植物基因组定点修饰方法

植物基因组定点修饰方法
【专利摘要】本发明提供了植物基因组定点修饰方法。具体地，本发明提供了一种RNA引导的植物基因组定点修饰方法。通过使用特定结构的核酸构建物，本发明方法可在预定的植物基因组位点，高效地进行定点修饰。本发明方法有助于高效地筛选具有改良性状的植物。
【专利说明】植物基因组定点修饰方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及RNA引导的植物基因组定点修饰方法。

【背景技术】
[0002] 过去十多年里，序列特异性核酸酶的发明和改进已经在创建定点突变方面展现出 了强大威力。锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸 酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs)即是其中的主要代表 (Carroll et al.，2006 !Christian et al.，2010)。它们是识别一段特定核酸序列的结合 结构域阵列与一种非特异性核酸酶Fokl组成的融合蛋白。这些蛋白切割核酸序列产生双 链断裂以后，生物体会通过非同源末端连接或者同源重组两种机制进行修复，从而引入定 点改变或修饰。上述技术已经在多个物种里获得成功应用，包括线虫，人细胞，老鼠，斑马 鱼，玉米，水稻，短柄草等（Beumer et al.，2006 ;Meng et al.，2008 ;Shukla et al.，2009 ; Meyer et al. , 2010 ；Cui et al. , 2011 ；Mahfouz et al.,2011；Li et al. , 2012 ；Meyer et al·, 2012 ;Shan et al·, 2013 ;Weinthal et al·, 2013)。然而，这些技术的最大缺陷是通过 蛋白元件来识别特定核酸序列，构建比较麻烦，识别特异性有待提高。
[0003] 2012年人们发现并改进了一种突破性的新技术，CRISPR/Cas。CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)，是一段被一种短重复序 列分隔的核酸序列，它们转录形成的CRISPR RNA (crRNAs)与另一种反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)部分区域配对形成二元复合体。然后，该二元 复合体一起引导具有非特异核酸酶活性的Cas蛋白，切割与crRNAs匹配的DNA序列，从而 形成双链断裂。
[0004] 此外，人们进一步将crRNAs与tracrRNA融合在一起，形成单一的chimeric RNA(chiRNA)分子，并发现chiRNA同样能介导Cas9蛋白切割目的序列（Jinek et al.，2012)。这种可编辑型CRISPR/Cas系统很快在多个物种里面取得成功应用，包括人 细胞系，斑马鱼，大肠杆菌和老鼠等（Jinek et al.，2012;Hwang et al.，2013;Jiang et al.,2013 ；Jinek et al.,2013 ；Mali et al.,2013 ；Shen et al. , 2013 ；ffang et al.，2013)。这项技术的最大优势是构建简易，而且可以同时对多个目标位点基因修饰。对 于动物，可将chiRNA和Cas9的体外转录产物直接施用（如通过注射）于动物，从而引起基 因突变。在老鼠中，已有同时对多达5个目标位点基因突变的成功报道。然而，由于种种未 知的原因，目前尚未在植物中成功开发和应用类似的技术。
[0005] 综上所述，为了植物基因工程的需要，本领域迫切需要开发简便高效的植物基因 组的定点修饰方法。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的就是简便高效的植物基因组的定点修饰方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供适用于植物的CRISPR/Cas技术，并在稳定植株中实现 特异DNA序列的切割。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种植物基因组定点修饰方法，包括步骤：
[0009] (a)将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的 植物细胞，其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰（或待切割位点）的CRISPR RNA(crRNAs)和反式作用型 crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)所构成的嵌合体 (chimera);和
[0010] (b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合 RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA 的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而 进行基因组定点修饰。
[0011] 在另一优选例中，所述的定点修饰包括定点随机修饰和定点非随机修饰（定点精 确修饰）。
[0012] 在另一优选例中，在嵌合RNA和Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割之前，向植物 细胞中导入供体DNA，从而进行基因组定点精确修饰，所述供体DNA为单链或双链DNA，并包 含待插入或待替换的DNA序列，所述DNA序列可以为单个核苷酸、或多个核苷酸（包括DNA 片段或者编码基因）。
[0013] 在另一优选例中，所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物， 其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的；
[0014] 其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
[0015] 第一植物启动子；
[0016] 与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码 序列的结构如式I所示：
[0017] A-B (I)
[0018] 式中，
[0019] A 为编码 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列；
[0020] B 为编码反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列；
[0021] 表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录 形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和
[0022] RNA转录终止子；
[0023] 第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件：
[0024] 第二植物启动子；
[0025] 与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的 是N端、C端或两侧与核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和
[0026] 植物转录终止子。
[0027] 在另一优选例中，所述第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个（针对多个待切 割位点），并与第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的。
[0028] 在另一优选例中，各第一亚核酸构建物与第二亚核酸构建物的相对位置是任意 的。
[0029] 在另一优选例中，所述的第二植物启动子和与所述所述Cas蛋白的编码序列之间 5'至3'还操作性相连有：
[0030] 第三亚核酸构建物，较佳地，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒 (TBSV)的p 19蛋白编码序列；和
