一种利用新mva途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞，本发明旨在通过对传统甲羟戊酸途径进行改造，通过表达外源的脱羧酶及脱羟基酶基因，使传统利用MVA途径合成异戊二烯的总代谢途径由8步酶催化反应缩短为5步反应，建立一条新的生物合成异戊二烯的方法，从而获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3-丁烯-1-醇脱羟基酶对应的编码基因的重组细胞。该重组细胞能够从乙酰辅酶A合成异戊二烯，从而建立一条新的利用可再生资源葡萄糖为原料的生物催化生产异戊二烯的方法。
【专利说明】—种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及利用生物法制备异戊二烯化合物的方法，具体涉及一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用。
【背景技术】
[0002]异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶。另外，异戊二烯还可用在医药农药中间体、合成润滑油添加剂、橡胶硫化剂和航空燃料等方面，其开发利用前景十分广阔。
[0003]目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。
[0004]生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戍二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。
[0005]微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
【发明内容】
[0006]本发明的发明目的是提供了一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用，本发明对传统甲羟戊酸途径进行改造，建立一条合成异戊二烯新代谢途径的方法，在重组细胞体内，通过基因工程的手段过表达甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3-丁烯-1-醇脱羟基酶，将MVA转化为目标产物异戊二烯，从而建立一条新的异戊二烯生物合成途径。
[0007]为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现:
[0008]一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，它包括以下步骤:
[0009]I)依次构建分别含有mvaS基因、mvaE基因、01θ?\ε基因和OhyAffl基因的载体pGH-mvaS、pGH-mvaE、pGH-01eTJE 和 pGH_0hyAEM ；
[0010](2)构建载体 pACY-mvaE-mvaS ;将所述载体 pGH-Olel^ 与载体 pCOLADuet-Ι 分别用BamHI和SacI进行双酶切，酶切后的载体与01eTjE基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pC0LA-01eT1E ；
[0011]扩增基因01θ?\ε片段，将载体PBAD18与基因01eTJE片段分别用NheI和SacI进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的01eTjE基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pBAD-01eT1E ；
[0012]扩增基因OhyAffl片段，将pCOLADuet-Ι载体与基因OhyAffl片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与OhyAffl基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒PCOLA-OhyAffl ；
[0013]所述PGH-OhyAffl与所述pC0LA-01eI\E分别用BglII和XhoI进行双酶切，酶切后的载体pC0LA-01eT1E与外源基因片段OhyAffl按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pC0LA-01eI\E-0hyAEM ；
[0014]所述pC0LA_01eT1E_0hyAEM 和 pET_28a (+)载体分别用 BamHI 和 XhoI 酶切，酶切后载体和基因片段01eI\E-0hyAEM连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28-01eTJE-0hyAEM ；
[0015]扩增OhyAffl片段，将载体pBAD-01eI\E与基因OhyAffl片段分别用SalI和HindIII进行双酶切，酶切后载体与两端带有相应酶切位点的OhyAffl基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pBAD-01eT1E-0hyAEM ；
[0016](3)将载体 pACY-mvaE-mvaS 分别和重组质粒 pC0LA-01eTJE_0hyAEM、重组质粒PET28-01eTJE_0hyAEM和重组质粒pBAD-01eTjE-0hyAEM共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，分别获得阳性克隆YJM32工程大肠杆菌、YJM33工程大肠杆菌和YJM34工程大肠杆菌；
[0017](4)活化后的上述工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素或氨苄霉素的LB液体培养液中培养，当OD6tltol为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂至终浓度0.5mmol.L—1，然后转入在30°C下继续诱导培养24h，发酵获得异戊二烯。
[0018]本发明还提供了一种合成异戊二烯的重组细胞，所述重组细胞包含对应编码产生乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3-丁烯-1-醇脱羟基酶的基因，该重组细胞能够从葡萄糖合成异戊二烯。
[0019]本发明还提供了所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物和组合物包括:异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
