一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，采用价格较低的无机Na2SeO3作为硒源，以液体发酵培养的方式，在用马铃薯葡萄糖制备的液体培养基中加入Na2SeO3溶液，通过荷叶离褶伞菌丝体的富集转化为有机硒，降低了硒的毒性，提高菌丝体的利用价值；将Na2SeO3在液体培养基的发酵中期加入，有效地降低硒对延滞期荷叶离褶伞菌丝体的抑制和毒害作用，提高荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内多糖的积累量。通过单因素试验和Box-Behnken试验设计以及响应面分析法，对富硒荷叶离褶伞胞内粗多糖发酵条件进行优化，得出最佳发酵条件，得到胞内粗多糖与各发酵条件各因素变量的二次回归方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定的应用价值。
【专利说明】一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及硒多糖的生产工艺，具体涉及一种荷叶离褶伞富 硒胞内粗多糖的发酵工艺。
【背景技术】
[0002] 荷叶离裙伞afecasies )菌丝体中蛋白质含量高，氨基酸种类齐全， 含有多种维生素，其多糖可以抑制肿瘤的生长，降低胰岛素依赖型小白鼠的血糖浓度，是一 种营养价值和药用价值都很高的菌类。而且荷叶离褶伞菌丝体可以有效地富集一定量的 硒。食用菌对硒具有较强的富集能力，通过菌丝体细胞内物质代谢，使无机硒安全有效地转 化为有机硒多糖，其生物药理活性普遍高于多糖和硒，更容易被机体吸收和利用，同时营养 成分因富硒得到改善。荷叶离褶伞人工栽培困难，其抗杂菌能力较差、出菇条件要求极高、 子实体产量不稳定、栽培周期长等问题严重影响该菌的全面推广，改善荷叶离褶伞菌丝体 的营养成分，提高其应用价值显得尤为重要。目前国内对食用菌中硒多糖研究仅限于从富 硒子实体和菌丝体中的提取条件的优化，富硒多糖发酵条件的仅限于培养基成分，培养时 间和pH因素等因素的改变，在优化的工艺条件下生产富硒粗多糖的产量仍然低，且工序复 杂。
【发明内容】
[0003] 本发明为了解决现有生产富硒粗多糖效率低的问题，提供一种荷叶离褶伞富硒胞 内粗多糖的发酵工艺。
[0004] 本发明是通过以下技术方案来实现的： 一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，具体包括以下步骤： a) 供试菌种 荷叶离褶伞菌种由河西学院甘肃省应用真菌工程实验室提供，菌种保藏在"中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"，菌种保藏号CGMCC No. 1518,菌株号ZY48-1，专利 号：ZL200510096405. 0 ; b) 菌种活化 将荷叶离褶伞母种菌块接入新鲜的PDA固体培养基上，置于22°C恒温培养箱中培养 15d后，再转接一次，22°C培养15d，备用； c) 液体培养基制备 将200g马铃薯洗净，去皮挖眼，切成2cm2的小块，加水煮沸2(T30min，至马铃薯小块煮 烂能被玻璃棒戳破即可，然后过300目筛得滤液，取其滤液80(T9(K)mL加入20g葡萄糖，使 葡萄糖溶化后加水至l〇〇〇mL，备用； d) 荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖发酵生产 将上述制备的液体培养基取l〇〇mL进行灭菌，所述的灭菌条件为115°C，20min、115°C， 30min、121°C，15min、121°C，20min、121°C，30min 其中的任意一种，冷却至 20?25°C后接入 荷叶离褶伞活化菌种块，接种后置于22°C、121rpm下培养发酵，至发酵的2~12d时，加入同 等灭菌条件下灭菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液体培养基中的浓度为(TlOug/mL，然后 继续在22°C、121rpm下培养发酵一定时间，在所述的继续培养发酵期间每天测定荷叶离褶 伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量； e)利用响应面曲线法得到最优工艺条件 根据步骤d测定的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的含量(mg/100mL)，得到优化单 因素发酵条件，然后利用响应面曲线法得到荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的最优发酵 工艺条件。
[0005] 1.荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的生产 1. 1灭菌条件对荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖生产的影响 将100mL的液体培养基和Na2Se03溶液，采取将液体培养基和Na 2Se03溶液分别灭菌后 再混合及两者混合后再灭菌的不同方式，在115~121°C、灭菌2(T30min，混合时都使硒在液 体培养基中的浓度为10ug/mL，冷却至20~25°C后，接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化 菌种块，在2(T25°C、121rpm下培养至接种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多 糖含量。
[0006] 结合图1所示的标准曲线，从图2中得知，液体培养基和Na2Se03溶液分别灭菌后 再混合的方式培养的荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量高；灭菌条件为12rC，20min 时，荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量达到最大，为70. 8 mg/100mL。
[0007] 优选的液体培养基和Na2Se03溶液分别在121°C下灭菌20min后两者再混合。
[0008] 1. 2硒浓度对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响 分别对100mL的液体培养基和lmg/mL Na2Se03溶液在优选灭菌条件：12rC，20min下 灭菌，将Na2Se03溶液加入液体培养基中，使硒在液体培养基中的浓度为(TlOug/mL，冷却至 20~25°C后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在2(T25°C、121rpm下培养至接 种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量。
[0009] 从图3中得知，随着液体培养基中加入Na2Se03量的增加，荷叶离褶伞菌丝体富硒 胞内粗多糖含量呈现"N"字形，在浓度<4ug/mL和>4ug/mL时对荷叶离褶伞菌丝体中富硒 胞内粗多糖含量的分泌均有抑制作用。在加硒浓度为4ug/mL时，荷叶离褶伞菌丝体中富 硒胞内粗多糖含量达到113. 2 mg/100mL高于不加 Na2Se03时菌丝体中胞内粗多糖103. 6 mg/100mL 的量。
