人脂肪干细胞的获取方法及多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法

人脂肪干细胞的获取方法及多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法
【专利摘要】人脂肪干细胞的获取方法及多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，涉及一种脂肪干细胞的获取方法及脂肪干细胞库的构建方法。为了解决现有人脂肪干细胞的获取方法，脂肪采集方法对细胞活性破坏大及现有脂肪干细胞库中干细胞多次传代后给多人使用容易出现干细胞老化现象的问题。干细胞获取方法：一、供者的筛选；二、脂肪采集；三、脂肪的运输；四、人脂肪干细胞的分离。干细胞库的构建方法：一、供者的筛选；二、脂肪采集；三、脂肪的运输；四、人脂肪干细胞的分离；五、脂肪干细胞培养、传代、扩增；六、主细胞库建立；七、工作细胞库建立。本发明方法对细胞活性破坏较小，并建立了多人份异体使用的多级干细胞库，用于脂肪干细胞库的建立。
【专利说明】人脂肋干细胞的获取方法及多级同种异体脂肋干细胞库的 构建方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种脂肪干细胞的获取方法及脂肪干细胞库的构建方法。

【背景技术】
[0002] 脂肪干细胞（Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs 或者是称为 Adipose-Derived Mesenchymal Stromal cells, ADMSC)是从脂肪组织获得的一类有多向分化潜能的干细胞， 其在特定诱导条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等。Zuk2001年首次通过分 离人脂肪组织获得了此类具有细胞治疗潜能的干细胞，从而开创了脂肪干细胞研究和应用 的先河。经过10多年的科学研究和实践发现，脂肪干细胞是一群类似于骨髓间充质干细胞 的有再生分化能力细胞，其不表达CD34、CD45等造血细胞表面抗原，因此在生理状态下不 会分化成为血细胞和血管内皮细胞；脂肪干细胞人类白细胞HLA-DR表达阴性，因此移植过 程中就不会产生异体排斥反应，从而是一个进行异体移植的优良细胞品种；脂肪干细胞与 骨髓干细胞同样表达CD105、CD73、CD90等，适合在体外培养过程中具有贴壁生长和形成集 落等特点，因此可W实现体外培养扩增，从而为多种疾病治疗奠定了大量生产和鉴定的基 础。
[0003] 体外培养还发现，比起骨髓来源的间充质干细胞，脂肪干细胞更具有稳定性和不 易衰老性，是组织工程中不可多得的优质种子细胞；另外脂肪采集过程简单，简单吸脂手术 就可W获得大量脂肪细胞，而骨髓手术则痛苦大，不易被正常健康人群接受；脂肪组织中干 细胞数量多，Zuk等2001年和化ttori等2004年研究表明，抽取的脂肪组织中基质血管层 细胞含量大约为4X10 8。，而该些基质血管层细胞中人脂肪干细胞的比率大约在1-5%左 右研究抽取的脂肪组织中含脂肪干细胞（4-20) X 106。