[0020]本发明中利用新MVA途径合成异戊二烯的方法与传统MVA途径相比其优点在于:传统的通过MVA途径合成异戊二烯需要经过8步酶催化反应，即包括如下酶:乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5- 二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶。而本发明是从乙酰-CoA至异戊二烯的生物合成途径缩短为5步反应，即需要如下5种酶催化乙酰-CoA转化为异戊二烯:乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3-丁烯-1-醇脱羟基酶。本发明具有以下优点:
[0021](I)MVA脱羧反应和其后的脱羟基反应均无需进行磷酸化反应；
[0022](2)脱羧反应生成的CO2会溶于水，促使平衡反应向右进行；
[0023](3)从反应的吉布斯自由能方面来看，甲羟戊酸至3-甲基-3- 丁烯-1-醇反应的自由能变化为AG =-4.8477Kcal/mol,属于放能不可逆反应(当AG = -3.5Kcal/mol时，反应即为不可逆反应)；
[0024](4)下游途径(MVA至异戊二烯)的反应步骤由原先5步反应缩短为2步，减少3步反应，更有利于代谢途径后续调控及转化效率的提高。
[0025]本发明主要通过基因工程的手段，在细胞中过表达乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3- 丁烯-1-醇脱羟基酶，获得的重组细胞含有表达上述酶的基因，该重组细胞能够从乙酰辅酶A合成异戊二烯。最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种高效的异戊二烯生物合成代谢途径，获得了可以高效合成异戊二烯的重组细胞，从而建立一条新的利用可再生资源葡萄糖为原料的生物催化剂生产异戊二烯的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是本发明中新MVA途径的改造示意图。
[0027]图2是本发明中pYJM33的质粒图谱。
[0028]图3是本发明中PYJM34的质粒图谱。
[0029]图4是本发明中PYJM35的质粒图谱。
[0030]图5表明本发明中01eTJE和OhyAffl蛋白表达水平对异戊二烯生产的影响。
[0031]图6表明本发明中工程菌YJM33产异戊二烯的时间曲线。
【具体实施方式】
[0032]下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。
[0033]实施例1
[0034]如图1所示，本发明通过在大肠杆菌中共同过量表达来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶(mvaE)、3_轻_3_甲基戍二酰辅酶A合酶和轻甲基戍二酰辅酶A还原酶(mvaS);来源于嗜冷咸海鲜菌(Jeotgalicoccussp.ATCC8456)甲羟戊酸脱羧酶(01eTJE)和来源于脑膜炎脓毒性黄杆菌(Elizabethkingiameningoseptica)的3-甲基_3_ 丁烯-1-醇脱羟基酶(OhyAffl),利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成异戊二烯。
[0035]本发明中所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因来源于以下其中一种:1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: BK006949.2)、或 2)来源于其它细菌，优选幾肠球菌(Enterococcus faecalis) (GenBank: AAG02438.2)、金黄色酿胺葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:AIA26811.1)、褐杆菌(Phaeobacter inhibens)(GenBank: AF090074.1)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator) (GenBank: AEI82514.1)、大肠杆菌(Escherichia coli) (GenBank:ADX49537.1)、酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:NP_607695.1);或3)来源于其它生物体，和乙酰辅酶A酰基转移酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0036]所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因可以来源于:1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: YM4987.09C);或 2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis) (GenBank:EEU26497.1)，金黄色酿胺葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (GenBank:YP_501316.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:AAG02443.1)，魏氏利斯特菌(Listeria welshimeri) (GenBank:YP—849629.1)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) (GenBank:AAL97584.1);或3)来源于其它生物体，和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0037]所述轻甲基戊二酰辅酶A还原酶基因来源于:I)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) (GenBank:YLR450W);或2)来源于其它细菌，优选类肠球菌(Enterococcusfaecalis) (GenBank:ESU74184.1)，金黄色酿胺葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank: AAG02423.