一种发酵生产柠檬酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将第一淀粉质原料液化液进行固液分离，得到液化清液；(2)将黑曲霉接种至第二淀粉质原料液化液中进行种子培养，得到种子液；(3)在生成柠檬酸的条件下，在大豆肽的存在下，将步骤(1)得到的所述液化清液和步骤(2)得到的所述种子液进行发酵，并从得到的发酵液中提取柠檬酸；其中，所述第一淀粉质原料液化液和所述第二淀粉质原料液化液各自为淀粉质原料经酶解后得到的液化液。采用本发明提供的方法能够有效的提高发酵转化率和缩短发酵周期，并降低能耗。
【专利说明】一种发酵生产朽3檬酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种发酵生产柠檬酸的方法。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸是动植物体内的一种天然成分和生理代谢的中间产物，是第一大类有机 酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建 筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。
[0003] 目前，柠檬酸发酵工艺还局限于带渣发酵，培养基中的碳源以淀粉质原料（如玉 米）为主，适量添加有机氮源，少量或不加无机盐成分，这种发酵液的发酵效率低，动力消 耗大；且培养基成分较为复杂，同时发酵液中的杂质对柠檬酸提取存在很大的影响。另外， 淀粉质原料也随产地、品种的不同而存在差异，导致各批次制备的培养基成分波动较大，不 利于稳定生产。
[0004] 近年来，由于原料价格上涨、市场竞争加剧等原因，人们对生产柠檬酸的方法要求 也越来越高，因此，本领域需要开发一种低能耗、高发酵效率且稳定的发酵生产柠檬酸的方 法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有的柠檬酸发酵工艺中存在的能耗高和发酵效率低的 缺陷，提供一种低能耗、高发酵效率且稳定的全清液发酵生产柠檬酸的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供一种发酵生产柠檬酸的方法，其中，该方法包括以 下步骤：
[0007] (1)将第一淀粉质原料液化液进行固液分离，得到液化清液；
[0008] (2)将黑曲霉接种至第二淀粉质原料液化液中进行种子培养，得到种子液；
[0009] (3)在生成柠檬酸的条件下，在大豆肽的存在下，将步骤（1)得到的所述液化清液 和步骤（2)得到的所述种子液进行发酵，并从得到的发酵液中提取柠檬酸；
[0010] 其中，所述第一淀粉质原料液化液和所述第二淀粉质原料液化液各自为淀粉质原 料经酶解后得到的液化液。
[0011] 本发明的发明人通过研究发现，采用液化清液发酵生产柠檬酸，发酵液成分稳定， 利于稳定生产，并且液化清液中杂质较少，利于柠檬酸的提取，提高了柠檬酸的生产效率。 另外发明人研究还发现，在生成柠檬酸的条件下，添加大豆肽进行发酵，能够大幅缩短发酵 周期和大幅提高发酵转化率。
[0012] 采用本发明提供的方法来生产柠檬酸，能够有效地提高了发酵转化率，并且缩短 了发酵周期、降低了能耗。
[0013] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0015] 图1是根据本发明的一种【具体实施方式】的发酵生产柠檬酸的示意图。
【具体实施方式】
[0016] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0017] 本发明提供了一种发酵生产柠檬酸的方法，其中，该方法包括以下步骤：
[0018] (1)将第一淀粉质原料液化液进行固液分离，得到液化清液；
[0019] (2)将黑曲霉接种至第二淀粉质原料液化液中进行种子培养，得到种子液；
[0020] (3)在生成柠檬酸的条件下，在大豆肽的存在下，将步骤（1)得到的所述液化清液 和步骤（2)得到的所述种子液进行发酵，并从得到的发酵液中提取柠檬酸；
[0021] 其中，所述第一淀粉质原料液化液和所述第二淀粉质原料液化液各自为淀粉质原 料经酶解后得到的液化液。
[0022] 根据本发明提供的方法，所述淀粉质原料可以为本领域常规使用的淀粉质原料， 例如可以为选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或多种。优选情况下，所述淀粉质原 料为玉米。
