一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用。一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌马赛菌(Massilia sp.)Pn2，于2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12927。利用该菌株制备的菌剂在实验室摇瓶培养条件下3d内对初始浓度为150mg·L‐1的菲降解率可达95％以上，同时该菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根处理将菌剂定殖于植物根表后将植物种植于受菲污染的营养液中，能够在短时间内使植物体内的菲含量降低50％以上，显著降低了植物体的菲污染风险，且对植物生长有明显的促进作用。CGMCC 1.1292712014.08.26
【专利说明】一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境多环芳烃（PAHs)污染生物修复领域，涉及一种具有PAHs降解功 能的植物促生内生细菌及其生产的菌剂和应用。
【背景技术】
[0002] 多环芳烃（PAHs)是由2个或2个以上苯环组成的土壤环境中常见的一类重要持 久性有机污染物，其疏水性强、难于降解。作为疏水性有机污染物，土壤中PAHs可被植物吸 收并在体内积累。如何减低植物PAHs污染风险是当前农业环境领域研究的热点之一。
[0003] 植物内生细菌是指能够定殖在植物健康组织间隙或细胞内、并与宿主植物建立和 谐共生关系的一类微生物，具有促进植物生长、增强宿主植物抗逆性、抗病虫害等作用，并 可作为生防菌和外源基因的重要载体。然而，关于植物内生菌影响植物吸收有机污染物的 报道至今仍很少。有研究表明，内生细菌可以提高有机污染土壤上植株的根长和生物量，增 强植株对有机污染物的耐受性。而Barac等将利用基因改造过的内生细菌浸染黄色羽扇 豆，发现通过植物叶片挥发的甲苯量减少50?70%。
[0004] 有学者推测筛选具有降解特性的植物内生菌并将其定殖在目标植物上，有望提高 植物对有机污染物的降解作用，降低有机物在植物体内的积累，进而减低作物有机污染风 险。然而，针对PAHs等持久性有机污染物，国内外仍少有资料报道，且未见相关专利研究和 应用报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种具有PAHs降解功能的植物促生内 生细菌（以下简称功能内生细菌）。
[0006] 本发明的另一目的是提供该功能内生细菌生产的菌剂。
[0007] 本发明的又一目的是提供该功能内生细菌在降低植物PAHs污染风险中的应用。
[0008] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0009] 功能内生细菌马赛菌（Massilia sp. )Pn2,2014年8月26日保藏于中国微生物菌 种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12927，保藏地址为中国北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0010] -种用所述的马赛菌（Massilia sp. )Pn2所生产的功能内生细菌菌剂，是通过以 下方法生产而成：
[0011] 1)将保藏编号为CGMCC 1. 12927的马赛菌（Massilia sp. )Pn2试管种接种于发酵 培养基中，振荡培养至对数期；
[0012] 2)将上述培养好的菌种按5% (V/V，以培养基体积为基准，下同）的接种量接种入 种子罐，培养至对数期；
[0013] 3)将种子液按10 %的接种量接入生产罐培养；
[0014] 4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1. 2,搅拌速度为200 转/分，培养温度为30°C，全流程培养时间为60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ ml以上；其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方 均为：胰蛋白胨〇· 5g · I71，可溶性淀粉0· 5g · I71，葡萄糖0· 5g · I71，酵母膏0· 5g · I71，酪蛋 白氨基酸〇. 5g · I71，磷酸氢二钾0. 3g · I71，丙酮酸钠0. 3g · I71，七水合硫酸镁0. 05g · I71， pH 7. 0-7. 4 ；
[0015] 5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至0D600nm = 0. 55,即 为功能内生细菌菌剂，可直接用于植物的浸根处理。
[0016] 所述的保藏编号为CGMCC 1. 12927的马赛菌（Massilia sp. )Pn2在降解PAHs的 应用；优选所述的马赛菌（Massilia sp.)Pn2在降解水体，土壤以及植物体内PAHs的应用。
[0017] 所述的多环芳烃（PAHs)选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。
[0018] 本发明所述的降解菌剂在降解多环芳烃中的应用；优选在降解水体，土壤或植物 体内多环芳烃的应用。
[0019] 所述的多环芳烃优选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。
[0020] 有益效果
[0021] 本发明筛选获得一株马赛菌（Massilia sp.)Pn2(CGMCC L 12927)，利用该菌株制 备的功能内生细菌菌剂在实验室摇瓶培养条件下3d内对初始浓度为150mg · Γ1的菲降解 率可达95%以上，同时该菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根处理将该菌剂定 殖于植物根表后将植物种植于受菲污染的营养液中，能够在短时间内使植物体内的菲含量 降低50%以上，显著降低了植物体的菲污染风险，且对植物生长有明显的促进作用。
[0022] 本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成 本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体，土壤以及植物体内的PAHs污染。本发 明为在PAHs污染区生产健康的农产品提供了技术支持，同时对于保障PAHs污染环境下的 农产品安全具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1菌株Pn2的菌落照片和透射电镜照片
[0024] A图为菌株Pn2的菌落照片，B图为菌株Pn2的透射电镜照片
[0025] 图2菌株Pn2以150mg · L-I菲为唯一碳源时的生长和降解曲线
[0026] 生物材料保藏信息
