一种耐辐射曲霉及其在吸附铯137生物处理中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐辐射曲霉及其在吸附铯137生物处理中的应用。通过某地区取样，筛选、分离、筛选、生理生化鉴定获得曲霉（Aspergillussp.）F77CGMCCNo.8382，利用该菌在吸附铯生物处理中的应用，对Pb2+、Zn2+，Ni+的耐受浓度最大，分别可达1000mg/L和500mg/L，500mg/L；对Co2+，Cr2+，Hg2+的耐受性次之，都可达200mg/L通过本法可以利用菌体的生长吸附铯离子，和放射性铯，也可以直接使用干菌体吸附，最大吸附能力可达44.5mg/g干菌体，应用该菌种吸附Cs137生物处理中的应用具有现实的价值和作用。
【专利说明】一种耐辐射曲霉及其在吸附铯137生物处理中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物菌种应用于生物吸附放射性核素【技术领域】，具体的，本发 明涉及一种耐辐射曲霉及其在放射性核素吸附中应用的【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 城市化、工业化及人口增长造成全球性能源危机，可持续发展需求使得人类越来 越依赖于新能源。核能以其极低的二氧化碳排放和巨大的发展潜力而越来越受到众多国家 的重视。核能高速发展的同时，也给全球环境造成巨大的压力，使放射性污染成为当前重大 的环境问题之一，特别是以切尔诺贝利和日本福岛核电站为代表的核事故向环境释放了大 量的放射性污染物，造成当地及周边环境严重的放射性污染，对生态环境和人类健康造成 长期巨大的潜在威胁。
[0003] 作为生态系统的重要组成部分，微生物种群数量大、分布广、比表面积大、繁殖快， 对环境变化的适应能力强，对放射性辐射表现出高度的耐受性。利用生物作用清除、修复和 治理放射性污染具有选择性强、处理时间短、成本低，不造成二次污染和不破坏生态环境等 优点，近年来已成为放射性污染治理的热点研究技术之一。
[0004] 铯137(Cs137)是重要的裂变产物之一，也是核弹、核武器试验和核反应堆内核裂 变的副产品之一，其半衰期较长，具有较高的迁移性，易通过生物链转移造成辐射危害，它 会释放伽玛射线，在环境放射性污染修复中备受关注。铯137的半衰期较长达30年，会在 环境或生态系统中存留、积累和迁移，造成严重的环境污染和生态危害。如果透过进食或呼 吸，摄入了铯137,或受到沉降在地面上的铯137所照射，都会对身体有较持久的影响。
[0005] 在治理放射性环境污染方面，传统方法是工程法、化学法。工程法是物理性地收集 和隔离放射性物质的方法，化学法是采用特殊的化学品来固定和清除放射性污染。上述方 法虽然已得到成功的应用，如日本的广岛和长崎两个城市、马绍尔群岛共和国的比基尼环 礁核试验场和澳大利亚的马拉林加核试验场的修复与重建，但其成本很高，难以用于大面 积辐射区的修复，因此，工程与化学的方法局限性很大。生物修复是利用特殊的生物富集和 固定放射性污染物的方法，主要是微生物和植物，特别是微生物功能利用最受关注，因其 成本低，适合于大面积修复，因而生物修复放射性污染成为当前研究的热点。
[0006] 研究表明：微生物不仅可通过溶解和沉淀、生物吸附和吸收、氧化还原等作用来治 理环境中的放射性核素污染，并且可以通过改变植物根际微环境，从而提高植物对重金 属离子和放射性核素的吸收、挥发或固定的效率。相关的研究也取得了积极进展，如 分ite[1]等研究证明放射性核素铀（U)在土壤中的迁移率受环境中微生物及环境因子的影 响，研究表明Fe(III)还原菌的增生有利于包括U在内的重金属离 子由土壤向地下水迁移。C?和ft [3]等的研究表明，细菌菌群可促使可溶态U (VI)向稳定的U (IV)转化，等研究显示硫酸盐还原菌可固定U，β9/7^--5·?〇/7θ[5] 等分离获得可大量积累137CS、238+239+24°Pu等放射性核素的微生物菌株，Hu [6]等的研究表明 许多微生物都能吸附 U，如 aerwgiflosa CSZ/MpergiBiAs /應/辟 和 等研究发现施用AM菌根菌可促进行植物对137Cs、9°Sr 的积累，希瓦氏菌MR-1，可以有效将可溶性U6+、Cr6+和Tc7+还原为不溶性U 5+、 Cr3+ 和 Tc4+。
[0007] 利用微生物修复放射性环境污染已经有成功的例子，CroW￡/e/8]在2001年利用土 著微生物对保加利亚南部含有放射性元素铀、镭和钍同重金属铜、镉和铅污染土壤，进行 原位修复，经过8个月的时间，污染物的水平下降到人体安全范围。
[0008] 利用微生物修复放射性的污染环境必须考虑到以下两个方面：第一，必须是强耐 辐射的微生物；第二，微生物修复环境时不能威胁到公共安全，也不能产生二次污染。由 于大多数的细菌对放射性比较敏感，因此它们修复放射性污染环境的能力会受到较大的限 制。因此，需要从自然环境中去分离具有辐射抗性的微生物，或者通过基因工程技术来改造 一些微生物使之获得辐射抗性。目前尚无有关耐辐射曲霉及其在放射性核素吸附中应用的 报导。
【发明内容】
[0009] 针对目前国内外尚无关于耐辐射曲霉及其在放射性核素吸附中应用的相关报道， 特别是没有耐辐射曲霉在铯生物处理中的应用相关报道。本发明目的旨在于提供一种 耐辐射曲霉及其在吸附Cs 137生物处理中的应用，特别是本发明提供一种利用耐辐射曲霉 5/7. )F77 CGMCC No. 8382在吸附铯生物处理中的应用。