，而骨髓细胞中间充质干细胞比例 在30-50岁人群中仅为25?40万分之一，因此同样体积对比，脂肪中干细胞至少为骨髓中 的1000倍。脂肪干细胞比骨髓干细胞更具有较低的免疫源性，移植的时候不会被机体当作 外来物而排斥，不用配型就可进行同种异体移植，因此在市场应用中，如果可W进行统一化 管理、规模化生产后，制成统一化标准制剂，则不仅脂肪干细胞可W个体化应用，未来还可 W进行异体、规模化疾病治疗，大大提高了脂肪干细胞损伤和疾病修复中的作用。截止2014 年5月4日clinicaltrials. gov上已有102项采用脂肪来源的干细胞作为治疗手段的临 床试验报道，所涉及的临床疾病包括整形、瘦管、也力衰竭、慢性肺病、I / II型糖尿病、角 膜病、自闭症、骨关节炎等多种顽固性疾病，未来随着临床研究的逐步深入、ADSCs安全性有 效性数据积累更加完善，世界上第一个ADSCs药物治疗克隆氏病后造成的瘦管在韩国2012 年获得批准进入临床治疗，ADSCs药物的逐步上市，不论是采用自体还是异体ADSCs在疾病 的治疗和器官修复中的应用和发展将会有更大的前景。ADSCs的另一个巨大的自体应用市 场就是美容抗衰老行业，瘦身吸脂获得的单纯性脂肪进行塑形填充，往往不能维持很长时 间，一旦填充的脂肪被吸收后，就面临再次填充的问题，如果在脂肪填充的同时混合ADSCs 一起，ADSCs分化成脂肪的能力则会使填充效果得W长久维持，提高了美容塑性的效果，成 为未来美容行业个性化定制的发展方向。
[0004] 由于目前采用的脂肪干细胞培养分离技术的脂肪来源主要有2种；（1)外科手术 后获得的脂肪组织块，（2)美容吸脂手术后获得的废弃的液态脂肪。
[0005] 外科手术后来源的脂肪块虽然有完整的组织结构和细胞活性，但是由于进行外科 手术的人群少且外科手术的多属身体非健康，不是一个进行ADSCs规模化细胞库建立的主 要客户群体。
[0006] 美容吸脂技术粗略地分为手动注射器抽吸和机械吸引器抽吸两种方式。不加外 界助力的注射器吸脂法在吸脂过程虽然对细胞的冲击力小，但容易造成手术者的疲劳，因 此仅适用于吸脂量极少的过程。而且采用传统的美容行业进行的吸脂技术，注重的是减 服和塑形，并不注重吸出的脂肪活性和干细胞性能，传统的负压吸脂采取的真空度高大于 750mmHg，接近50%的脂肪细胞受到破坏，干细胞活性差，不利于高效干细胞库的建立需要。 水动力吸脂过程采用的是柔和的水压将脂肪组织冲散，然后用真空度在300mmHg左右的负 压条件进行吸脂，该无疑对未来的下游干细胞分离工作极为有利。
[0007] 进行脂肪干细胞制备并用于未来临床治疗的自体脂肪干细胞库建立适合于健康 人群和已经计划进行美容修身的人群，对于广大中老年疾病患者，采集获得自体脂肪干细 胞会由于身体健康的因素而使干细胞活性降低、扩增速度慢、分化能力弱，并不适合自体治 疗，因此采用健康的供着，进行规模化扩增，建立同种异体脂肪干细胞库并用于非健康人群 的疾病治疗和损伤修复是未来的发展方向，由于ADSCs的免疫源性低，可W进行异体移植， 从而打开了异体治疗的一扇大口。