[0023] 根据本发明提供的方法，所述固液分离的方法可以为本领域常规使用的方法，例 如，使用压滤机或离心机进行固液分离。本发明的发明人研究发现，采用固液分离后的液化 清液来进行发酵生产柠檬酸，发酵液成分稳定，利于稳定生产，并且液化清液中杂质较少， 利于柠檬酸的提取，提高了柠檬酸的生产效率。
[0024] 本发明中对于将淀粉质原料酶解以获得液化液的方法并没有特别的限定，可以采 用本领域常规的方法实施，例如该方法可以包括：向粉碎的淀粉质原料（如玉米粉）中加入 酶，经过调浆、一次喷射、层流维持、高温二次喷射及闪蒸等步骤得到的液化液。所述闪蒸是 指通过在真空条件下在闪蒸罐内将物料温度迅速下降到指定温度。
[0025] 根据本发明，所述酶可以为淀粉酶；淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的 总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，优选情况下，所述 酶为α-淀粉酶。
[0026] 根据本发明提供的方法，优选情况下，在步骤（2)中，相对于每升所述第二淀粉质 原料液化液，黑曲霉的接种量为2Χ 108-4Χ 108个孢子。
[0027] 所述孢子可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。
[0028] 所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被移种至发酵液中之前，将所述黑 曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液转接到发酵液中。黑曲霉种子培养的程度可 以通过质谱仪设备对种子罐尾气进行分析，检测尾气中的KLA ((体积溶氧系数）、0UR (耗氧 速率）、CER (二氧化碳释放率）和RQ (呼吸商）值，并根据RQ值来判断种子液转接时机，所 述RQ (呼吸商）值为CER (二氧化碳释放率）与0UR (耗氧速率）的比值。优选情况下，当 尾气中RQ值达到最大值维持lh后移种。
[0029] 根据本发明提供的方法，所述种子培养的条件可以在很大范围内变化，优选情况 下，所述种子培养的条件可以包括：温度可以为33-38°C，压力可以为0. 02-0. 04Mpa，起始 pH值可以为5-6。
[0030] 根据本发明提供的方法，所述种子培养的条件还包括种子培养过程中的通气量的 控制，优选情况下，种子培养过程中通气量的控制可以为：从种子培养开始至种子培养l〇h 的时间段内，将通气量控制在〇. 2-0. 4体积：（体积?分钟）；在种子培养10-20h的时间 段内，将通气量控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分钟）；在种子培养20h后，将通气量控制在 0. 5-0. 7体积：（体积?分钟）。
[0031] 术语"通气量"一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气 体积比来表示VAV · min)，例如通气比为1:0. 1-1，简称通气量为0. 1-1体积：（体积?分 钟）。
[0032] 在本发明中，所述种子培养的过程可以在本领域常规使用的种子罐中进行。
[0033] 根据本发明提供的方法，为了保证更佳的发酵效果，优选情况下，在步骤（3)中， 加入种子液的体积为发酵液体积的8-11 %。
[0034] 根据本发明提供的方法，所述发酵的条件可以在很大范围内变化，例如所述发酵 的条件可以包括：温度为34-38°C，压力为0. 03-0. 05MPa，起始pH值为4-5。
[0035] 根据本发明提供的方法，所述发酵的条件还包括发酵过程中的通气量的控制，优 选情况下，发酵过程中通气量的控制可以为：从发酵开始至发酵8h的时间段内，将通气量 控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分钟）；在发酵8-24h的时间段内，将通气量控制在0. 9-1. 1 体积：（体积?分钟）；在发酵24-48h的时间段内，将通气量控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分 钟）；在发酵48h后，将通气量控制在0. 5-0. 7体积：（体积?分钟）。
[0036] 根据本发明提供的方法，发酵终点的判断标准为当发酵液中还原糖的检测量达到 0. 05g/100mL以下，考虑到发酵生产的效率，优选为0. 2g/100mL时，确定为发酵终点，停止 发酵。其中，发酵液中还原糖的测定方法为本领域技术人员所公知，例如，可以使用费林法 对发酵液中的还原糖的浓度进行测定。