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium) (GenBank: AGS75052.1)，酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes) (GenBank:AAL97583.1);或3)来源于其它生物体，和轻甲基戊二酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0038]所述甲羟戊酸脱羧酶基因是来源于:1)来源于细菌，优选嗜冷咸海鲜菌(Jeotgalicoccus sp.ATCC8456)脂肪酸脱羧酶(fatty acid decarboxylase,GenBank:ADW41779.1)，或枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Cytochrome P450 酶(GenBank:NP—388092)，或嗜酸球菌(Picrophilus torridus)甲轻戊酸焦憐酸脱羧酶(Mevalonate diphosphate decarboxylase，GenBank: AAT43941)，或 2)来源于其它真核生物，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲轻戊酸焦憐酸脱羧酶(Mevalonatediphosphate decarboxylase,GenBank:X97557.1)，或3)来源于其它生物体，和甲轻戊酸脱羧酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0039]所述3-甲基-3-丁烯-1-醇脱羟基酶基因是来源于:1)来源于细菌，优选脑膜炎胺毒性黄杆菌(Elizabethkingia meningoseptica)的油酸水合酶(oleatehydratase, GenBank:ACT54545.1)，或 2)来自干酷乳杆菌(Lactobacillus casei)的油酸水合酶(oleate hydratase，GenBank:CCK21440.1)，或 3)来自李斯特菌(Listeriamonocytogenes)油酸水合酶(oleate hydratase, GenBank: CC063090.1)，或 4)来源于其它生物体，和3-甲基-3- 丁烯-1-醇脱羟基酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0040]1.外源基因的克隆
[0041]1.1粪肠球菌MVA上游代谢途径基因的克隆
[0042]选取来自于类肠球菌(Enterococcusfaecalis)的mvaS 基因(GenBank:EEU26497.1)和mvaE基因(GenBank:AAG02438.2)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后分别与载体PGH(购自上海捷瑞生物工程有限公司)连接获得pGH-mvaS，pGH_mvaE。
[0043]1.2嗜冷咸海鲜菌01eTJE基因的克隆
[0044]选取来自嗜冷咸海鲜菌(Jeotgalicoccus sp.)的甲轻戊酸脱羧酶的OleI^基因(GenBank:ADW41779.1)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得，之后与载体pGH连接得到 pGH-01eTJE。
[0045]1.3脑膜炎脓毒性黄杆菌0hyAEM基因的克隆
[0046]选取来自脑膜炎脓毒性黄杆菌(Elizabethkingia meningoseptica)的3_甲基-3- 丁烯-1-醇脱羟基酶的OhyAffl基因(GenBank ACT54545.1)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后与载体PGH连接得到pGH-0hyAEM。
[0047]2.表达载体的构建
[0048]2.lpYJM16载体的构建
[0049]pYJM16 载体(即载体 pACY-mvaE-mvaS)构建参照文献获得(Yang J, Xian M, SuS，Zhao G, Nie Q,et al.(2012)Enhancing product1n of b1-1soprene using hybridMVA pathway and isoprene synthase in E.col1.PloS one7:e33509.)。
[0050]2.2pYJM30载体的构建
[0051]将所述载体pGH-Olel^ 与载体 pCOLADuet-1 (Invitrogen 公司)分别用 BamHI 和SacI进行双酶切，将酶切后的载体与外源基因片段(01eTjE)按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5a，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR扩增筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取出重组质粒pYJM30(pC0LA-01e!\E)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0052]2.3pYJM31载体的构建
[0053]利用下列引物01eT-F(5’ -CTAGCTAGCGGCAACACTTAAGAG GGATAAG-3’ )和 01eT_R(5’ -CTAGGAGCTCTTATGTTCTGTCTAC AAC-3’ )和质粒 pGH_01eT1E 为模板扩增 01eT1E 片段(两端带有与载体连接的相应酶切位点)。
[0054]将pBAD18载体(Invitrogen公司)与基因01eTJE片段分别用NheI和SacI进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的01eTjE基因片段按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5a，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR扩增筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM31 (pBAD-01eI\E)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0055]2.4pYJM32载体的构建
[0056]利用下列引物ohya-F (5，-CGCGGATCCGAACCCGATCACC TCTAAATTCG-3’ )和ohya-R (5，-CCCAAGCTTTTAACCACGGA TACCTTTAACCCA-3’ )和质粒 pGH_0hyAEM 为模板扩增基因OhyAffl片段。将pCOLADuet-Ι载体与基因OhyAffl片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段OhyAffl按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5a，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒PYJM32 (pC0LA-0hyAEM)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0057]2.5pYJM33载体的构建