【发明内容】

[0008] 本发明是要解决现有人脂肪干细胞的获取方法及采集脂肪时对细胞活性破坏大， 现有的脂肪干细胞库中干细胞多次传代给多人使用容易出现干细胞老化现象的问题，提供 人脂肪干细胞的获取方法及多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法。
[0009] 本发明人脂肪干细胞的获取方法，按W下步骤进行：
[0010] 一、供者的筛选：
[0011] 供者要求身体健康，供者血液中肥V、皿sAg、皿cAb、CMV、HIV、Sy地ilis、化TV和 EBV病毒检测为阴性，血液中厌氧菌、需氧菌、广谱支原体和真菌检测均为阴性，排除有既往 病史、有家族遗传病史、有吸毒史、无炎症、无伤口愈合困难和依从性差的患者，若供体为女 性则要求其处于非孕期和非生理期状态，供者对麻醉药无过敏反应；
[001引二、脂肪采集：
[0013] 对步骤一筛选后的供者进行脂肪采集，脂肪采集采用负压强度为200-350mmHg的 水动力吸脂技术，供者局部麻醉后，在腹部或者大腿切l-2mm刀口，注入50-400mL膨胀液， 并在水动力的推动下，进行低负压吸脂，吸取的脂肪直接收集到带有筛分网的无菌接收器 中，脂肪组织在接收器中停留5分钟，大部分膨胀液和筛分后的脂肪根据其比重不同自然 分离，采用50mL带帽Luer Lock注射器将获得的0. I-Imm直径的脂肪组织微球吸入注射器 中；
[0014] S、脂肪的运输：
[0015] 将步骤二采集到的脂肪组织采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输，或者将 上述已吸入脂肪的50血无菌Luer Lock注射器去掉针头，用注射器帽将注射器密封后进行 直接运送；
[0016] 四、人脂肪干细胞的分离：
[0017] 在生物安全柜中，将脂肪组织分装在50血离也管中，于1000-15(K)r/min离也 lOmin，用移液管吸取离也后的中间层脂肪组织转移于新的离也管中，加入等体积无菌生理 盐水或PBS清洗，再于1000-200化pm离也lOmin，吸取清洗后的上层脂肪置于新离也管中， 加入质量百分浓度为0. 03% -0. 06%的I型胶原酶，混匀盖好盖，于37C培养箱中震荡消 化15-30min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，将细胞息液经过75 y m孔径细胞滤 器过滤，得到单细胞息液，于1000-200化pm离也lOmin，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS 重新洗涂细胞一次，离也，沉淀即为人脂肪干细胞。
[0018] 本发明多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，按W下步骤进行：
[001引一、供者的筛选：
[0020] 供者要求身体健康，供者血液中HCV、皿sAg、皿cAb、CMV、HIV、Sy地ilis、化TV和 EBV病毒检测为阴性，血液中厌氧菌、需氧菌、广谱支原体和真菌检测均为阴性，排除有既 往病史、有家族遗传病史、有吸毒史、无炎症、无伤口愈合困难和依从性差的患者，若供体为 女性则要求其处于非孕期和非生理期状态，供者对麻醉药无过敏反应；所述供者的年龄为 18-40 岁；
[0021] 二、脂肪采集：
[0022] 对步骤一筛选后的供者进行脂肪采集，脂肪采集采用负压强度为200-350mmHg的 水动力吸脂技术，供者局部麻醉后，在腹部或者大腿切l-2mm刀口，注入50-400mL膨胀液， 并在水动力的推动下，进行低负压吸脂，吸取的脂肪直接收集到带有筛分网的无菌接收器 中，脂肪组织在接收器中停留5分钟，大部分膨胀液和筛分后的脂肪根据比重不同自然分 离，采用50mL带帽Luer Lock注射器将获得的0. I-Imm直径的脂肪组织微球吸入注射器中， 注射器中的脂肪细胞活率大于80%，脂肪重量为30-100克；
[002引 S、脂肪的运输：
[0024] 将步骤二采集到的脂肪组织采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输，或者将 上述已吸入脂肪的50血无菌Luer Lock注射器去掉针头，用注射器帽将注射器密封后进行 直接运送；