[0037] 微生物在培养基的生长、繁殖过程中，氮源是不可缺少的营养素之一。氮源的优 劣，直接关系到微生物的生长情况，发酵周期的长短，产品得率高低等重要问题。本发明的 发明人研究发现，大豆肽可以作为一种极具价值的氮源用于柠檬酸的发酵，能够降低生产 成本并且能够提高发酵效率。所述大豆肽可以为大豆蛋白水解物。
[0038] 根据本发明提供的方法，优选情况下，以发酵液总重量为基准，所述大豆肽的用量 可以为0. 01-0. 05重量％。
[0039] 在本发明中，所述发酵的过程可以在本领域常规使用的发酵罐中进行。
[0040] 在本发明的一种具体的实施方式中，发酵生产朽1檬酸的方法可以为：
[0041] (1)将玉米粉酶解所得的液化液进行固液分离，得到液化清液；
[0042] (2)将玉米粉酶解所得的液化液加入到种子罐中，并接入黑曲霉菌株中进行种子 培养，得到种子液。相对于每升所述液化液，黑曲霉的接种量为2X 108-4X 108个孢子。种 子培养的条件包括：温度为33-38°C，压力为0. 02-0. 04Mpa，起始pH值为5-6,从种子培养 开始至种子培养l〇h的时间段内，将通气量控制在0. 2-0. 4体积：（体积?分钟）；在种子 培养10-20h的时间段内，将通气量控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分钟）；在种子培养20h 后，将通气量控制在0. 5-0. 7体积：（体积?分钟）。通过质谱仪设备对种子罐尾气进行分 析。
[0043] (3)将步骤（1)得到的所述液化清液加入到发酵罐中，添加0. 01-0. 05重量％ (以 发酵液的总重量为基准）的大豆肽，接着将步骤（2)尾气RQ值达到最大值继续维持lh后得 到的种子液按发酵液体积的8-11 %投入到上述发酵罐中进行发酵，所述发酵的条件包括： 温度为34-38°C，压力为0.03-0. 05MPa，起始pH值为4-5,从发酵开始至发酵8h的时间段 内，将通气量控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分钟）；在发酵8-24h的时间段内，将通气量控 制在0. 9-1. 1体积：（体积?分钟）；在发酵24-48h的时间段内，将通气量控制在0. 7-0. 9 体积：（体积?分钟）；在发酵48h后，将通气量控制在0. 5-0. 7体积：（体积?分钟）。
[0044] 当发酵液中还原糖浓度低于0. 2g/100mL时停止发酵，测定发酵液的柠檬酸含量， 记录发酵周期，并从得到的发酵液中提取柠檬酸。
[0045] 以下将通过制备例、实施例和对比例详细说明本发明提供的发酵生产柠檬酸的方 法。
[0046] 发酵转化率根据以下公式计算：
[0047] 发酵转化率=(柠檬酸产量/总糖的重量）X 100%
[0048] 其中，总糖的重量包括接入种子中糖的重量和发酵罐用糖重量。
[0049] 发酵过程中发酵液中还原糖的浓度，以及种子液中糖的初始浓度和发酵罐中糖的 初始浓度均使用菲林试剂法测定。
[0050] 种子培养过程中尾气的分析通过使用质谱仪设备进行，其中，质谱仪为MX300型 号质谱仪，购于美国艾科特里尔Extrel质谱公司。
[0051] 根据GB1987-2007标准检测发酵过程中、发酵终点时柠檬酸溶液的浓度。
[0052] 制备例1
[0053] 本制备例用于说明淀粉质原料液化液的制备。
[0054] 将100重量份玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎产物，将粉碎 后的产物与400重量份水，在45°C下混合，得到淀粉浆液，并将该淀粉浆液的pH值调节至 5. 5〇
[0055] 在45°C下，将淀粉浆液与用量为6. 4酶活力单位/g玉米粉的α -淀粉酶混合60 分钟，得到混合物，将该混合物与156°C的蒸汽在喷射器中进行喷射接触（蒸汽与混合物的 重量比为0. 05 :1)，接触的时间为5秒，使得与蒸汽接触后的混合物的温度为95°C，并层流 维持120分钟，得到一次液化液。
[0056] 将上述一次液化液再次与156°C的蒸汽在喷射器中进行喷射接触（蒸汽与混合物 的重量比为0.05:1)，接触的时间为3秒，使再次与蒸汽接触后的混合物的温度为120°C，并 在该温度下保持5分钟；
[0057] 将上述再次与蒸汽接触后的混合物进行闪蒸（压力为0· 07MPa，时间为10秒）至 l〇〇°C，降温至90°C，得到液化液。
[0058] 实施例1
[0059] 本实施例用于说明本发明的发酵生产朽1檬酸的方法。
[0060] (1)将制备例1中所得到的液化液进行压滤使得液化液固液分离，得到液化清液。