[0010] 本发明采用的主要技术方案： 本发明从新疆巴音郭楞蒙古自治州地区污染环境中取样，以不同的培养温度、pH值、培 养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F77的菌株， 经过微生物菌种的生理生化特性、菌落形态、菌种的分子水平等系列试验验证确定，该菌种 是一种耐福射曲霉(As/76?r^77A/5· 5/7. )F77,经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（CGMCC)保藏，获得保藏号为CGMCC No. 8382,利用该菌种在放射性铯生物处理中 应用，通过试验证明该菌种耐福射曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382对于Ni+， Cr2+'、Zn2+、Co2+、Pb2+、Hg 2+六种离子均具有耐受特性，其中对Pb2+、Zn 2+,Ni+的耐受浓度最 大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L;对Co2+，Cr2+，Hg2+的耐受性次之，都可达 200 mg/L ;特别是在放射性核素铯吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌 种在吸附铯生物处理中具有良好的的应用前景。
[0011] 本发明具体提供一种利用曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382。本发明 所使用的曲霉5/7.)由新疆农业科学院微生物应用研究所从新疆巴音郭楞 蒙古自治州地区某地放射性污染土壤中取样分离，以不同的培养温度、pH值、培养基为富 集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F77的菌株于申请日 前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编：100101,保藏日期是2013年10月22日，保藏号是CGMCC No. 8382;该菌株培养 温度28-30°C，最适培养温度28°C左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄 糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经28°C、48h培养，将菌种F77通过插片和水压片的 镜检观察，该菌株初生菌丝白色，呈疏松绒毛状，分隔，菌落表面粽叶绿色。孢子梗和孢子 同色，孢子近圆形，成串着生在膨大的孢子梗顶端周围，呈放射状分布，无分生小梗。根据 以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目丛梗孢科单梗曲霉属的一个种。参照 《真菌鉴定手册》进行鉴定，结合对F77菌株进行形态学，生理生化鉴定，命名为耐辐射曲霉 {.Aspergillus sp. )〇
[0012] 该菌株曲霉577. ) F77在PDA培养基，Wort培养基生长良好，经 Biolog FF鉴定板试验证明F77可以利用吐温80, N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿 拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，D-木糖，苹果酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸， a-D-葡萄糖，D-甘露醇，β-甲基-D-葡萄糖苷，6-0-D-吡喃葡萄糖酰，D-呋喃果糖，D-葡 萄醛酸，丙三醇，肝糖，麦芽三糖，奎尼酸，L-谷氨酸，腺苷-5 -磷酸盐，a-D-葡萄糖-1-磷 本盐，D-核糖，水杨苷，D-山梨醇，L-山梨糖，水苏糖，K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y-氨基丁 酸，溴代琥珀酸，反丁烯二酸，β_羟基丁酸，y_羟基丁酸，P-羟苯乙酸，a-酮戊二酸，D-苹果 酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨 基乙酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦谷氨酸， L-丝氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。
[0013] 本发明通过总DNA的提取、ITS1基因的PCR扩增和测序，根据测序结果，用Blast 搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关菌株的ITS1基因序列，用 CLUSTAL X进行多序列比对，并采用Saitou和Nei的邻接法用MEGA 5. 0软件进行系统进化树的构建和同源性比较。经测定，耐福射曲霉577. )F77 CGMCC No. 8382 的 ITS1 基因序列为 600bp。
[0014] 通过上述结果及ITS1基因同源分析、系统发育分析结果，将纯化的菌株耐辐射曲 霉Usper价7ΛΛ5沙.）F77 CGMCC No. 8382进行系统进化树的构建及多样性分析，菌种编 号为F77与/Yaras PT18同源性最高，但两者还存在明显的差异，显 示不同属性的菌种，本发明将菌种编号为F77菌株鉴定为曲霉5/7.)。
[0015] 同时，本发明具体提供一种利用耐福射曲霉5/7. ) F77 CGMCC No. 8382进行放射性铯生物处理中应用技术方案：分别在含有10mg/L的稳定铯离子的PDA培 养基中加入lml (6772. 95贝克）放射性铯母液，和2ml (13545. 9贝克）放射性铯母液，接 种F77,培养至最适的生长时间，收集样品。分别通过ICP-MS和液闪测定菌株在生长过程中 对稳定性铯和放射性铯的吸附。通过试验表明，菌种F77对于放射性铯存在下，对稳定的铯 的吸附率明显下降，只有19. 3%，而在一倍放射性铯和两倍放射性铯存在下，对稳定性铯吸 附率差异不大，对于放射性铯的吸附率差异也不大，都达40%以上。
[0016] 本发明所用的菌株曲霉沙.）F77 CGMCC No. 8382对其中对Pb2+、 Zn 2+，Ni+的耐受浓度最大，分别可达 1000 mg/L 和 500 mg/L，500 mg/L;对 Co2+ Cr2+，Hg2+ 的耐受性次之，都可达200 mg/L ;在放射性核素铯吸附中应用获得显著明显的技术效果，从 而证明了该菌种在吸附铯生物处理中具有良好的的应用前景。