[0025] 所述采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输的具体操作过程是；用无菌50mL 注射器将脂肪转移到装有DMEM保存液的脂肪采集运输瓶中，运输瓶用弹性胶圈固定在运 输试剂盒中，试剂盒两侧放置冰袋的位置中放入冰袋，使得运输试剂盒运输温度保持在 4-12C，脂肪样品在1小时内运输到洁净生产车间进行脂肪干细胞分离；
[0026] 所述用注射器帽将注射器密封后进行直接运送的过程中，将带帽注射器的帽朝下 垂直摆放，使得运输过程中残留的膨胀液和脂肪细胞分离，注射器所处环境温度为4-12C ;
[0027] 四、人脂肪干细胞的分离：
[0028] 在生物安全柜中，将脂肪组织分装在50血离也管中，于1000-15(K)r/min离也 lOmin，用移液管吸取离也后的中间层脂肪组织转移于新的离也管中，加入等体积无菌生理 盐水或PBS清洗，再于1000-200化pm离也lOmin，吸取清洗后的上层脂肪置于新离也管中， 加入质量百分浓度为0. 03% -0. 06%的I型胶原酶，混匀盖好盖，于37C培养箱中震荡消 化15-30min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，将细胞息液经过75 y m孔径细胞滤 器过滤，得到单细胞息液，于1000-200化pm离也lOmin，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS 重新洗涂细胞一次，离也，沉淀即为人脂肪干细胞；
[0029] 五、脂肪干细胞培养、传代、扩增：
[0030] 对步骤四获得的人脂肪干细胞进行细胞计数，W接种浓度3X IO4个/Cm2-SX 1〇4 个/cm2接种于培养瓶中进行原代培养，在37C、5 %的0)2培养箱中，每隔2-3天更换新鲜 培养基，待细胞融合度达到70% -80%后，采用IXTrypLE Select于37C消化3分钟，力口 入等体积PBS或生理盐水稀释，反复吹打，将细胞清洗干净，然后将清洗后的细胞移入50mL 离也管中，离也5min，离也速度为1000-2000巧m，弃上清液，将细胞重息于新的无血清培养 基，按照1:3-6的传代比例，传代到新培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增Pl代培养，扩 增过程每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70%-80 %后，如此重复上述 的细胞消化传代过程，完成P2和P3代传代和扩增培养，待P3代细胞融合度达到70 % -80 % 后，用于建立主细胞库；原代培养所用培养基为无血清培养基或者MesenGro培养基；
[0031] 六、主细胞库建立：
[0032] 将步骤五获得的P3代人脂肪干细胞采用PBS或者生理盐水清洗，采用1 XTrypLE Select37C消化3分钟，加入PBS或者生理盐水，并进行吹打，收集分散后的细胞息液于 50mL离也管中，取部分进行细胞计数、细胞活率测定，其余细胞息液离也5min，离也速度 为1000-20(K)巧m，留上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌、梅毒和病毒检测，弃多余上 清液，将细胞按照细胞最终浓度2 X IO6个/mL重息于化yoStor CSlO冻存液中，并分装在 40-70根2mL的冻存管中，每管ImU冻存管贴上防冻条码标签，进行冷冻保存；
[0033] 走、工作细胞库建立：
[0034] 从液氮罐中取主细胞库冻存管2-3支，在37C水浴中迅速复苏融化后，将细胞转 移至无血清培养基或者MesenGro培养基中，按照0. 5X IO4个/cm2-2X IO4个/cm2的接种 浓度接种于培养瓶中进行P4代培养，在37C、5%的C〇2培养箱中，采用无血清培养基或者 MesenGro培养基进行培养，每隔2-3天更换新鲜培养基，待细胞融合度达到70% -80 %后， 采用IXTrypLE Select于37C消化3分钟，加入等量PBS或者生理盐水稀释收集消化后的 细胞于50血离也管中，离也5min，离也速度为1000-200化pm,弃上清液，将细胞重息于新的 无血清培养基，按照1:3-6的传代比例，传代到新的培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增 P5代培养，扩增过程每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70-80%后，进 行工作细胞库建立工作；