[0031] 自剪切序列，较佳地，所述的自剪切序列为2A多肽编码序列（SEQ ID NO. : 98)。
[0032] 在另一优选例中，所述的pl9蛋白编码序列包括pl9基因的全长序列或cDNA序 列。
[0033] 在另一优选例中，所述的2A多肽序列如SEQ ID NO. : 99所示
[0034] 在另一优选例中，所述的pl9蛋白编码序列如SEQ ID NO. : 100所示。
[0035] 在另一优选例中，所述的pl9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 101所示。
[0036] 在另一优选例中，所述定点修饰包括：
[0037] (i)在没有供体DNA的情况下，对植物基因组特定位点进行随机插入和缺失；和
[0038] (ii)在存在供体DNA的情况下，以供体DNA为模板，对植物基因组特定位点进行精 确插入、缺失或者替换DNA序列；
[0039] 较佳地，所述定点修饰包括对植物基因组的基因敲除，基因敲入（转基因）以及调 控（上调或下调）内源基因的表达水平。
[0040] 在另一优选例中，所述的RNA转录终止子为U6转录终止子，为至少连续的7个 T(TTTTTTT)〇
[0041 ] 在另一优选例中，第一植物启动子为来自于待改造植物的内源启动子。
[0042] 在另一优选例中，第一植物启动子为来自于待改造植物的RNA聚合酶III依赖的 启动子。
[0043] 在另一优选例中，所述RNA聚合酶III依赖的启动子包括AtU6-26、0sU6-2、 AtU6-l、AtU3-B、At7SL 或其组合。
[0044] 在另一优选例中，所述的植物转录终止子为Nos。
[0045] 在另一优选例中，所述的第二植物启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子，较佳地， 包括组成型表达的启动子或拟南芥生殖细胞特异性表达的sporocyteless(SPL)启动子。
[0046] 在另一优选例中，所述第二亚核酸构建物中，在所述Cas蛋白的编码序列后，自5' 至3'还依次操作性连接有SPL基因的表达框架。
[0047] 在另一优选例中，所述的SPL基因表达框架包括SPL基因的内含子、外显子、非翻 译区、和终止子。
[0048] 在另一优选例中，所述的SPL基因表达框架自5'至3'依次操作性连接有一个或 多个选自SEQ ID NO. :103(内含子1)、104(外显子2)、105(内含子2)、106(外显子3)、 107(3'非翻译区）、108(终止子）所示的序列。
[0049] 在另一优选例中，所述的第二亚核酸构建物中的植物转录终止子序列如SEQ ID NO. : 108 所示。
[0050] 在另一优选例中，所述的核酸构建物是一个同时表达嵌合RNA和Cas蛋白的质粒。
[0051] 在另一优选例中，所述的植物包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物；
[0052] 较佳地，所述的植物包括林业植物、农用植物、经济作物、观赏植物。
[0053] 在另一优选例中，所述的植物包括以下科的植物：十字花科、禾本科。
[0054] 在另一优选例中，所述的植物包括但不限于拟南芥、水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、 燕麦、黑麦、甘鹿、油菜、白菜、棉花、大豆、苜猜、烟草、番爺、辣椒、南瓜、西瓜、黄瓜、苹果， 桃、李、海棠、甜菜、向日葵、莴苣、莴舆、青蒿、菊芋、甜叶菊、杨树、柳树、桉树、丁子香、橡胶 树、木薯、蓖麻、花生、豌豆、黄芪、烟草，番茄，辣椒等。
[0055] 在另一优选例中，所述的cas蛋白包括cas9蛋白。
[0056] 在另一优选例中，所述的第二植物启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子。
[0057] 在另一优选例中，所述的RNA聚合酶II依赖的启动子包括组成型启动子和拟南芥 生殖细胞特异性表达的sporocyteless(SPL)启动子。
[0058] 在另一优选例中，所述的第一植物启动子包括AtU6-26、0sU6-2、AtU6-l、AtU3-B、 At7SL或其组合。
[0059] 在另一优选例中，所述的第二植物启动子包括35s、UBQ、SPL启动子或其组合。
[0060] 在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤（b)之前或之后，将所述的转化的植物 细胞再生成植株。
[0061] 在另一优选例中，所述方法还包括：检测所述转化的植物细胞中基因组的突变或 修饰情况。
[0062] 在另一优选例中，所述植物细胞包括来自培养物、愈伤组织、或植株的植物细胞。
[0063] 在本发明的第二方面，提供了一种用于植物基因组定点修饰的核酸构建物，所述 核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚 核酸构建物是相互独立的，或是一体的；
[0064] 其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
[0065] 第一植物启动子；
[0066] 与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码 序列的结构如式I所示：
[0067] A-B (I)
[0068] 式中，
[0069] A 为编码 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列；
[0070] B 为编码反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列；
[0071] 表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录 形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和
[0072] RNA转录终止子；
[0073] 第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件：
[0074] 第二植物启动子；
[0075] 与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的 是N端、C端或两侧与核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和
[0076] 植物转录终止子。
[0077] 在另一优选例中，所述的第二植物启动子和与所述所述Cas蛋白的编码序列之间 5'至3'还操作性相连有：
[0078] 第三亚核酸构建物，较佳地，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒 (TBSV)的p 19蛋白编码序列；和
[0079] 2A 序列。
[0080] 在另一优选例中，所述的pl9蛋白编码序列包括pl9基因的全长序列或cDNA序 列。
[0081] 在另一优选例中，所述的pl9蛋白编码序列如SEQ ID NO. :98所示。
[0082] 在另一优选例中，所述的RNA转录终止子为U6转录终止子，为至少连续的7个 T(TTTTTTT)〇
[0083] 在另一优选例中，所述的植物转录终止子为Nos。
[0084] 在另一优选例中，所述的核酸构建物为DNA构建物。
[0085] 在另一优选例中，所述的第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是一体的。
[0086] 在另一优选例中，所述的第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个（针对多个待 切割位点）。
[0087] 在另一优选例中，第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物位于同一个质粒中。
[0088] 在另一优选例中，第一亚核酸构建物位于第二亚核酸构建物的上游或下游。
[0089] 在另一优选例中，所述的第一植物启动子和/或第二植物启动子是组成型或诱导 型启动子。
[0090] 在另一优选例中，所述的Cas蛋白的编码序列还包括位于ORF两侧的NLS序列。
[0091] 在另一优选例中，所述第二亚核酸构建物还包括：位于Cas蛋白编码序列下游的 Nos终止子。
[0092] 在另一优选例中，所述的Cas蛋白还带有标签序列。