[0017] 本发明进而提供耐福射曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382的分离和培 养方法。
[0018] 1.分离培养基采用：PDA培养基。
[0019] 2.分离和筛选条件：采取梯度稀释法，称取10g 土壤样品于90mL无菌生理盐水 中，30 ° C活化30min后进行梯度稀释，选取10' 10' ΚΓ4稀释液分别涂布于分离培养基淀 粉PDA培养基平板，每个处理3个重复，置30° C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色 等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。
[0020] 经培养筛选确定的耐辐射曲霉取）F77 CGMCC No. 8382在PDA 培养基上菌株菌丝疏松绒毛状，分隔，菌落表面粽叶绿色。可以利用吐温80, N-乙酰 基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，D-木糖，苹果 酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸，a-D-葡萄糖，D-甘露醇，β-甲基-D-葡萄糖苷，6-0-D-吡 喃葡萄糖酰，D-呋喃果糖，D-葡萄醛酸，丙三醇，肝糖，麦芽三糖，奎尼酸，L-谷氨酸，腺 昔 _5'一憐酸盐，a_D_匍萄糖-1-憐本盐，D-核糖，水杨昔D-山梨醇，L-山梨糖，水苏糖， K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y_氨基丁酸，溴代琥珀酸，反丁烯二酸，β_羟基丁酸，y_羟基丁 酸，P-羟苯乙酸a-酮戊二酸，D-苹果酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯， L-丙胺酸酰胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，甘氨酰-L-谷氨 酸，L-苯基柄氨酸脯氨酸，焦谷氨酸，L-丝氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。
[0021] 通过实施本发明具体的技术方案，实现本
【发明内容】
达到以下有益效果： 本发明提供的耐辐射曲霉Usper价7ΛΛ5沙.）F77 CGMCC No. 8382及其在铯离子吸附 中的应用，Ni+，Cr2+，、Zn2+、Co2+、Pb2+、Hg 2+六种离子均具有耐受特性，其中对Pb2+、Zn 2+，Ni+ 的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L;对Co2+，Cr2+，Hg2+的耐受性 次之，都可达200 mg/L通过本法可以利用菌体的生长吸附铯离子，和放射性铯，也可以直接 使用干菌体吸附，最大吸附能力可达44. 5mg/g干菌体。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1所示为曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382的菌落形态水压片图。
[0023] 图2所示为曲霉5/7. ) F77 CGMCC No. 8382系统发育树状图。
[0024] 图 3 曲霉 5/7. ) F77 CGMCC No. 8382 对酸度的耐受性图。
[0025] 图4曲霉（Aspergillus sp. )F77 CGMCC No. 8382吸附时间对铯吸附行为的影响 图。
[0026] 图5曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382铯初始浓度对吸附效果的影响 图。
[0027] 图6曲霉（Aspergillus sp. ) F77 CGMCC No. 8382吸附等温式拟合曲线图。
[0028] 图7钾对曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382生长和吸附铯的影响图。
[0029] 图 8 曲霉 5/7. ) F77 CGMCC No. 8382pH 对吸附效果的影响图。
[0030] 图9不同菌体量对曲霉5/7. ) F77 CGMCC No. 8382吸附铯离子的 影响图。
[0031] 图10吸附时间对于对曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382吸附铯离子 的影响图。
[0032] 图11温度对曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382菌体对铯离子吸附的 影响图。
[0033] 图12曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382对稳定铯和放射性铯的吸附 率图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而 不用于限制本发明要求保护的范围。
[0035] 本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备： 培养基选用：PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然。
[0036] 主要仪器与试剂：MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1F B型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-KKLPCR仪Eppendorf No:5345,电 泳仪 Bio-Rad Mode 200/2.0,凝胶成像仪 United-Bio, GK-330C plus，PCR 预混液（TaKaRa Biotechnology),其余试剂均为分析纯。超声波破碎仪为美国Sonics，VC 130。Xseries II 型电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)，美国THERMO公司；Seven Easy Plus S20P型精密pH 计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学 仪器有限公司；THZ-82气浴恒温振荡箱，江苏金坛诚辉仪器厂；GMSX-280压力蒸汽灭菌器， 北京永光明医疗仪器有限公司。试剂均为分析纯，水为超纯水，18.2 ΜΩ ?cm。