[00巧]培养的P5代细胞采用PBS或者生理盐水洗去培养基，采用IXTrypLE Select37°C 消化3分钟，加入PBS或者生理盐水，并用移液管进行吹打，收集分散后的细胞息液于 50mL离也管中，取部分进行细胞计数、细胞活率测定，其余细胞息液离也5min，离也速度 为1000-20(K)巧m，留上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌、梅毒和病毒检测，弃多余上 清液，将细胞按照细胞最终浓度2 X IO6个/mL重息于化yoStor CSlO冻存液中，并分装在 60-90支2mL的冻存管中，每管ImU冻存管贴上防冻条码标签，进行冷冻保存，即完成多级 同种异体脂肪干细胞库的构建。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 1、细胞活性破坏小。传统的脂肪采集方式为真空度大于750mmHg的震动辅助吸脂 技术，对脂肪组织的破坏大，采集的脂肪中的脂肪干细胞也受到破坏，干细胞的活率一般低 于40%，传统吸脂术适合于单纯减服吸脂，而对脂肪的重新利用要求则无法满足。因此W传 统方法在相同的脂肪体积中获得的脂肪干细胞数量就少，本技术采用低真空度的水动力吸 脂技术，将真空度控制在200-350mmHg，对细胞破坏小，完全克服了上述问题。
[0038] 2、操作简便。一般的吸脂术和外科手术来的脂肪块大，带有较多的结缔组织和血 管组织，因此在前期操作中要进行剥离过程，而本方法经过初期细胞筛分，获得的组织基本 W散在脂肪细胞存在，不需要进行结缔组织和血管的剥离。
[0039] 3、不用机械破碎程序。本发明专利中将水动力吸取的已经松散度高的脂肪组织再 次用筛网进行了组织筛分，获得的颗粒度分布在0. I-Imm范围内，特别是分布在0. 1-0. 5mm 范围内，特别适合用于下一步脂肪干细胞分离试验，此方法避免了采用将传统吸脂术获得 的较大脂肪组织的机械剪碎的程序，即简化了工艺，又减少了对组织细胞的破坏过程。
[0040] 4、省时。由于细胞团块小，因此本发明采用的胶原酶消化过程进行可W仅采 用一种胶原酶且浓度很低，一般的酶消化过程采用胶原酶I、II、IV两个或者H个联合 进行消化，脂肪酶的浓度也大于0. 1 %、消化时间超过1-2小时，而本发明则只要浓度 0. 04-0. 05%，消化时间也仅在5-20min，一般采用15min就可W，因此大大节省了成本和时 间。
[0041] 5、前人的脂肪干细胞库主要是进行自体干细胞储存。自体储存主要是给自己使 用，需要的扩增的脂肪干细胞数量少，因此不涉及到建立多级细胞库。自体库主要是自存 自用。但是有很多情形自己的脂肪干细胞无法正常获取，如1)当客户有吸脂也理障碍，糖 尿病等造成伤口愈合能力差，静脉曲张或静脉炎者，如皮肤有炎症、过敏、局部皮肤有感染 病灶及较多疲痕者，也肺等主要脏器功能障碍者，皮肤严重松弛而皮下脂肪组织过少者，病 态服胖者、或母亲服胖综合征者是无法进行吸脂手术的，该些人群为吸脂禁忌症，获得自体 脂肪干细胞就困难；2)对于希望采用脂肪干细胞移植的年龄低于18岁的人群，因为身体发 育的需要，不适合进行吸脂手术；3)脂肪干细胞的活性、数量和分化能力、营养调节和免疫 调节能力都随着年龄的改变有所改变，因此对于年龄超过60岁，需要进行脂肪干细胞移植 时，获得健康的自体脂肪干细胞困难；4)日益严重的食品问题、家装污染、病毒侵害、空气 雾靈、莫氧层破坏等造成福射危害日益严重，该些对人们身体健康的影响是影响到每一个 器官、每一个组织、每一个细胞，该也包括脂肪干细胞。因此在看似健康的人群中，其脂肪干 细胞的基因和表观遗传学上已经悄然发生变化，该种情形下采用自己的脂肪干细胞修复就 不如选择一个经过严格年龄、遗传疾病、基因变异等筛选的健康供着的脂肪干细胞进行移 植。
[0042] 6、建库采用的吸脂方式有多种，本专利采用的是可W获得分散度高的脂肪微团的 吸脂方式，获得的脂肪利用率高，即使是建立多人份的脂肪干细胞库也不需要太多的脂肪， 对供者造成的伤害降低到了最小。
[0043] 7、采用一支干细胞多次传代给多人使用会出现干细胞老化现象，因此为了建立多 人份异体使用的干细胞库，就要建立多级干细胞库，本专利采用两级细胞库方法，第一级为 主细胞库，由40-70支P3代脂肪干细胞组成。第二级为工作细胞库，由P5代脂肪干细胞组 成。当工作细胞库细胞用完之后，从主细胞库采用3只主细胞库细胞，就可W又建立一个 60-90份的工作细胞库。因此从一个健康供者，就可W给800-2100(40/3*60 = 800, 70/3*90 =2100)人份的使用。