[0093] 在另一优选例中，所述第二亚核酸构建物还包括：位于第二植物启动子与位于 Cas蛋白编码序列之间的标签序列（如3XFlag序列）。
[0094] 在另一优选例中，位于N端的NLS序列位于所述的标签序列的下游。
[0095] 在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体携带本发明第二方面所述的核 酸构建物；
[0096] 本发明还提供一种载体组合，所述载体组合包括第一载体和第二载体，其中第一 载体携带本发明第二方面所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物，而第二载体携带本发明 第二方面所述的核酸构建物的第二亚核酸构建物。
[0097] 在另一优选例中，所述的第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个。
[0098] 在另一优选例中，所述的第一载体可以为一个或者多个，并携带一个或者多个本 发明第二方面所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物。
[0099] 在本发明的第四方面，提供了一种基因工程的细胞，所述细胞含有本发明第三方 面中所述的载体或载体组合。
[0100] 在本发明的第五方面，提供了一种植物细胞，所述的植物细胞的基因组中整合有 本发明第二方面所述的核酸构建物。
[0101] 在本发明的第六方面，提供了一种制备植物的方法，包括步骤：将本发明第五方面 所述的植物细胞再生成形成植株。
[0102] 在本发明的第七方面，提供了一种植物，所述植物的植物细胞的基因组中整合有 本发明第二方面所述的核酸构建物。
[0103] 在本发明的第八方面，提供了一种植物，所述植物是第六方面所述的方法制备的。
[0104] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0105] 图1显示来自酿脓链球菌SF370的SpCas9可以在拟南芥原生质体中造成DNA的 定点双链断裂。（A) SpCas9的表达由2 X 35S启动子驱动，而引导RNA(chiRNA)则由拟南芥 中的AtU6-26启动子驱动。NLS，核定位序列；Flag, Flag标签序列；Nos, Nos终止子。（B) 基于同源重组的YF-FP报告系统。图中显示了设计的chiRNA目标位点。PAM序列标记为 紫红色，20个碱基的目的序列标记为蓝绿色。（C) YF-FP报告系统检测的CRISPR/Cas活性。 YFP阳性细胞由流式细胞仪检测。
[0106] 图2显示稳定转化载体和目的基因 chiRNA设计位点示意图。（A)用于农杆菌介导 稳定转化水稻和拟南芥的双元载体示意图，其同时带有chiRNA和Cas9表达框。SpCas9的 表达由2 X 35S启动子驱动，拟南芥chiRNA由AtU6-26启动子驱动，水稻chiRNA为0sU6-2 启动子驱动。（B) Cas9/chiRNA目标位点示意图。PAM序列标记为紫红色，chiRNA目标位点 标记为蓝绿色。限制性内切酶位点由方框标注。用于RFLP检测的酶切位点用黑框标注。
[0107] 图3显示SpCas9可以在拟南芥和水稻植株中多个基因位点进行DNA的定点切割。 (A)和（B)BRIl位点1的代表性Tl代转基因植株。左边显示的是生长正常的植株，右边的 是显示与bril突变体类似表型的植株。植株在MS培养基上筛选5天后移栽到培养土中生 长1周㈧或3周⑶后拍照。（C)GAI位点1的代表性Tl代转基因植株。左边显示的是 生长正常的植株，右边的是显示与gai突变体类似表型的植株。植株在MS培养基上筛选5 天后移栽到培养土中生长4周后拍照。（D)处于生根期的R0C5位点1的代表性Tl转基因 植株。（E)BRIl位点1的12株Tl代转基因苗的限制性酶切分析。PCR产物由EcoRV进行酶 切。M，DNA分子量标准。（F) R0C5位点1的14株Tl代转基因苗的限制性酶切分析。PCR产 物由AhdI进行酶切。M，DNA分子量标准。（G)和⑶从BRIl位点I (G)和R0C5位点I (H) 的一株Tl代转基因苗中检测到的目标位点区域突变代表类型。野生型对照序列在顶部， PAM序列标记为紫红色，目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入 或者突变的碱基。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。（I)水稻和 拟南芥的Tl代转基因苗观察到表型和突变情况鉴定统计。标尺长度为lcm(A，B，C，D)。
[0108] 图4显示在拟南芥中BRIl基因位点1上由工程化的chiRNA :Cas9诱导产生的靶 向位点缺失突变。所示突变类型是来自于12个独立Tl代转基因植株的基因组DNA扩增并 克隆到载体后进行测序得到。最上面显示的是野生型对照的序列，PAM序列标记为紫红色， 目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列 的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。值得注意的是有的序列既有插入又 有缺失。98个克隆中检测到了 75个突变。
[0109] 图5显示在拟南芥中BRIl基因位点2上由工程化的chiRNA :Cas9诱导产生的靶 向位点缺失突变。所示突变类型是来自于3个独立Tl代转基因植株的基因组DNA扩增并 克隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标 记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化 情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。71个克隆中检测 到了 28个突变。
[0110] 图6显示在拟南芥中BRIl基因位点3上由工程化的chiRNA :Cas9诱导产生的靶 向位点缺失突变。所示突变类型是来自于4个独立Tl代转基因植株的基因组DNA扩增并 克隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标 记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化 情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。34个克隆中检测 到了 22个突变。
[0111] 图7显示在拟南芥中GAI基因位点1上由工程化的chiRNA :Cas9诱导产生的靶向 位点缺失突变。所示突变类型是来自于3个独立Tl代转基因植株的基因组DNA扩增并克 隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记 为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情 况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。53个克隆中检测到 了 17个突变。
[0112] 图8显示在水稻中R0C5基因位点1上由工程化的chiRNA :Cas9诱导产生的靶向 位点缺失突变。所示突变类型是来自于5个独立Tl代转基因植株的基因组DNA扩增并克 隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记 为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情 况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。165个克隆中检测 到了 136个突变。
[0113] 图9显示了 Pa7_YFP的载体图谱。
[0114] 图10显示了 AtU6-26chiRNA序列（未插入目的位点识别序列SEQ ID NO. : 1)。其 中，灰色标注的为AtU6-26启动子，下划线标注的为插入目的位点oligo的两个BbsI酶切 位点，方框标注的为与目的位点融合的反式作用型crRNA区域。
[0115] 图11显示了 AtU6-26chiRNA序列（已插入目的位点识别序列SEQ ID NO. :2)。
[0116] 图12显示了 0sU6-2chiRNA序列（未插入目的位点识别序列SEQ ID NO. :3):其 中，灰色标注的为0sU6-2启动子，下划线标注的为插入目的位点oligo的两个BbsI酶切位 点，方框标注的为与目的位点融合的反式作用型crRNA区域。