[0061] (2)将制备例1中所得到的液化液加入到种子罐中，加热至121°C灭菌20分钟，之 后快速降温至37°C，并接入黑曲霉菌株（C 〇827,购于中粮生物化学（安徽）股份有限公司， 在本实施例中，相对于每升所述液化液，黑曲霉的接种量为3 X 108个孢子）进行种子培养， 种子培养的条件包括：温度为35°C，压力为0. 02Mpa，起始pH值为5,从种子培养开始至种 子培养10h的时间段内，将通气量控制在0. 2体积：（体积?分钟）；在种子培养10-20h的 时间段内，将通气量控制在〇. 7体积：（体积?分钟）；在种子培养20h后，将通气量控制在 〇. 5体积：（体积?分钟）。通过质谱仪设备对种子罐尾气进行分析。当尾气RQ值达到最 大值继续维持lh后，停止种子培养，得到的种子液。
[0062] (3)将步骤（1)得到的所述液化清液加入到发酵罐中，添加0· 01重量％ (以发酵 液的总重量为基准）的大豆肽（购于山东天骄生物技术有限公司），接着将步骤（2)得到的 种子液按发酵液体积的8%投入到上述发酵罐中进行发酵，发酵的条件包括：温度为34°C， 压力为0. 03MPa，起始pH值为4,从发酵开始至发酵8h的时间段内，将通气量控制在0. 7体 积：（体积?分钟）；在发酵8-24h的时间段内，将通气量控制在0. 9体积：（体积?分钟）； 在发酵24-48h的时间段内，将通气量控制在0. 7体积：（体积?分钟）；在发酵48h后，将通 气量控制在〇. 5体积：（体积?分钟）。
[0063] 当发酵液中还原糖浓度低于0. 2g/100mL时停止发酵，测定发酵液的柠檬酸含量， 记录发酵周期，并从得到的发酵液中提取柠檬酸。
[0064] 实施例2
[0065] 本实施例用于说明本发明的发酵生产朽1檬酸的方法。
[0066] (1)将制备例1中所得到的液化液进行压滤使得液化液固液分离，得到液化清液。
[0067] (2)将制备例1中所得到的液化液加入到种子罐中，加热至115°C灭菌25分钟，之 后快速降温至34°C，并接入黑曲霉菌株（C〇827,购于中粮生物化学（安徽）股份有限公司， 在本实施例中，相对于每升所述液化液，黑曲霉的接种量为2 X 108个孢子）进行种子培养， 种子培养的条件包括：温度为33°C，压力为0. 03Mpa，起始pH值为6,从种子培养开始至种 子培养10h的时间段内，将通气量控制在0. 3体积：（体积?分钟）；在种子培养10-20h的 时间段内，将通气量控制在〇. 8体积：（体积?分钟）；在种子培养20h后，将通气量控制在 〇. 6体积：（体积?分钟）。通过质谱仪设备对种子罐尾气进行分析。当尾气RQ值达到最 大值继续维持lh后，停止种子培养，得到的种子液。
[0068] (3)将步骤⑴得到的所述液化清液加入到发酵罐中，添加0. 03重量％ (以发酵 液的总重量为基准）的大豆肽，接着将步骤（2)得到的种子液按发酵液体积的10%投入到 上述发酵罐中进行发酵，发酵的条件包括：温度为38°C，压力为0. 04MPa，起始pH值为5,从 发酵开始至发酵8h的时间段内，将通气量控制在0. 8体积：（体积?分钟）；在发酵8-24h 的时间段内，将通气量控制在1. 〇体积：（体积?分钟）；在发酵24-48h的时间段内，将通气 量控制在0. 8体积：（体积?分钟）；在发酵48h后，将通气量控制在0. 6体积：（体积?分 钟）。
[0069] 当发酵液中还原糖浓度低于0. 2g/100mL时停止发酵，测定发酵液的柠檬酸含量， 记录发酵周期，并从得到的发酵液中提取柠檬酸。
[0070] 实施例3
[0071] 本实施例用于说明本发明的发酵生产朽1檬酸的方法。
[0072] (1)将制备例1中所得到的液化液进行压滤使得液化液固液分离，得到液化清液。
[0073] (2)将制备例1中所得到的液化液加入到种子罐中，加热至125°C灭菌30分钟，之 后快速降温至37°C，并接入黑曲霉菌株（C 〇827,购于中粮生物化学（安徽）股份有限公司， 在本实施例中，相对于每升所述液化液，黑曲霉的接种量为4X 108个孢子）进行种子培养， 种子培养的条件包括：温度为37°C，压力为0. 04Mpa，起始pH值为6,从种子培养开始至种 子培养10h的时间段内，将通气量控制在0. 4体积：（体积?分钟）；在种子培养10-20h的 时间段内，将通气量控制在〇. 9体积：（体积?分钟）；在种子培养20h后，将通气量控制在 〇. 7体积：（体积?分钟）。通过质谱仪设备对种子罐尾气进行分析。当尾气RQ值达到最 大值继续维持lh后，停止种子培养，得到的种子液。