【专利附图】

【附图说明】
[0044] 图1为多级脂肪干细胞库建库流程；图2为冻存前脂肪间充质干细胞形态图；图3 为脂肪干细胞分化成骨细胞；图4为脂肪干细胞分化成软骨细胞；图5为脂肪干细胞分化 成脂肪细胞；图6为培养后的脂肪干细胞细胞周期。

【具体实施方式】
[0045] 本发明技术方案不局限于W下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。

【具体实施方式】 [0046] 一：本实施方式人脂肪干细胞的获取方法，按W下步骤进行：
[0047] -、供者的筛选：
[0048] 供者要求身体健康，供者血液中HCV、皿sAg、皿cAb、CMV、HIV、Sy地ilis、化TV和 EBV病毒检测为阴性，血液中厌氧菌、需氧菌、广谱支原体和真菌检测均为阴性，排除有既往 病史、有家族遗传病史、有吸毒史、无炎症、无伤口愈合困难和依从性差的患者，若供体为女 性则要求其处于非孕期和非生理期状态，供者对麻醉药无过敏反应；
[004引二、脂肪采集：
[0050] 对步骤一筛选后的供者进行脂肪采集，脂肪采集采用负压强度为200-350mmHg的 水动力吸脂技术，供者局部麻醉后，在腹部或者大腿切l-2mm刀口，注入50-400mL膨胀液， 并在水动力的推动下，进行低负压吸脂，吸取的脂肪直接收集到带有筛分网的无菌接收器 中，脂肪组织在接收器中停留5分钟，大部分膨胀液和筛分后的脂肪根据其比重不同自然 分离，采用50mL带帽Luer Lock注射器将获得的0. I-Imm直径的脂肪组织微球吸入注射器 中；
[0051] S、脂肪的运输：
[0052] 将步骤二采集到的脂肪组织采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输，或者将 上述已吸入脂肪的50血无菌Luer Lock注射器去掉针头，用注射器帽将注射器密封后进行 直接运送；
[0053] 四、人脂肪干细胞的分离：
[0054] 在生物安全柜中，将脂肪组织分装在50血离也管中，于1000-15(K)r/min离也 lOmin，用移液管吸取离也后的中间层脂肪组织转移于新的离也管中，加入等体积无菌生理 盐水或PBS清洗，再于1000-200化pm离也lOmin，吸取清洗后的上层脂肪置于新离也管中， 加入质量百分浓度为0. 03% -0. 06%的I型胶原酶，混匀盖好盖，于37C培养箱中震荡消 化15-30min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，将细胞息液经过75 y m孔径细胞滤 器过滤，得到单细胞息液，于1000-200化pm离也lOmin，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS 重新洗涂细胞一次，离也，沉淀即为人脂肪干细胞。

【具体实施方式】 [0055] 二；本实施方式与一不同的是；步骤一所述供者的年 龄为18-40岁。其它与一相同。

【具体实施方式】 [0056] H ;本实施方式与一或二不同的是：步骤二中水动力 吸脂技术的负压强度为210-300mmHg。其它与一或二相同。

【具体实施方式】 [0057] 四；本实施方式与一至H之一不同的是：步骤二注射 器中的脂肪细胞活率大于80 %，脂肪重量为30-100克。其它与一至H之一相 同。

【具体实施方式】 [0058] 五；本实施方式与一至四之一不同的是：步骤H中所 述采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输的具体操作过程是：用无菌50mL注射器将脂 肪转移到装有DMEM保存液的脂肪采集运输瓶中，运输瓶用弹性胶圈固定在运输试剂盒中， 试剂盒两侧放置冰袋的位置中放入冰袋，使得运输试剂盒运输温度保持在4-12C，脂肪样 品在1小时内运输到洁净生产车间进行脂肪干细胞分离。其它与一至四之一 相同。
[0059] 所述多功能脂肪采集、运输试剂盒已在专利201320810155. 2中公开。

【具体实施方式】 [0060] 六；本实施方式与一至五之一不同的是：步骤H中所 述用注射器帽将注射器密封后进行直接运送的过程中，将带帽注射器的帽朝下垂直摆放， 使得运输过程中残留的膨胀液和脂肪细胞分离开来，注射器所处环境温度为4-12C。其它 与一至五之一相同。