[0058]如图2所示，将所述载体pGH-0hyAEM与所述pYJM30 (pC0LA-01eTJE)分别用BglII和XhoI进行双酶切，酶切后的载体PYJM30与外源基因片段OhyAffl按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5 a，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM33 (PC0LA-01eTJE-0hyAEM)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0059]2.6pYJM34载体的构建
[0060]如图3所示，利用BamHI和XhoI酶切所述pYJM33 (PC0LA-01eTJE_0hyAEM)获得基因片段01eI\E-0hyAEM，随后用上述相同BamHI和XhoI酶酶切pET_28a(+)载体，将胶回收后的01eI\E-0hyAEM基因片段与经相同酶切割的pET-28a(+)载体片段按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5a，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM34(pET28-01eTJE-0hyAEM)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0061]2.7pYJM35载体的构建
[0062]如图4 所示，利用下列弓丨物 ohya-Fl(5’-ACGCGTCGACGAACCCGATCACCTCTAAATTCG-3’ )和 ohya-R(5，-CCCAAGCTTTTAACCACGGA TACCTTTAACCCA-3’)和质粒PGH-OhyAffl为模板扩增OhyAffl片段(两端带有与载体连接的相应酶切位点)。
[0063]将pYJM31 (pBAD-01eTJE)载体与基因 OhyAffl 片段分别用 SalI 和 HindIII 进行双酶切，酶切后的载体与两端带有与载体连接的相应酶切位点OhyAffl基因片段按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5 α，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒PYJM35 (PBAD-01eTJE-0hyAEM)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0064]3.E.coli重组菌株的构建
[0065]将pYJM16 (pACY-mvaE-mvaS)和 pYJM33 (pC0LA-01eTJE_0hyAEM)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得YJM32工程大肠杆菌。
[0066]将pYJM16 (pACY-mvaE-mvaS)和 pYJM34 (PET28-01eTJE_0hyAEM)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得YJM33工程大肠杆菌。
[0067]将pYJM16 (pACY-mvaE-mvaS)和 pYJM35 (PBAD-01eTJE-0hyAEM)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氨苄青霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得YJM34工程大肠杆菌。
[0068]本发明获得的重组细胞包含下述基因片段:乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3-丁烯-1-醇脱羟基酶的编码基因，该重组大肠杆菌能够从葡萄糖合成异戊二烯。
[0069]所述的重组细胞为细菌细胞，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或真菌细胞(如酿酒酵母)，或微藻等通过基因工程技术构建而成的。
[0070]所述的重组细胞可以用于制备化合物或组合物，所述化合物和组合物包括:异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯一异戊二烯一苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
[0071]4.工程大肠杆菌的培养
[0072]将构建好的重组质粒转化到感受态细胞中，通过摇瓶发酵和发酵罐发酵两种方法对重组菌进行发酵培养，利用气象色谱技术对发酵产物进行定性和定量的检测。
[0073]将活化后的上述工程大肠杆菌按1:100的比例接种到含有卡那霉素、氯霉素或氨苄霉素的LB液体培养液中，37°C，180rpm条件下振荡培养，当OD6tltlnm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol.L—1，或诱导剂乳糖至终浓度0.5mmol. 1然后转入在30°C，180rpm条件下，继续培养。当工程菌株诱导24h后，取顶空气体1ml，利用GC定量检测。
[0074]5.工程菌发酵试验
[0075]挑取单克隆到50ml M9 种子培养基(1L M9salts:20g Glucose,6g Na2HPO4,3g KH2PO4, Ig NH4Cl70.5g NaCl，0.24g MgSO4,121 °C 高压蒸汽灭菌 15min。)中，37°C，180rpm活化过夜(18_24h)。将种子按10 %的接种量接种至含有2L发酵培养基(19.6gK2HPO4.3H20 ；4.2g Citric acid.H2O ；0.6g 柠檬酸铁铵；0.8ml 浓硫酸；40g 葡萄糖，(NH4)6Mo7O24.4Η200.123mg ；ZnSO4.7Η200.097mg ；H3BO40.823mg ；CuSO4.5Η200.083mg ；MnCl2.4Η200.527mg, 4mllM MgSO4,1900ml 蒸馏水)的 5L 小型发酵罐中，通气量 1.3VVM，转速400rpm，37°C培养至OD6tltl约为12时，0.5mM IPTG，37°C诱导表达，以氨水调pH，控制pH在7.0，每隔811补加一次1?16。得到的异戊二烯产物通过GC对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中残余葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓度为800g/L的糖液，维持残糖浓度在0.5g/L以下。每4h取发酵液5ml，测定细胞0D_、葡萄糖浓度；每151^11取尾气Iml,利用气相色谱检测产物异戊二烯浓度。直到OD不再变化，产物不再产生为止。
[0076]检测条件:GC系统采用山东鲁南瑞虹SP-6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-1NNOffAX column(25mX250ymX0.2 μ m)，检测器为 FID 检测器；气化室温度 200°C，检测器温度230°C，载气流速:lml/min.