[0074] (3)将步骤⑴得到的所述液化清液加入到发酵罐中，添加0. 05重量％ (以发酵 液的总重量为基准）的大豆肽，接着将步骤（2)得到的种子液按发酵液体积的11%投入到 上述发酵罐中进行发酵，发酵的条件包括：温度为36°C，压力为0. 05MPa，起始pH值为5,从 发酵开始至发酵8h的时间段内，将通气量控制在0. 9体积：（体积?分钟）；在发酵8-24h 的时间段内，将通气量控制在1. 1体积：（体积?分钟）；在发酵24-48h的时间段内，将通气 量控制在0. 9体积：（体积?分钟）；在发酵48h后，将通气量控制在0. 7体积：（体积?分 钟）。
[0075] 当发酵液中还原糖浓度低于0. 2g/100mL时停止发酵，测定发酵液的柠檬酸含量， 记录发酵周期，并从得到的发酵液中提取柠檬酸。
[0076] 对比例1
[0077] 采用实施例1的方法发酵生产柠檬酸，不同的是，在步骤（3)中使用制备例1所得 到的液化液代替步骤（1)所得到的液化清液。
[0078] 当发酵液中还原糖浓度低于0. 2g/100mL时停止发酵，测定发酵液的柠檬酸含量， 记录发酵周期，并从得到的发酵液中提取柠檬酸。
[0079] 对比例2
[0080] 采用实施例1的方法发酵生产柠檬酸，不同的是，使用玉米浆（购于中粮生物化学 (安徽）股份有限公司）代替大豆肽。
[0081] 当发酵液中还原糖浓度低于0. 2g/100mL时停止发酵，测定发酵液的柠檬酸含量， 记录发酵周期，并从得到的发酵液中提取柠檬酸。
[0082] 实施例1-3和对比例1-2生产柠檬酸的方法中发酵周期（h)、发酵终点柠檬酸含量 (g/100mL)和转化率（％ )如表1所示。
[0083] 表 1
[0084]
【权利要求】
1. 一种发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 将第一淀粉质原料液化液进行固液分离，得到液化清液； (2) 将黑曲霉接种至第二淀粉质原料液化液中进行种子培养，得到种子液； (3) 在生成柠檬酸的条件下，在大豆肽的存在下，将步骤（1)得到的所述液化清液和步 骤（2)得到的所述种子液进行发酵，并从得到的发酵液中提取柠檬酸； 其中，所述第一淀粉质原料液化液和所述第二淀粉质原料液化液各自为淀粉质原料经 酶解后得到的液化液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（2)中，相对于每升所述第二淀粉质原料 液化液，黑曲霉的接种量为2X 108-4X 108个孢子。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤（2)中，所述种子培养的条件包括： 温度为33-38°C，压力为0.02-0. 04Mpa，起始pH值为5-6。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤⑵的种子培养过程中，从种子培养 开始至种子培养l〇h的时间段内，将通气量控制在0. 2-0. 4体积：（体积?分钟）；在种子 培养10-20h的时间段内，将通气量控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分钟）；在种子培养20h 后，将通气量控制在0. 5-0. 7体积：（体积?分钟）。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（3)的发酵过程中，加入种子液的体积为 发酵液体积的8-11%。
6. 根据权利要求1或5所述的方法，其中，在步骤（3)中，所述发酵的条件包括：温度 为 34-38 °C，压力为 0.03-0. 05MPa，起始 pH 值为 4-5。
7. 根据权利要求1或5所述的方法，其中，在步骤（3)的发酵过程中，从发酵开始至发 酵8h的时间段内，将通气量控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分钟）；在发酵8-24h的时间段 内，将通气量控制在0. 9-1. 1体积：（体积?分钟）；在发酵24-48h的时间段内，将通气量 控制在0. 7-0. 9体积：（体积?分钟）；在发酵48h后，将通气量控制在0. 5-0. 7体积：（体 积?分钟）。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，以发酵液的总重量为基准，所述大豆肽的用量为 0. 01% -0. 05%。
【文档编号】C12P7/48GK104232699SQ201410364377
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】高志林, 周广积, 熊结青, 鲁小云 申请人:中粮生物化学（安徽）股份有限公司