[0117] 图13显示了 0sU6-2chiRNA序列（已插入目的位点识别序列SEQ ID NO. :4)。
[0118] 图 14 显示了 2X35S-Cas9_Nos 序列（SEQ ID NO. :39)。
[0119] 图15A-B显示了 CRISPR-Cas同时在Tl代拟南芥转基因植株中同时造成CHLIl和 CHLI2基因定点突变。所示突变类型是来自于3个独立T1代转基因植株的基因组DNA扩增 并克隆到载体后进行测序得到。最上面显示的是野生型对照的序列，目标位点用下划线标 记。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，-表示缺失。
[0120] 图16显示了 CRISPR-Cas在Tl代拟南芥转基因植株中同时造成TT4基因内两个 位点的定点突变及位点之间大片度序列缺失。所示突变类型是来自于11个独立Tl代转基 因植株的基因组DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。最上面显示的是野生型对照的序 列，目标位点用下划线标记。两个目的位点的序列完整变化情况及检测到的比例标注在右 侦牝用"；"分隔，+表示插入，-表示缺失。
[0121] 图17显示了植物基因打靶载体构建示意图。pSPL-Cas9-SgR:生殖系特异表达的 植物基因打靶载体。pUBQ-Cas9-sgR:组成型表达的植物基因打靶载体。pAtU6:拟南芥U6 基因的启动子；sgRNA:单链引导RNA ;PAtSPL:拟南芥SPL基因的启动子；pAtUBQ:拟南芥 UBQ基因的启动子；HspCas9 :人源化的链霉菌Cas9基因 ；SPL intron:SPL基因的内含子； SPL exon:SPL基因的外显子；tSPL:SPL基因的终止子；tUBQ:UBQ基因的终止子。
[0122] 图18显示了 Cas9基因的原位杂交。A, B，C:pSPL-Cas9-sgR的Tl代转基因植物； D，E，F:pUBQ-Cas9-SgR的Tl代转基因植物。A，D:花药发育的V期；B，E:花药发育的VII 期；C，F:胚珠发育的II期。标尺=20 μ M。
[0123] 图19显示了生殖系专一性基因打靶系统的效率统计。Α:测序结果比对发现， pSPL-Cas9-sgR-APl-27/194的Tl代转基因植物没有检测到突变，但在相应的T2代植物中 却可以检测到突变。B:组成型基因敲除系统和生殖细胞专一性基因敲除系统在不同组织和 不同世代中敲除效率的比较。
[0124] 图20显示了不同植物打靶系统T2代转化子的突变类型统计。对于转化不同的载 体构建的T2代群体，随机选取8个发生突变的株系，分别检测12个单株用于突变类型的统 计。
[0125] 图21显示了高效植物基因打靶载体示意图。A:常规拟南芥基因打靶载体 psgR-Cas9。B:共表达植物转录后基因沉默抑制蛋白的基因打靶载体pSgR-Cas9-pl9。 pAtU6:拟南芥U6基因启动子；sgRNA:单链引导RNA;pUBQ:拟南芥UBQ基因启动子； hSpCas9:人源化的链霉菌Cas9基因；tUBQ:拟南芥UBQ基因的终止子；TBSV-pl9:番茄矮 壮病毒（TBSV)的pl9蛋白编码基因；2A肽：蛋白顺式切割元件；BbsI = BbsI内切酶识别位 点。
[0126] 图22显示了利用原生质体瞬时表达系统，检测pl9共表达载体的基因打靶效率。 A:pl9的作用机制以及检测原理示意图。pl9蛋白在植物细胞中以二聚体形式存在，可以起 到抑制sgRNA的降解，提高sgRNA与Cas9的结合活性的功能。sgRNA-Cas9复合体能够结合 YFFP报道基因上的识别序列并剪切，产生双链DNA的断裂（DSB)。部分重复的YFP序列会 发生单链退火，从而被DNA损伤修复系统切除并修复正确。B = YFFP瞬时表达系统地荧光检 测。a，c，e，g，I，k:YFP荧光通道下的阳性细胞信号。b，d，f，h，j，1:RFP荧光通道下的叶绿 体自发荧光信号。左下方的数值代表YFP阳性细胞在整个细胞群体中所占的比例。
[0127] 图23显示了 sgR-Cas9_pl9转基因植物的基因表达分析。A:在sgR-Cas9_pl9的 转基因群体中出现三种不同程度的发育表型：1/- :叶片平展，2/+:叶片卷曲，3/++:叶片锯 齿。B = Northern结果表明，在叶片出现锯齿的转基因植物总，sgRNA和miRNAmel68的表达 水平都有明显的提高。C，D = Realtime PCR的结果显示，叶发育表型与pl9的表达水平正相 关，但是Cas9基因的表达量相对稳定。
[0128] 图24显示了 sgR-Cas9_pl9转基因 Tl代植物的表型分析。在sgR-Cas9-pl9_APl 和SgR-Cas9-pl9-TT4这两个转基因群体中，根据叶发育表型的严重程度，共分为三类，没 有表型（P19/-)，叶卷曲（pl9/+)和叶锯齿（pl9/++)。同时根据靶基因突变的程度，也分为 三类，野生型（WT)，嵌合体（chimera)和突变体（mutant)。分类统计相应的植株数目，计入 表格。

【具体实施方式】
[0129] 本发明人经过广泛而深入的研究，采用特定结构的核酸构建物，从而首次在植物 中成功实现了 RNA引导的基因组定点修饰。本发明方法不仅可进行定点切割和修饰，而且 可以在特定位点高效引入各种不同类型的突变，从而有利于筛选具有经改造的新植物，而 采用了生殖细胞中特异性表达的启动子还能提高从子代中的获得基因定点修饰植物的比 例，此外，本发明人还发现，当本发明核酸构建物中引入特定的序列后，能够有效地改善植 物打靶的效率并影响植物的发育表型。在此基础上完成了本发明。
[0130] 实验表明，本发明特别适用于植物，可在稳定植株中对基因组实现特异的定点DNA 序列的切割和基因修饰。
[0131] 定义
[0132] 如本文所用，术语" crRNA"指负责识别目标位点的CRISPR RNA。
[0133] 如本文所用，术语"tracrRNA"指与crRNA配对的反式激活crRNA。
[0134] 如本文所用，术语"植物启动子"指能够在植物细胞中启动核酸转录的核酸序列。 该植物启动子可以是来源于植物、微生物（如细菌、病毒）或动物等，或者是人工合成或改 造过的启动子。
[0135] 如本文所用，术语"植物转录终止子"指能够在植物细胞中可使转录停止的终止 子。该植物转录终止子可以是来源于植物、微生物（如细菌、病毒）或动物等，或者是人工 合成或改造过的终止子。代表性的例子包括（但并不限于）=Nos终止子。
[0136] 如本文所用，术语"Cas蛋白"指一种核酸酶。一种优选的Cas蛋白是Cas9蛋白。 典型的Cas9蛋白包括（但并不限于）：来源于酿脓链球菌SF370的Cas9。
[0137] 如本文所用，术语"Cas蛋白的编码序列"指编码具有切割活性的Cas蛋白的核苷 酸序列。在插入的多聚核苷酸序列被转录和翻译从而产生功能性Cas蛋白的情况下，技术 人员会认识到，因为密码子的简并性，有大量多聚核苷酸序列可以编码相同的多肽。另外， 技术人员也会认识到不同物种对于密码子具有一定的偏好性，可能会根据在不同物种中表 达的需要，会对Cas蛋白的密码子进行优化，这些变异体都被术语"Cas蛋白的编码序列"所 具体涵盖。此外，术语特定地包括了全长的、与Cas基因序列基本相同的序列，以及编码出 保留Das蛋白功能的蛋白质的序列。
[0138] 如本文所用，术语"植物"包括全植株、植物器官（如叶、茎、根等）、种子和植物细 胞以及它们的子代。可用于本发明方法的植物的种类没有特别限制，一般包括任何可进行 转化技术的高等植物类型，包括单子叶、双子叶植物和裸子植物。
[0139] 如本文所用，术语"异源序列"是来自不同种的序列，或者如果来自同一种则是对 其最初形式经过充分修饰的序列。例如，可操作地连于启动子的异源结构基因可以是来自 不同于获得该结构基因的种，或者，如果来自同一种，则其中之一或两者都对它们的最初形 式进行了充分的修饰。