[0037] 本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0038] 实施例一：曲霉 取）F77CGMCC No. 8382 的分离、培养 1.分离：本发明所使用的耐福射曲霉5/7. )F77由新疆农业科学院微生 物应用研究所从新疆巴音郭楞蒙古自治州地区某地放射性污染土壤中取样分离，利用传统 的平板培养法分离出土层中的微生物，平板划线法纯化菌株，以不同的培养温度、pH值、培 养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F77的菌株。
[0039] 分离步骤：依据梯度稀释法，称取10g 土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30° C于 恒温振荡箱活化30min后进行梯度稀释，选取1(Γ2、10' ΚΓ4稀释液分别涂布于PDA培养基 的平板，每个处理3个重复，置30° C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌 落分别划线接种于新的分离培养基PDA培养基，直至无杂菌落。将纯化后的菌株一部分采 用冻干安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4° C直接用于后续研究。
[0040] 2.培养条件：将纯化的菌株接种到马铃薯固体培养基斜面上，于30°C培养6天，放 入4 °C冰箱中保存备用。
[0041] 具体的：该菌株培养温度28-30°C，最适培养温度30°C左右；该菌种生长于PDA培 养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经30°C、48h培养。
[0042] 本发明所使用的耐福射曲霉(Aspergi/AAs· 57?. ) F77菌株已保藏于布达佩斯条约 微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期 为2013年10月22日，菌种保藏号为CGMCC No. 8382,该菌株培养温度28-30°C，最适培养 温度30°C左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水 IL，pH自然，经30°C、48h培养。菌种F77通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌丝 白色，疏松绒毛状。孢子堆粽叶绿色，孢子近圆形，成串着生在膨大的孢子梗顶端四周，成放 射状分布，无分生小梗。参见附图1。根据以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗 孢目丛梗孢科单梗曲霉属的一个种。参照《真菌鉴定手册》进行鉴定，结合对F77菌株进行 形态学，生理生化鉴定，命名为曲霉5/7.)。
[0043] 该菌株曲霉5/7. ) F77在PDA培养基，Wort培养基生长良好，经 Biolog FF鉴定板试验证明F77可以利用吐温80, N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿 拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纤维二糖，D-木糖，苹果酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸， a-D-葡萄糖，D-甘露醇，β-甲基-D-葡萄糖苷，6-0-D-吡喃葡萄糖酰，D-呋喃果糖，D-葡萄 醛酸，丙三醇，肝糖，麦芽三糖，奎尼酸，L-谷氨酸，腺苷-5 ζ -磷酸盐，a-D-葡萄糖-1-磷 本盐，D-核糖，水杨苷，D-山梨醇，L-山梨糖，水苏糖，K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y-氨基丁 酸，溴代琥珀酸，反丁烯二酸，β_羟基丁酸，y_羟基丁酸，P-羟苯乙酸，a-酮戊二酸，D-苹 果酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰胺，L-丙胺酸，L-丙胺 酰氨基乙酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦谷 氨酸，L-丝氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。结果见表1。
[0044] 表1 :温度、pH等因素对菌株F77生长的影响_
【权利要求】
1. 一种曲霉5/7. )F77,其特征在于，所述的曲霉dpergiBiAs 5/7. )F77 保藏编号为CGMCCNo. 8382。
2. 如权利要求1所述的曲霉(As/76?r^77A/5· 5/7. )F77在在放射性核素吸附中应用。
3. -种利用耐辐射曲霉5/7. )F77 CGMCC No. 8382在吸附铯生物处理 中的应用。
【文档编号】C12R1/66GK104087519SQ201410334312
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】王玮, 王卫宪, 张志东, 谢玉清, 张丽娟, 徐辉, 顾美英, 朱静, 唐琦勇, 宋素琴, 王耀琴, 楚敏 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所