一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞培养等步骤。本发明方法利用细胞悬浮培养方法可以快速获得遗传性状稳定的黄葛细胞，繁殖率高，在短期内提供大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
【专利说明】一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下黄葛悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]黄葛树,拉丁^iFicus rire/75.,别名黄桷树、大叶格树、马尾格、雀树,桑科格属落叶大乔木。重庆、四川、湖北等地栽培最佳，宅旁、桥畔、路侧随处可见，新叶展放后鲜红色的托叶纷纷落地，甚为美观。是常用的庭荫树、行道树之一。现为中国重庆的市树。黄葛树喜光，耐旱，耐瘠薄，有气生根，适应能力特别强。生态环境:生于疏林中或溪边湿地，耐寒性较榕树稍强。黄葛树其根、叶入药。根:祛风除湿，清热解毒。用于风湿骨痛，感冒，扁桃体炎，眼结膜炎。叶:消肿止痛。外用治跌打肿痛。目前主要的繁殖方式是扦插繁殖和播种繁殖。组培快繁方法尚无人研究，利用组培悬浮细胞培养可以缩短培养周期，保持遗传稳定性，短期内获得大量的制药原料。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供黄葛细胞悬浮培养的快速繁殖方法，快速获得遗传性状稳定的黄葛细胞，繁殖率高，在短期内提供大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取黄葛的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，流水冲洗为25min，超净工作台上次氯酸钠处理1min,无菌水冲洗5_7遍,消毒处理过的黄葛叶片接入培养基MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L广大霉素诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+2，4-D 0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+柠檬酸100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x,增殖后的愈伤组织放入液体培养基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.3mg/L+ABA2mg/L+硝酸镧2mg/L进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，培养条件为培养温度25°C，光照 11 ?13 h/d，转速 100 ?120 r/min。
[0005]采用本发明制备的黄葛悬浮细胞，生长速度快，增殖率高，利于大生产操作，能耗小，污染少。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取黄葛的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，流水冲洗为25min，超净工作台上次氯酸钠处理1min,无菌水冲洗5_7遍，消毒处理过的黄葛叶片接入培养基配方为MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L广大霉素诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+2，4-D 0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+柠檬酸100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基MS+NAA 0.05mg/L+ZT0.2mg/L+ABAlmg/L+硝酸镧lmg/L进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0008]实施例2
取黄葛的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，流水冲洗为25min，超净工作台上次氯酸钠处理1min,无菌水冲洗5_7遍，消毒处理过的黄葛叶片接入培养基配方为MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L广大霉素诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+柠檬酸lOOmg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照30001X，增殖后的愈伤组织放入液体培养基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.4 mg/L+ABA3mg/L+硝酸镧3 mg/L进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0009]实施例3
取黄葛的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，流水冲洗为25min，超净工作台上次氯酸钠处理1min,无菌水冲洗5_7遍，消毒处理过的黄葛叶片接入培养基配方为MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L广大霉素诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+柠檬酸lOOmg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.4 mg/L+ABA3mg/L+硝酸镧2mg/L进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0010]实施例4
取黄葛的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，流水冲洗为25min，超净工作台上次氯酸钠处理1min,无菌水冲洗5_7遍，消毒处理过的黄葛叶片接入培养基配方为MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L广大霉素诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+柠檬酸lOOmg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基MS+NAA0.05mg/L+ZT0.3 mg/L+ABA2mg/L+硝酸镧2mg/L进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
【权利要求】
1.一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞培养等，主要步骤如下: (1)取黄葛幼嫩叶片，按照常规的消毒方法对其进行消毒处理； (2)将步骤(I)消毒处理过的黄葛叶片接入培养基MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L广大霉素诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期 8h ； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+2，4-D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+柠檬酸100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x ； (4)取步骤(3)增殖后的愈伤组织放入液体培养基MS+NAA0.05-0.lmg/L+ZT0.2-0.4mg/L +ABAl-3mg/L+硝酸镧1-3 mg/L进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x ； 按照权利要求1所述的一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述黄葛无菌叶片的获得为，取黄葛的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，流水冲洗为25min,超净工作台上次氯酸钠处理1min,无菌水冲洗5_7遍。
2.按照权利要求1所述的一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(2)中所述愈伤组织的诱导在培养基中附加了 15mg/L广大霉素，可以消除内生菌。
3.按照权利要求1所述的一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(3)中所述愈伤组织的增殖中附加了柠檬酸，可以有效防止愈伤组织的褐化现象。
4.按照权利要求1所述的一种黄葛愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)所述的黄瑞木悬浮细胞按照按照下述方法得到:挑选松散性好，健康的愈伤组织，继代3次以后，在无菌条件下分别放入装有25 mL液体培养基的锥形瓶内，加入已消毒灭菌的玻璃珠振摇后，置于振荡培养箱中进行水平振荡培养，培养条件为培养温度25°C,光照 11 ?13 h/d，转速 100 ?120 r/min。
5.按照权利要求1所述的一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)中加入了稀土硝酸镧，对细胞悬浮培养的生长有促进作用。
【文档编号】C12N5/02GK104263690SQ201410446370
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】张金芳, 杨存 申请人:南京标科生物科技有限公司