[0140] 如本文所用，"可操作地连于"或"操作性相连"指这样一种状况，即线性DNA序列 的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体 表达并参与多肽的分泌，那么信号肽（分泌前导序列）DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如 果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于 能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相 邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0141] 如本文所用，术语"2A多肽编码序列"、"自剪切序列"、"2A序列"指的是是发现于 病毒中的一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列，类似于IRES，利用2A可以实现单一启 动子同时表达两个基因。它也广泛存在于各类真核细胞。与IRES不同的是，下游蛋白表达 量不会减少。但剪切后2A多肽残基与上游蛋白连为一体，可在上游蛋白和2A多肽间加入 一种Furin蛋白酶剪切点（4个碱性氨基酸残基，如Arg-Lys-Arg-Arg)以从上游蛋白末端 完全切除2A多肽残基。
[0142] 如本文所用，术语"嵌合RNA(chiRNA) "、"单链引导RNA(SgRNA) "可互换使用，均指 由具有式I所示结构编码序列的并能够转录形成一个完整的RNA分子的RNA序列。
[0143] 核酸构建物
[0144] 本发明提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚 核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或一体的；
[0145] 其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
[0146] 第一植物启动子；
[0147] 与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码 序列的结构如式I所示：
[0148] A-B (I)
[0149] 式中，
[0150] A 为编码 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列；
[0151] B 为编码反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列；
[0152] 表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录 形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和
[0153] RNA转录终止子（包括但并不限于：U6转录终止子，为至少连续的7个T);
[0154] 第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件：
[0155] 第二植物启动子；
[0156] 与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的 是N端、C端或两侧与核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；
[0157] 植物转录终止子（包括但并不限于Nos等终止子）。
[0158] 在本发明中，第一植物启动子和第二植物启动子的强度分别能够启动产生有效量 的chiRNA和Cas蛋白，以实现对植物基因组的定点修饰。
[0159] 应理解，在本发明中，第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物可以位于同一或不 同的多核苷酸上，也可以位于同一或不同的载体上。
[0160] 将本发明构建好的上述核酸构建物，通过常规的植物重组技术（例如农杆菌转让 技术），可以导入植物细胞，从而获得携带所述核酸构建物（或带有所述核酸构建物的载 体）的植物细胞，或获得基因组中整合有所述核酸构建物的植物细胞。
[0161] 在所述植物细胞中，本发明核酸构建物所转录形成的chiRNA以及所表达形成Cas 蛋白，可以配合对基因组进行定点切割，进而引入各种不同的突变。
[0162] 此外，为了获得更多含有突变基因的种子，并进一步提高CRISPR/Cas9系统在生 殖细胞中的活性，减小基因打靶技术对植物发育过程可能产生的不良影响，本发明采用了 拟南芥SPOROCYTELESS(SPL)基因的表达框架来驱动Cas9基因的表达。
[0163] SPL基因在拟南芥的生殖细胞系，包括大孢子母细胞和小孢子母细胞中都有特异 的表达。原位杂交实验的结果表明，SPL基因的表达框架能有效地启动Cas9在生殖细胞系 中的转录。同时，突变体检测的结果也证明，由SPL启动子驱动的Cas9表达系统，并不影响 Tl代转基因植物的基因功能和生长发育，但在T2代的转基因群体中却可以获得大量靶向 基因发生突变的杂合子，这说明目的基因的突变是在生殖细胞中发生的。
[0164] 为了进一步提高SgRNA在植物中的稳定性，以及CRISPR/Cas9系统的基因打靶效 率，构建了 TBSV-p 19蛋白与Cas9蛋白共表达的基因打靶载体pSgR-Cas9-p 19。通过在拟南 芥的瞬时表达系统中检测重组正确的YFFP基因的蛋白活性，实验证明，pl9蛋白可以显著 提高CRISPR/Cas9系统的基因打靶效率。
[0165] 此外，同时构建了以拟南芥内源基因为靶点的pl9共表达载体，在得到的Tl代植 物中，约1/3出现了明显的叶发育表型，提示pl9对受miRNA调控的植物发育过程有抑制 作用。Northern检测及基因表达定量分析的结果表明，pl9蛋白的表达水平与miR168和 sgRNA的累积量呈正相关性。同时，对靶向位点的表型和基因型分析也说明，pl9表达量高 的转基因植物，靶基因发生突变的概率也更高，这为进一步改进基于CRISPR/Cas9的植物 基因打靶系统提供了重要的依据和手段。
[0166] 定点切割的方法
[0167] 本发明还提供了一种对植物的基因组进行定点切割或定点修饰的方法。
[0168] (a)将表达嵌合RNA和表达Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物 细胞；和
[0169] (b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合 RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA 的引导下，在所述转化的植物细胞中通过所述Cas蛋白进行基因组定点切割，从而进行基 因组定点修饰。
[0170] 在本发明方法中，步骤（a)中的表达嵌合RNA和表达Cas蛋白的核酸构建物可以 是同一核酸构建物，也可以是不同的核酸构建物。
[0171] 另外，如果待处理的植物或植物细胞中已经含有了 Cas蛋白表达盒，那么可以仅 导入表达嵌合RNA的核酸构建物。
[0172] 此外，如果需要同时在多个特定位点进行定点切割或定点修饰，那么可以将表达 多个不同chiRNA的核酸构建物（可以是同一或不同的核酸构建物）导入植物细胞。
[0173] 在定点切割后，植物细胞会通过多种机制进行修复，并常常会在修复过程中引入 各种不同的突变。基于此，人们可以筛选出具有所需突变或所需表现的植物或植物细胞，以 便用于后续研究或生产。
[0174] 定点精确修饰的方法
[0175] 如果需要在植物基因组中进行定点精确插入、缺失或者替换DNA序列，那么可以 在嵌合RNA和Cas蛋白对基因组进行定点切割之前，导入供体DNA，所述供体DNA可以为单 链或双链DNA，并包含待插入或待替换的DNA序列，所述DNA序列可以为单个核苷酸、或多个 核苷酸（包括DNA片段或者编码基因）。在定点切割后，植物细胞可以通过同源重组介导 的DNA修复系统，以供体DNA为模板，对植物基因组进行定点精确插入、缺失或者替换修饰。 所述供体DNA可以用于在植物基因组特定位置插入或置换特定DNA序列；也可以用于替换 启动子，插入增强子等DNA顺式调控元件，以调控植物内源基因的表达水平；还可以用于插 入编码完整蛋白的多核苷酸序列。导入供体DNA的方法包括但不限于：显微注射，农杆菌介 导转染，基因枪法，电击法，超声波法，脂质体介导法，聚乙二醇（PEG)介导法，激光微束穿 刺孔法，供体DNA经化学修饰（添加亲脂性基团）后直接导入等。
[0176] 应用
[0177] 本发明可应用于植物基因工程领域，用于改造各种不同的植物，尤其是具有经济 价值的农作物和林业植物。
[0178] 本发明的主要优点包括：
[0179] (a)可特异性地在植物基因组的特定位置，进行定点切割和修饰。
[0180] (b)可高效地在特定位置引入各种不同形式的修饰。