[0010] 优选的硒添加量为在液体培养基中加入Na2Se03溶液使硒在液体培养基中的浓度 为 4ug/mL〇
[0011] 1. 3硒添加时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响 将100mL的液体培养基，在12rC，20min下灭菌，冷却至2(T25°C后接入6片直径为 6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在2(T25°C、121rpm下培养发酵至接种后第2~12d时，加入 同等条件下灭菌的Na 2Se03溶液，使硒在液体培养基中的浓度均为4ug/mL，继续在20~25°C、 121rpm下培养至接种后第12d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量。
[0012] 如图4所示，随着硒添加时间的推迟，荷叶离褶伞菌丝体中富硒胞内粗多糖含量 呈现波浪式增加，后逐步降低的趋势，在发酵的第6d加入Na 2Se03后，富硒胞内粗多糖含量 达到最大，为320. 6 mg/100mL，第6d后波浪式的降低，说明在菌丝体开始生长的过程中加 入Na2Se03有助于积累菌丝体中富硒胞内粗多糖。
[0013] 优选的在液体培养基发酵的第6d加入硒为荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖合 成的优选加入时间。
[0014] 1. 4培养时间对荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量的影响 将100mL的液体培养基，在121°C，20min下灭菌，冷却至2(T25°C后接入6片直径为6mm 的荷叶离褶伞活化菌种块，在20~25°C、121rpm下培养，至接种后发酵的第6d时，加入同等 条件下灭菌的Na2Se0 3溶液，使硒在液体培养基中的浓度均为4ug/mL，继续在22°C、121rpm 下培养，培养时间分别设定为接种后第疒13d，测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含 量。
[0015] 如图5所示，随着发酵培养时间的延长，荷叶离褶伞菌丝体内的富硒多糖含量呈 现先增加后降低的趋势，在接种后发酵培养的第7?9d，荷叶离褶伞富硒胞内粗多糖含量 的增加比较缓慢，在接种后发酵培养的第9?10d，胞内粗多糖含量迅速增加，至发酵第10d 达到最大值，为320.2 mg/100mL，第10d后富硒胞内粗多糖含量开始降低，降低幅度较慢。
[0016] 优选的培养时间为加入Na2Se03溶液后继续在22°C、121rpm下培养，至接种后的第 10 do
[0017] 优选工艺条件为：在250mL三角瓶中，加入100mL的液体培养基，在12rC，20min 下灭菌，冷却至2(T25°C后接入6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块，在22°C、121rpm 下培养，至发酵至接种后第6d时，加入同等条件下灭菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液体 培养基中的浓度为4ug/mL，继续在22°C、121rpm下培养发酵至接种后第10d，得到的荷叶离 褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖含量最高为320. 2 mg/100mL。
[0018] 2. Box-Behnken 试验设计 根据单因素实验结果，固定灭菌条件，采用Box-Behnken试验设计方法，以硒浓度、培 养时间和添加硒的时间为相应变量，分别以Xp X2和X3表示，并以_1，〇, 1分别代表变量的 水平，Box -Behnken设计试验因素和水平见表1，以荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖为 响应值，见表2。
[0019] 表1 · Box-Behnken设计试验因素与水平
【权利要求】
1. 一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在于：具体包括以下步 骤： a) 菌种活化 将荷叶离褶伞母种菌块接入新鲜的固体培养基上，置于22°C恒温培养箱中培养15d 后，再转接一次，22°C培养15d，备用； b) 液体培养基制备 将200g马铃薯洗净，去皮挖眼，切成2cm2的小块，加水煮沸2(T30min，至马铃薯小块煮 烂能被玻璃棒戳破即可，过300目筛得滤液，取其滤液80(T9(K)mL加入20g葡萄糖，使葡萄 糖溶化后加水至l〇〇〇mL定容，备用； c) 荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵生产 取100mL步骤b制备的液体培养基置于115~121°C下灭菌15~30min，冷却后接入6片 直径为6mm荷叶离褶伞活化菌种块，接种后放在2(T25°C、121rpm下培养发酵，发酵期间加 入同等条件下灭菌的Na 2Se03溶液，使硒在液体培养基中的浓度为(TlOug/mL，然后继续在 2(T25°C、121rpm下培养，每天测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的含量。
2. 如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在 于：所述的步骤c中接种后放在2(T25°C、121rpm下培养发酵，接种后发酵2~12d时加入同 等灭菌条件下灭菌的Na 2Se03溶液。
3. 如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在 于：所述的步骤c中加入Na2Se0 3溶液后继续在20~25°C、121rpm下培养，培养至接种后的第 7?13d。
4. 如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在 于：所述的步骤c取100mL的液体培养基，在121°C下灭菌20min，冷却至20~25°C后接入 6片直径为6mm的荷叶离褶伞活化菌种块置于22°C、121rpm下培养发酵，至接种后的第6d 时，加入同等条件下灭菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液体培养基中的浓度为4ug/mL，然 后继续在22°C、121rpm下培养，直至接种后第10d测定荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖 的含量。
5. 如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在 于：根据步骤c得到优化单因素发酵条件，然后利用响应面曲线法得到荷叶离褶伞菌丝体 富硒胞内粗多糖的最佳发酵工艺条件。
6. 如权利要求1所述的一种荷叶离褶伞菌丝体富硒胞内粗多糖的发酵工艺，其特征在 于：所述的步骤a的固体培养基为PDA固体培养基。
【文档编号】C12P19/04GK104152511SQ201410371991
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】高慧娟, 魏生龙, 席亚丽, 梁倩倩, 刘志芳, 袁承玲, 赵丽 申请人:甘肃祁连食用菌工程技术研究中心