[0027] 功能内生细菌Pn2,分类命名为马赛菌（Massilia sp.)保藏于中国微生物菌种保 存管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 1. 129271，保藏日期为2014年8月26日。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1菌株的分离和鉴定
[0029] 将采自南京江宁扬子石化芳烃厂排污口的新鲜看麦娘植株进行表面消毒：植物用 自来水冲洗干净后，于超净台内用75 %酒精漂洗3?5min，而后用无菌水冲洗3?4次，再 用1%次氯酸钠溶液漂洗2?5min，最后用无菌水再冲洗数次。将经表面消毒的植物样品 移入LB固体平板上，于30°C培养24h后，检查平板上是否有细菌生长。若无菌落长出，则说 明植株表面消毒成功。
[0030] 将经检验消毒完全的植株移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加无菌水充分研磨， 取上清液以5%的接种量加入到IOOmL的无机盐培养基中，并添加菲至150mg · I/1作为唯 一碳源，于30°C，180r · miiT1摇床培养7d，以5%的接种量转接到相同的培养基中，连续转 接三次后，梯度稀释富集液，取KT 4-KT7稀释度的富集液各0. ImL涂布于添加150mg· I/1 菲的无机盐平板上，于30°C恒温培养3d后，挑取长出的单菌落接种于含有150mg · I/1菲 的无机盐液体培养基中，于30°C，180r min_1摇床培养7d，验证其对菲的降解效果。无机 盐培养基配方为：NH4NO 3L Og .I/1，KH2PO4O.如·！/1，K 2HPO4L 如·！/1，NaCl LOg .I/1， MgSO4 · 7H20 0· 2g · I/1，pH 7· 0 ;固体培养基加 16g · I/1 琼脂。
[0031] 降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min，使瓶 中菲全部溶解，12000r HiirT1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤（孔径0.22 μ m)，用高 效液相色谱法测定其中的菲含量。高效液相色谱（岛津LC - 20AT，检测器型号SPD - 20A) 设定参数为：Inertsil ODS - SP - C18反相色谱柱（150mmX4. 6mm，5 μ m)，流动相为甲醇： 水=90:10，流速0.901111^1^11_1，柱温401：，紫外检测波长24511111，进样量1(^1。外标法按 峰面积定量。
[0032] 从富集液中分离到一株菲降解菌，命名为菌株Pn2。菌株Pn2降解菲前后的液相 色谱检测结果表明菌株Pn23d内对初始浓度为150mg · I/1的菲降解率大于95%。菌株 Pn2在固体培养基上生长3d后，菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，呈乳白色，有光泽，菌体 易挑起。在透射电子显微镜下该菌呈短杆状，端生鞭毛，不形成芽孢。G_，好氧生长，其生 理生化特性见表1。菌株Pn2的形态和生理生化特征和Bergey's manual of systematic bacteriology上对马赛菌的描述是一致的。
[0033] 以菌株Pn2的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩 增，得到长度为HOObp的16S rRNA基因序列（GenBank登录号为JX270637)。在RDP数据 库（https://rdp.cme. msu.edu/)中进行Blast，结果表明菌株Pn2与马赛菌属菌株的同源 性最近，与Massilia niastensis 5516S-1T菌株的序列相似性达到98%。结合生理生化 特征将该菌鉴定为马赛菌属（Massilia sp.)，将该菌送交中国微生物菌种保存管理委员会 普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 1. 12927,保藏日期为2014年8月26日。
[0034] 表1菌株Pn2的生理生化特性
[0035]
【权利要求】
1. 一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌马赛菌（Massilia sp.)Pn2,2014 年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1. 12927。
2. -种用权利要求1所述的功能内生细菌马赛菌Pn2所生产的降解菌剂，其特征在于 是通过以下方法生产而成： 1) 将保藏编号为CGMCC 1. 12927的马赛菌Pn2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养 至对数期； 2) 将上述培养好的菌种按5%的接种量接种入种子罐，培养至对数期； 3) 将种子液按10 %的接种量接入生产罐培养； 4) 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1. 2,搅拌速度为200转/ 分，培养温度为30°C，全流程培养时间为55?60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ ml以上； 其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均 为：胰蛋白胨〇. 5g · I/1，可溶性淀粉0. 5g · I/1，葡萄糖0. 5g · I/1，酵母膏0. 5g · I/1，酪蛋 白氨基酸〇. 5g吨―1，磷酸氢二钾0. 3g .I/1，丙酮酸钠0. 3g .I/1，七水合硫酸镁0. 05g .I/1， pH 7. 0 - 7. 4 ； 5) 发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至0D600nm = 0. 55,即为所 述的降解菌剂。
3. 权利要求1所述的功能内生细菌马赛菌Pn2在降解多环芳烃中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的功能内生细菌马赛菌Pn2在降解水 体，土壤或植物体内多环芳烃中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的多环芳烃选自萘、苊、蒽、菲和芘中 的任意一种或多种。
6. 权利要求2所述的降解菌剂在降解多环芳烃中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求2所述的降解菌剂在降解水体，土 壤或植物体内多环芳烃的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的多环芳烃选自萘、苊、蒽、菲和芘中 的任意一种或多种。
【文档编号】C12N1/20GK104263682SQ201410467144
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】高彦征, 刘娟, 刘爽, 孙凯 申请人:南京农业大学