[0181] (C)可高效地在特定位置引入新的基因。
[0182] (d)可高效地敲除植物基因组的特定基因。
[0183] (e)可有效地调控植物内源基因的表达水平。
[0184] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0185] 通用材料和方法
[0186] 拟南芥和水稻植物生长
[0187] 试验中采用拟南芥野生型Col-O (购自美国ABRC中心）。种子播种到MS培养基上 先在4°C春化3天，然后放入22°C长光照生长室（16h光照/8h黑夜），5-10天后移苗到营 养土。
[0188] 实验中采用的水稻为Kasalath品种（购自中国水稻所），植株移栽到土中后生长 于温室中（16h光照，30度/8h黑夜，22度）。
[0189] 目的位点的设计
[0190] 合适的chiRNA目的位点为UGG的形式，其中Np2tl为chiRNA载体构建物所需 要提供的识别序列，NGG为CRISPR/Cas9复合体与DNA目的位点结合所需要的识别序列，称 为PAM序列。
[0191] 因为U6型小RNA的转录以G作为起始信号，因此，选用对GN19NGG这种形式的序列 作为目的位点。此外，因为研究表明CRISPR/Cas系统可以容忍目的位点远离PAM序列一侧 多达5个碱基的错配，因此如果N 1^的第一个核苷酸是G，则合成目的位点oligo引物为接 头加 Nn ;如果Np2tl的第一个核苷酸不是G，则本实施例中也将之当做为G，合成目的位点 oligo引物为接头加 GN2_2。。
[0192] 载体构建
[0193] 从载体pX260中，用引物Cas9_F和Cas9_R，通过PCR扩增SpCas9的编码序列， 亚克隆到PA7-GFP载体的XhoI和BamHI位点之间替换掉其原来的GFP基因，这样就分别 在N端和C端获得了 2x35S启动子和Nos终止子。pX260和A7-GFP载体的详细构建方法 见文献（Voelker et al·，2006 ;Cong et al·，2013)。随后用 Hindlll/EcoRI 酶切位点将 2x35S启动子到Nos终止子这段完整的Cas9表达盒亚克隆到pBluescript SK+载体（购自 Stratagene Inc.，San Diego, CA)，命名为 35S_Cas9_SK。
[0194] 以拟南芥野生型Col-O基因组DNA为模板，用AtU6-26F和AtU6-26R引物通过 PCR扩增获得AtU6-26启动子，然后亚克隆到pEasy-Blunt载体（购自全式金生物，北京） 中，挑选KpnI在启动子前端的克隆。随后利用KpnI/XhoI酶切位点亚克隆到pBluescript SK+(购自 Stratagene Inc.，San Diego, CA)载体中。用 AtU6-26-85F 和 AtU6-26-85R 引物 通过PCR扩增的方法从载体pX330中获得85bp的chiRNA诱导序列并与AtU6-26启动子融 合，从而获得完整的chiRNA表达载体（见图10)，获得的载体命名为At6-26SK。根据设计 的目标位点合成上下游寡聚核苷酸链（见表1)，退火形成的带有接头的双链小片段通过连 接反应克隆到BbsI酶切后的At6-26SK的两个BbsI位点之间。
[0195] 随后用KpnI/EcoRI酶切将chiRNA表达盒亚克隆到35S-Cas9-SK中用于瞬时表达 分析，或者用KpnI/Sall酶切后与带有完整Cas9表达框的Sall/EcoRI片段一起亚克隆到 pCambial300 载体的 KpnI/EcoRI 区域（Cambia, Canberra, Australia)以用于拟南芥转基 因。
[0196] 以水稻野生型Nipponbare基因组DNA为模板用0sU6-2F和0sU6-2R引物通过PCR 扩增获得〇sU6-2启动子，然后亚克隆到pEasy-Blunt载体（全式金生物，北京）中。
[0197] 随后用 TPCR-〇sU6F 和 TPCR-〇sU6R 引物通过 Transfer PCR 的方法将 0sU6-2 转 移到At6-26SK载体中替换AtU6-26启动子，获得载体0sU6-2SK(见图12)。根据设计的 目标位点合成上下游寡聚核苷酸链，退火形成的带有接头的双链小片段通过连接反应克隆 到BbsI酶切后的0sU6-2SK的两个BbsI位点之间。随后用KpnI/EcoRI酶切将chiRNA表 达盒亚克隆到35S-Cas9-SK中用于瞬时表达分析，或者用KpnI/Hindlll酶切后与带有完 整Cas9表达框的Hindlll/EcoRI片段一起亚克隆到pCambial300载体的KpnI/EcoRI区域 (Cambia, Canberra, Australia)以用于水稻转基因。
[0198] 以拟南芥野生型Col-O基因组为模板，用pAtU6-F-HindIII和pAtU6-R引物通 过PCR扩增得到AtU6-26启动子片段pAtU6-26。以pX330载体为模板，用sgR-F-U6和 SgR-R-SmaI引物通过PCR扩增得到chiRNA (即sgRNA)片段。随后以chiRNA和pAtU6 的PCR产物的混合物为模板，用pAtU6-F-HindIII和sgR-R-Smal引物进行重叠 PCR获得 pAtU6-chiRNA 片段（SEQ ID NO. :40)，经过 HindIII 和 XmaI 酶切后插入 pMD18T 载体相应 位置得到PsgR-At载体。
[0199] 以拟南芥野生型Col-O基因组为模板，分别用pAtUBQl-F-Smal和pAtUBQl-R-Cas 与tUBQl-F-BamHI和tUBQ-R-Kpnl为引物通过PCR扩增获得AtUBQl的启动子pAtUBQl和 终止子。以PX330载体为模板，以Cas9-F-pUBQ和Cas9-R-BamHI为引物通过PCR扩增获得 Cas9基因片段。将上述pAtUBQl，Cas9基因和AtUBQl的终止子片段分别用XmaI和NcoI， NcoI和BamHI以及BamHI和KpnI酶切后共同连入用XmaI和KpnI双切的psgR-At载体，最 终得到插入片段为 pAtUBQ-Cas9-tUBQ(SEQ ID NO. :41)的 psgR-Cas9-At 骨架载体。
[0200] 选择符合5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3'的序列作为靶标。对于 psgR-Cas9-At 载体，分别合成正义链 5' -GATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' 和反义链 5' -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'。随后将两条合成的人工序列链变性退火形成带接头 的双链DNA小片段，插入psgR-Cas9-At的两个BbsI酶切位点之间，获得针对特定目标位 点的psgR-Cas9-At载体。从已插入有靶标基因片段的psgR-At载体上，用pAtU6-F-KpnI 和SgR-EcoRI引物，扩增得到完整的pAtU6-chiRNA元件，并用KpnI和EcoRI酶切后 插入已经带有针对另一个祀标基因的pAtU6-chiRNA元件的psgR-Cas9_At载体，得到 p2XsgR-Cas9-At载体。随后用HindIII和EcoRI酶切，将完整的2XsgR-Cas9-At亚克隆 到 pCambial300 (Cambia, Canberra, Australia)载体得到双兀载体 p2 X 130〇-sgR_Cas9 用 于拟南芥转基因。
[0201] pUBQ_Cas9_sgR系列载体的构建
[0202] 合成引物sgR-Bsa I -F/R，用PNK激酶将引物加磷，缓慢退火，连入psgR-Cas9_At 的Bbs I位点。将所得到的psgR_Cas9_Bsa载体用EcoR I和Hind III酶切连入pBinl9 载体。即得 pUBQ-Cas9-sgR 载体。将合成的引物 sgR-APl-S27/A27 和 sgR-APl-S194/A194 也按照上述方法连入pUBQ-Cas9-sgR载体的Bsa I位点，即得pUBQ-Cas9-sgR-APl-27和 pUBQ-Cas9-sgR-APl-194。
[0203] pSPL_Cas9_sgR系列载体的构建
