一种生物合成(r)-3-羟基戊二酸单酯的新方法
【专利摘要】本发明涉及(R)-3-羟基戊二酸单酯的生物合成新方法。更具体的，本发明提供了一种利用卤醇脱卤酶与腈水解酶或双酶共表达重组菌催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯一锅法制备(R)-3-羟基戊二酸单酯的方法，所述的(R)-3-羟基戊二酸单酯是氟伐他汀、瑞舒伐他汀及匹伐他汀等他汀类药物的关键中间体。本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。
【专利说明】一种生物合成（/?)-3-羟基戊二酸单酯的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化制备药物中间体和绿色化学领域，涉及一种由 ⑶-4-氯-3-羟基丁酸酯一锅法制备⑷-3-羟基戊二酸单酯的方法；主要涉及一种 0?) -3-羟基戊二酸单酯的生物制备新方法。
【背景技术】
[0002] 瑞舒伐他汀（Rosuvastatin，商品名Crestor)是由阿斯利康公司开发的他汀类 降血脂药，该药2002年11月首次在荷兰获批，2003年2月首次在加拿大上市，之后陆续 在新西兰、英国以及美国上市。瑞舒伐他汀上市后，在药效和安全性方面均达到令人满意 的结果，被称为"超级他汀"。瑞舒伐他汀的侧链含有两个手性中心，0?)-3_羟基戊二酸 单酯是合成瑞舒伐他汀手性侧链的关键中间体。瑞舒伐他汀及其关键中间体0?)-3-羟基 戊二酸单酯的结构如化学结构式1所示（A. Liljeblad, A. Kallinen, L. T. Kanerva. Biocatalysis in the Preparation of the Statin Side Chain. Current Organic Synthesis, 2009, 6, 362 - 379)〇
【权利要求】
1. 一种生物合成0?)-3-羟基戊二酸单酯的新方法，其特征在于利用卤醇脱卤酶和腈 水解酶或它们共表达重组菌催化（5)-4-氯-3-羟基丁酸单酯一锅法制备〇?)-3-羟基戊二 酸单酯，包括如下步骤： a) 卤醇脱齒酶重组菌、腈水解酶重组菌及双酶共表达重组菌的构建； b) 将齒醇脱齒酶重组菌、腈水解酶重组菌或双酶共表达重组菌分别在发酵培养基中扩 增培养，并进行诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体； c) 将收集的齒醇脱齒酶与腈水解酶或双酶共表达重组菌悬浮在缓冲液中，加入一定量 的C?)-4-氯-3-羟基丁酸单酯，并添加适量的氰化钠或氰化钾，在适当条件下反应一定时 间，底物经过中间产物0?)-4_氰基-3-羟基丁酸单酯，最终转化为〇?)-3_羟基戊二酸单 醋； d) 反应中止后从反应体系中收集上层清液，先用过氧化氢处理，再用盐酸酸化，并用乙 酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。
2. 如权利要求1所述的（5)-4-氯-3-羟基丁酸单酯可以是其甲酯、乙酯等。
3. 如权利要求1所述的a)步骤产卤醇脱卤酶和腈水解酶的共表达基因工程菌，其特征 在于同时将一个卤醇脱卤酶和一个腈水解酶构建到同一个载体上，并转化到宿主菌进行诱 导表达。
4. 如权利要求1所述的a)步骤产卤醇脱卤酶或腈水解酶的基因工程菌，其特征在于将 卤醇脱卤酶或腈水解酶构建到一个载体上，并转化到宿主菌进行诱导表达。
5. 如权利要求1所述的b)步骤产卤醇脱卤酶和腈水解酶的共表达基因工程菌，其特征 在于所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一：pET系列质粒、pETduet系列pET系列 质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；高效表达外源基因的宿主菌为下列 之一 ：BL21 系列、Rosetta 系列、Origami 系列、Tuner 系列。
6. 如权利要求1所述的b)步骤产卤醇脱卤酶或腈水解酶的基因工程菌，其特征在于 所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一：pET系列质粒、pETduet系列pET系列质粒、 pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；高效表达外源基因的宿主菌为下列之一： BL21 系列、Rosetta 系列、Origami 系列、Tuner 系列。
7. 如权利要求1所述的方法中c)步骤中，其中所述酶可以是完整的微生物细胞、细胞 破碎液、粗酶或纯酶。
8. 如权利要求1所述的转化方法c)步骤，其特征在于所述卤醇脱卤酶与腈水解酶的添 加顺序可以一起加入；也可以先加卤醇脱卤酶，等反应一定程度再加入腈水解酶；或者先 加入卤醇脱卤酶，反应完全后离心清液加入腈水解酶。
9. 如权利要求1所述的转化方法c)步骤，其特征在于所述的反应条件：温度为20? 40°C，优选25?30°C ;所用的缓冲液为磷酸盐、Tris硫酸盐；所用的缓冲液的pH为7. 0? 9.0,优选pH为8.0 ;反应时间为1?8小时，优选1?4小时。
10. 如权利要求1所述的转化方法c)步骤，其特征在于所述的C?)-4-氯-3-羟基丁酸 酯的浓度为50?200 g/L ;其中，双酶共表达重组菌优选50 g/L的底物一次性单次投入反 应体系，而100 g/L的底物分成两份批次投入到反应体系；先加卤醇脱卤酶，后加腈水解酶 的双酶催化优选分批添加底物至200 g/L ;同时加入卤醇脱卤酶与腈水解酶的双酶催化优 选分批添加底物至150 g/L。
【文档编号】C12P7/62GK104152500SQ201410426376
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】姚培圆, 吴洽庆, 袁京, 王雷, 冯进辉, 朱敦明, 马延和 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所