. 5%以下发酵结束，糖酸转化率> 99. 5%，发酵周期< 72h，柠檬酸发酵水平 正常。
[0021] 实施例4 :同实施例3,木薯粉与水按照一定的比例混合均匀，经过二次喷射液化 得到液化混液，70%的木薯液化混液经过板框过滤得到木薯液化清液。木薯液化混液与水 按照一定的比例混合，添加一定量的豆柏粉配制种子培养基（总糖8. 5%，0. 4%)。木薯液化 清液与水按照一定的比例混合，添加一定量的豆柏粉，配制发酵培养基（F1 :总糖15. 1%，总 氮0. 1% ;F2~F10 :总糖14. 9%，总氮0. 10%)。培养成熟的黑曲霉孢子接种种子培养基，移种 后孢子液浓度为50万个/ml ;培养32h，得到成熟的种子液，然后以10%接种量转接发酵培 养基；发酵培养32h，分割出1/2发酵液，分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培 养基中还原糖浓度低于0. 5%时，发酵结束，得到朽1檬酸。分割出的发酵液经分散器分散处 理，处理后菌球平均直径为llOum，转接下一级发酵培养基； 发酵培养32h，分割出1/2发酵液，经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径 120um，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中还原糖浓度降至0. 5%以 下发酵结束，糖酸转化率> 98. 4%，发酵周期< 72h，柠檬酸发酵水平正常。 以上所述仅为本发明的交加实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
【权利要求】
1. 一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 黑曲霉经过逐级扩大培养，获得成熟的孢子； (2) 孢子液接种至种子培养基，培养成为成熟的种子液； (3) 成熟的种子液转接至发酵培养基F1 ; (4) 发酵培养后，分割发酵液为两部分；其中一部分发酵液继续发酵完毕，获得柠檬 酸； (5) 分割出的另一部分发酵液经分散器分散处理，获得分散菌丝的发酵液； (6) 将分散菌丝发酵液接入发酵培养基F2 ;发酵培养后，回到步骤（4)，如此重复实现 连续发酵。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4)中发酵培养16~48h。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5)分割出的发酵液量>总量的1/5。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5)经过分散器分散处理的菌球或菌 块平均直径彡200um。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子培养基种后总糖控制在8~12%，总氮 0· 15?0· 4%。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养基F1种后总糖控制在14~16%，总 氮为0· 05?2%。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养基F2种后总糖控制在14~16%，总 氮为 0· 1(Γ〇· 25%。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体方法如下： (1) 步骤101、步骤102 :将培养成熟的黑曲霉孢子移种入种子培养基；移种后孢子液浓 度为3(Γ60万个/ml料液，种子培养基种后总糖为8~12%，总氮0. 15~0. 4% ; (2) 步骤103 :种子培养2(T36h，得到成熟的种子液； (3) 步骤104 :配制发酵培养基F1，种后总糖控制在14~16%，总氮为0. 05、. 2% ;将成熟 的种子液以1(Γ20% (v/v)的接种量转接入发酵培养基F1 ; (4) 步骤106 :成熟的种子液在发酵培养基F1中发酵培养16~48h ; (5) 步骤107、步骤108 :分割步骤106获得的发酵液，发酵液的分割量>总量的1/5,分 割出的发酵液经分散器处理，分散后的菌球直径< 200um ; (6) 步骤105 :第（5)步中分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原 糖浓度低于〇. 5%时，发酵结束，得到柠檬酸； (7) 步骤109 :配制发酵培养基F2,种后总糖控制在14?16%，总氮为0. 1(Γ〇. 25% ;将第 (5)步分散处理后的发酵液转接下一级发酵培养基F2,进行发酵培养； (8) 步骤110 :发酵培养至16~48h的发酵液，回到第（5)步，如此重复上述操作，实现连 续发酵。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基、发酵培养基F1、发酵培养 基F2为淀粉质原料液化液配制的培养基，包括玉米粉，木薯，红薯。
10. 根据权利要求1、任一项所述的方法，其特征在于凡提及经过分割发酵液或菌丝 分散处理技术实现微生物连续发酵方法，均适用本发明技术。
【文档编号】C12P7/48GK104087624SQ201410329786
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】石贵阳, 王宝石, 张 杰, 胡志杰, 蒋小东, 孙福新, 李赢, 张梁, 李由然, 丁重阳, 顾正华 申请人:江南大学, 宜兴协联生物化学有限公司