[0204] 合成引物SPL5' -F-Xma I和SPL5' -R-Bsa I，从拟南芥基因组上扩增SPL基因 的5'端启动子序列。该片段用Xma I和Bsa I酶切后，连入psgR_Cas9_Bsa的Xma I 和 Nco I 位点，得到 pSPL-Cas9-5'。合成引物 SPL3' -F-BamH I 和 SPL3' -R-Kpn I，从 拟南芥基因组上扩增SPL基因的3'端序列，该序列包括SPL基因的后个外显子（SEQ ID NO. :104、106)和两个内含子（SEQ ID NO. :103、105)以及终止子（SEQ ID NCX :108)，用 BamH I和Kpn I酶切后连入pSPL-Cas9-5'，得到pSPL-Cas9-53'。所得质粒用Xma I和Kpn I酶切后，连入pUBQ-Cas9-sgR，即得pSPL-Cas9-sgR载体。将合成的引物sgR-APl-S27/ A27和sgR-APl-S194/A194也按照上述方法连入pSPL-Cas9-sgR载体的Bsa I位点，即得 pSPL-Cas9-sgR-APl-27 和 pSPL-Cas9-sgR-APl-194。
[0205] psgR_Cas9_pl9 载体的构建
[0206] 含有Nco I位点的TBSV-pl9-2A基因由金唯智公司合成。将该基因片段用NcoI 酶切后插入psgR_Cas9载体的NcoI位点，用pl9-F和Cas9-378R引物鉴定片段的插入方向， 即得 psgR_Cas9_pl9 载体。
[0207] psgR-Cas9_MRSl/2 载体的构建
[0208] 分别合成引物 sgR-MRSl-S/A 和 sgR-MRS2_S/A。连入 psgR-Cas9_At 的 Bbs I 位 点，即得 psgR-Cas9-MRSl 和 psgR-Cas9-MRS2 载体
[0209] psgR-Cas9-MRSl/2_pl9 载体的构建
[0210] 分别合成引物 sgR-MRSl-S/A 和 sgR-MRS2-S/A。连入 psgR-Cas9-pl9 的 Bbs I 位 点，即得 psgR-Cas9-MRSl-pl9 和 psgR-Cas9-MRS2-pl9 载体
[0211] 1300-psgR-Cas9-pl9_APl/TT4 载体的构建
[0212] 分别合成引物 sgR-APl-S27/A27, sgR-APl-S194/A194, sgR-TT4-S65/A65 和 sgR-TT4-S296/A296。用 PNK 激酶将引物加磷，退火，连入 psgR-Cas9-pl9 的 Bbs I 位点，即得 psgR-Cas9-pl9-APl-27, psgR-Cas9-pl9-APl-194, psgR-Cas9-pl9-TT4-65 和 psgR-Cas9-pl9-TT4-296。用 AtU6_F_KpnI 和 SgR-R-EcoRI 引物分别扩增 psgR-Cas9-APl-194-pl9 和 psgR-Cas9-pl9-TT4-296,所得片段用 Kpn I 和 EcoR I 酶 切连入 psgR-Cas9-pl9-APl-27 和 psgR-Cas9-pl9-TT4-65,即得 psgR-Cas9-pl9-APl 和 psgR-Cas9-pl9-TT4。将这两个质粒用Hind III和EcoR I酶切，回收，连入pCAMBIA1300载 体，即得 1300-psgR-Cas9-pl9-APl 和 1300-psgR-Cas9-pl9-TT4 载体。
[0213] 基于同源重组的瞬时YF-FP报告系统分析
[0214] 在pA7-YFP的基础上构建了一个基于同源重组的瞬时YF-FP报告系统。pA7-YFP 载体图谱见图9,它以pUC18载体为骨架，在多克隆位点处插入了一个2X35S启动 子-EYFP-NOS终止子的完整表达盒。以pA7-YFP载体为模板，分别用表1中的两对引物 YF-FPlF和YF-FPlR与YF-FP2F和YF-FP2R通过PCR扩增的方法分别获得YFP基因的 l-510bp和229-720bp这两段编码序列，然后通过一个18bp的酶切接头（GGATCC ACTAGT GTCGAC) (SEQ ID NO. :103)或一个 55bp 的多重识别序列（MRS :ACTAGTTCCCTTTATCTCTTAG GGATAACAGGGTAATAG AGATAAAGGGAGGCCT) (SEQ ID NO. : 104)连接起来，并利用 XhoI/SacI 放回到ρΑ-YFP载体上以替换原来的YFP编码区。该载体的YFP编码区域在酶切接头两侧 有282bp的重叠区域。根据已经报道的方法制备拟南芥叶肉细胞原生质体和PEG转化转化 (Yoo et al.，2007)。转化后室温暗培养16-24小时的样品用流式细胞仪进行荧光检测。
[0215] 创建拟南芥和水稻稳定转基因植株
[0216] 将带有SpCas9完整表达盒和chiRNA完整表达盒的pCambial300载体转化到农杆 菌GV3101中。选取正在盛花期的健壮野生型Col-O植株用浸花法进行转基因 （Clough and Bent，1998)。正常护理转基因植株至收获种子，收到的Tl代种子，用5%次氯酸钠消毒后 10分钟后，无菌水漂洗4次，播撒在含20 μ g/L潮霉素或50 μ M卡那霉素的MSO培养基上筛 选。4°C放置2天后，移入12小时光照的培养箱中培养10天后，移栽到16小时光照的温室 中，继续培养。。通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得转基因植株（Hiei et al.，1994)。
[0217] 基因组修饰的酶切和测序分析
[0218] 提取潮霉素筛选获得阳性转化子的基因组DNA。用目标位点对应的引物进行PCR 扩增并回收。每个样品取大约400ng PCR回收产物用相应的限制性内切酶酶切过夜。酶切 反应用琼脂糖凝胶电泳（1. 2-2% )进行分析。对酶切后残留的未被切割的条带进行割胶回 收，连接到pZeroBack/blunt载体（天根生物，北京）中，对单克隆摇菌制备质粒后用M13F 引物进行桑格法测序分析。
[0219] 生殖细胞打靶的突变体鉴定
[0220] 对四种不同的转基因 Tl代群体，随机选取32个株系，分别在生长2周后和开花后 各选取1枚叶片和一个花序，用CTAB法提取DNA基因组。以AP1-F133/271R为引物，PCR 扩增目的基因片段并测序，突变体会从剪切位点起出生套峰。对于T2代的转基因群体，随 机选取8个发生突变的株系，各检测12个单株。将测序结果为套峰的PCR产物，进行TA克 隆，并挑取10个单克隆测序以确定突变基因的类型。
[0221] 含pl9蛋白的突变体鉴定
[0222] 对Tl代的1300-psgR-Cas9-pl9-APl/TT4转基因植物群体，各随机选取60个 株系，在生长2周后取1枚叶片，用CTAB法提取DNA基因组。分别以AP1-F133/271R和 TT4-F159/407R为引物，PCR扩增目的基因片段，电泳检测PCR的条带，统计发生片段确实植 物株系和相关的发育表型。
[0223] 原位杂交
[0224] 1.材料包埋：选用抽薹后的转基因植物的花序为材料，用4%的多聚甲醛固定12 小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。
[0225] 2.探针制备：Cas9基因以引物dCas9-F3_F/R扩增后，所得片段用PstI和BamHI 酶切连入PTA2载体。所得载体用Sal I线性化后，作为DNA模板，分别用T7和SP6RNA聚 合酶在体外转录出反义和正义的Biotin标记RNA探针（Roche, 11175025910)。产物经过 DNase I消化，碱裂和纯化后溶解于甲酰胺中保存。
[0226] 3.原位杂交按照文献报道的方法操作。（Brewer PB, Heisler MG, Hejatko J, Friml J, Benkova E (2006)In situ hybridization for mRNA detection in Arabidopsis tissue sections. Nat Protocl:1462-1467.)
[0227] Northern 杂交
[0228] 取开花期植物的花序，用Trizol法提取总RNA(Invitrogen)。每个样品上 样50 μ g，用15 %的PAGE胶分离目的RNA条带并用湿转法转移到硝酸纤维素膜上 (Hybond, Amersham)。紫外交联2分钟后，在杂交液（DIG EASY Hyb, Roche)中预杂交1小 时，加入20μΜ地高辛标记的人工序列探针（Invitrogen)，42°C杂交过夜。2XSSC，0.1% 的SDS洗膜两次，每次10分钟，0. I X SSC，0. 1 %的SDS洗膜两次，每次10分钟。用地高辛 检测试剂盒（Thermo Fisher)检测目的条带，压片15分钟后，用X光片显影。