[0077]柱升温程序为:50°C保温0.5min，
[0078]4°C /min 升至 70 O，
[0079]25 °C /min 升至 250 °C,保温 5min。
[0080]实验结果如图5和图6所示。图5表明，当01θ?\ε和OhyAffl在了7启动子表达下(YJM33工程大肠杆菌)会比在araBAD启动子表达下获得更多的异戊二烯，采用T7启动子、高等拷贝数质粒的YJM33获得最高的目标产物产量(52.2 μ g/L)。图6表明，工程菌YJM33的异戊二烯产量()和细胞生长(▲)。当工程菌细胞生长12h开始进行诱导培养。
[0081]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于它包括以下步骤: (O依次构建分别含有《心？基因基因、似##基因和泌7&基因的载体pGH~fflFa5\ pGH-fflKai?> ^GW-OleTje 和 PGH-OAjAmf ； (2)构建载体;将所述载体pGH-0/eT^与载体pCOLADuet-Ι分别用BamHI和SacI进行双酶切，酶切后的载体与OleTJE基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOLA-O/eT^ ； 扩增基因OleTjs片段，将载体pBAD18与基因OleTje片段分别用NheI和SacI进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒卿-01eTJE ； 扩增基因OhyAw片段，将pCOLADuet-Ι载体与基因OhyAm片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与泌7^#基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOLA-^Wi ； 所述与所述pCOLA-O/eT^分别用Bgl 11和XhoI进行双酶切，酶切后的载体pCOLA-O/eT^与外源基因片段泌按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒vCQlk-01eTJE-0hyAw ； 所述m\A-01eTJE_0hyAEM和pET-28a (+)载体分别用BamHI和XhoI酶切，酶切后载体和基因片段01eTJE-0hyAMH连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒^EX2d,-01eTJE-OhyAEM ； 扩增片段，将载体pBAD-0/eT^与基因泌7^#片段分别用SalI和HindIIimf双酶切，酶切后载体与两端带有相应酶切位点的泌基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒卿-01eTJE -OhyAm ； (3)将载体xACY-mvaE-mvaS分别和重组质粒pCOLk-OIeTJE_OhyAm、重组质粒 和重组质粒pBAD-0/eT^ _泌7^1共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，分别获得阳性克隆YJM32工程大肠杆菌、YJM33工程大肠杆菌和YJM34工程大肠杆菌； (4)活化后的上述工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素或氨苄霉素的LB液体培养液中培养，当OD6tltlnm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂至终浓度0.5 mmol.L—1，然后转入在30°C下继续诱导培养24h，发酵获得异戊二烯。
2.根据权利要求1所述的利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述?^3万基因来源于:酿酒酵母中GenBank:ΒΚ006949.2、粪肠球菌中GenBank: AAG02438.2、金黄色酿胺葡萄球菌中GenBank:ΑΙΑ26811.1、褐杆菌中GenBank:AF090074.1、钩虫贪铜菌中GenBank:ΑΕΙ82514.1、大肠杆菌中GenBank: ADX49537.1或酿脓链球菌中GenBank:ΝΡ_607695.1。
3.根据权利要求1所述的利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述5----基因来源于:酿酒酵母中GenBank: YLR450W、|^肠球菌中GenBank: ESU74184.1、金黄色酿脓葡萄球菌中GenBank: AAG02423.1、屎肠球菌中GenBank: AGS75052.1或酿脓链球菌中 GenBank: ML97583.1。
4.根据权利要求1所述的利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述 基因是来源于:保藏编号为ATCC 8456的嗜冷咸海鲜菌中GenBank: ADW41779.1、枯草芽孢杆菌中GenBank:NP—388092、嗜酸球菌中GenBank: AAT43941或酿酒酵母中GenBank: X97557.1。
5.根据权利要求1所述的利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述 基因是来源于:脑膜炎脓毒性黄杆菌的油酸水合酶GenBank: ACT54545.1、干酪乳杆菌的油酸水合酶GenBank: CCK21440.1或李斯特菌的油酸水合酶GenBank: CC063090.1。
6.根据权利要求1所述的利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述步骤(3)中YJM33工程大肠杆菌为最优工程大肠杆菌。
7.根据权利要求1所述的利用新MVA途径合成异戊二烯的方法，其特征在于:所述步骤(4)中诱导剂为IPTG或乳糖。
8.一种合成异戊二烯的重组细胞，其特征在于所述重组细胞包含对应编码产生乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸脱羧酶和3-甲基-3- 丁烯-1-醇脱羟基酶的基因，该重组细胞能够从葡萄糖合成异戊二烯。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其特征在于所述的重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或真菌细胞中的酿酒酵母。
10.根据权利要求8所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，其特征在于所述化合物和组合物包括:异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物 弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
【文档编号】C12N1/19GK104164457SQ201410334650
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】杨建明, 易晓华, 王晓璐, 聂庆娟 申请人:青岛农业大学