[0229] Realtime PCR
[0230] 将提取的植物总RNA用DNase I (Takara)处理30分钟，酚氯仿纯化后，取5 μ g做 反转录（Takara)。产物稀释1倍后，取1 μ 1做模板，配置Realtime-PCR反应体系（Biorad)。 每个样品做三个重复，以ACTIN基因为内参，Col野生型为对照，用2-Λ ACt法计算基因表 达的相对变化。
[0231] 序列信息
[0232] 表1序列信息
[0233]

【权利要求】
1. 一种植物基因组定点修饰方法，其特征在于，包括步骤： (a) 将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞， 其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰（或待切割位点）的CRISPR RNA(crRNAs) 和反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)所构成的嵌合体（chimera);和 (b) 在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合 RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA 的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而 进行基因组定点修饰。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和 第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体 的； 其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件： 第一植物启动子； 与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列 的结构如式I所示： A-B (I) 式中， A 为编码 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列； B 为编码反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列； 表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成 一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和 RNA转录终止子； 第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件： 第二植物启动子； 与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的是N 端、C端或两侧与核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和 植物转录终止子。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一亚核酸构建物的数量为一个或者 多个（针对多个待切割位点），并与第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第二植物启动子和与所述所述Cas蛋 白的编码序列之间5'至3'还操作性相连有： 第三亚核酸构建物，较佳地，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒（TBSV) 的p 19蛋白编码序列；和 自剪切序列，较佳地，所述的自剪切序列为2A多肽编码序列（SEQ ID NO. : 98)。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点修饰包括： (i) 在没有供体DNA的情况下，对植物基因组特定位点进行随机插入和缺失；和 (ii) 在存在供体DNA的情况下，以供体DNA为模板，对植物基因组特定位点进行精确插 入、缺失或者替换DNA序列； 较佳地，所述定点修饰包括对植物基因组的基因敲除，基因敲入（转基因）以及调控 (上调或下调）内源基因的表达水平。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括单子叶植物、双子叶植物和 裸子植物； 较佳地，所述的植物包括林业植物、农用植物、经济作物、观赏植物。
7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第一植物启动子为RNA聚合酶III依 赖的启动子。
8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第二植物启动子为RNA聚合酶 II依赖的启动子，较佳地，包括组成型表达的启动子或拟南芥生殖细胞特异性表达的 sporocyteless(SPL)启动子。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：检测所述转化的植物细胞 中基因组的突变或修饰情况。
10. -种用于植物基因组定点修饰的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包括第 一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互 独立的，或是一体的； 其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件： 第一植物启动子； 与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列 的结构如式I所示： A-B (I) 式中， A 为编码 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列； B 为编码反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列； 表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成 一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和 RNA转录终止子； 第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件： 第二植物启动子； 与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的是N 端、C端或两侧与核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和 植物转录终止子。
11. 如权利要求10所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一亚核酸构建物和第二 亚核酸构建物是一体的。
12. 如权利要求10所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一亚核酸构建物的数量 为一个或者多个（针对多个待切割位点）。
13. -种载体，其特征在于，所述载体携带权利要求10所述的核酸构建物； 或一种载体组合，其特征在于，所述载体组合包括第一载体和第二载体，其中第一载体 携带权利要求10所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物，而第二载体携带权利要求10所 述的核酸构建物的第二亚核酸构建物。
14. 一种基因工程的细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求13中所述的载体或载 体组合；或所述的植物细胞的基因组中整合有权利要求10所述的核酸构建物。
15. -种制备植物的方法，其特征在于，包括步骤： 将权利要求14所述的植物细胞再生成形成植株。
【文档编号】C12N5/10GK104293828SQ201410334460
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】朱健康, 毛妍斐, 冯争艳, 张波涛 申请人:中国科学院上海生命科学研究院