【具体实施方式】 [0061] 走：本实施方式多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，按W下步 骤进行：
[0062] 一、供者的筛选：
[0063] 供者要求身体健康，供者血液中HCV、皿sAg、皿cAb、CMV、HIV、Sy地ilis、化TV和 EBV病毒检测为阴性，血液中厌氧菌、需氧菌、广谱支原体和真菌检测均为阴性，排除有既 往病史、有家族遗传病史、有吸毒史、无炎症、无伤口愈合困难和依从性差的患者，若供体为 女性则要求其处于非孕期和非生理期状态，供者对麻醉药无过敏反应；所述供者的年龄为 18-40 岁；
[0064] 二、脂肪采集：
[0065] 对步骤一筛选后的供者进行脂肪采集，脂肪采集采用负压强度为200-350mmHg的 水动力吸脂技术，供者局部麻醉后，在腹部或者大腿切l-2mm刀口，注入50-400mL膨胀液， 并在水动力的推动下，进行低负压吸脂，吸取的脂肪直接收集到带有筛分网的无菌接收器 中，脂肪组织在接收器中停留5分钟，大部分膨胀液和筛分后的脂肪根据比重不同自然分 离，采用50mL带帽Luer Lock注射器将获得的0. I-Imm直径的脂肪组织微球吸入注射器中， 注射器中的脂肪细胞活率大于80%，脂肪重量为30-100克；
[006引 S、脂肪的运输：
[0067] 将步骤二采集到的脂肪组织采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输，或者将 上述已吸入脂肪的50血无菌Luer Lock注射器去掉针头，用注射器帽将注射器密封后进行 直接运送；
[0068] 所述采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输的具体操作过程是；用无菌50mL 注射器将脂肪转移到装有DMEM保存液的脂肪采集运输瓶中，运输瓶用弹性胶圈固定在运 输试剂盒中，试剂盒两侧放置冰袋的位置中放入冰袋，使得运输试剂盒运输温度保持在 4-12C，脂肪样品在1小时内运输到洁净生产车间进行脂肪干细胞分离；
[0069] 所述用注射器帽将注射器密封后进行直接运送的过程中，将带帽注射器的帽朝下 垂直摆放，使得运输过程中残留的膨胀液和脂肪细胞分离，注射器所处环境温度为4-12C ;
[0070] 四、人脂肪干细胞的分离：
[0071] 在生物安全柜中，将脂肪组织分装在50血离也管中，于1000-15(K)r/min离也 lOmin，用移液管吸取离也后的中间层脂肪组织转移于新的离也管中，加入等体积无菌生理 盐水或PBS清洗，再于1000-200化pm离也lOmin，吸取清洗后的上层脂肪置于新离也管中， 加入质量百分浓度为0. 03% -0. 06%的I型胶原酶，混匀盖好盖，于37C培养箱中震荡消 化15-30min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，将细胞息液经过75 y m孔径细胞滤 器过滤，得到单细胞息液，于1000-200化pm离也lOmin，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS 重新洗涂细胞一次，离也，沉淀即为人脂肪干细胞；
[0072] 五、脂肪干细胞培养、传代、扩增：
[0073] 对步骤四获得的人脂肪干细胞进行细胞计数，W接种浓度3X IO4个/Cm2-SX 1〇4 个/cm2接种于培养瓶中进行原代培养，在37C、5 %的0)2培养箱中，每隔2-3天更换新鲜 培养基，待细胞融合度达到70% -80%后，采用IXTrypLE Select于37C消化3分钟，力口 入等体积PBS或生理盐水稀释，反复吹打，将细胞清洗干净，然后将清洗后的细胞移入50mL 离也管中，离也5min，离也速度为1000-2000巧m，弃上清液，将细胞重息于新的无血清培养 基，按照1:3-6的传代比例，传代到新培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增Pl代培养，扩 增过程每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70 %-80 %后，如此重复上述 的细胞消化传代过程，完成P2和P3代传代和扩增培养，待P3代细胞融合度达到70 % -80 % 后，用于建立主细胞库；原代培养所用培养基为无血清培养基或者MesenGro培养基；
[0074] 六、主细胞库建立：
[00巧]将步骤五获得的P3代人脂肪干细胞采用PBS或者生理盐水清洗，采用IXTrypLE Select37°C消化3分钟，加入PBS或者生理盐水，并进行吹打，收集分散后的细胞息液于 50mL离也管中，取部分进行细胞计数、细胞活率测定，其余细胞息液离也5min，离也速度 为1000-20(K)巧m，留上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌、梅毒和病毒检测，弃多余上 清液，将细胞按照细胞最终浓度2 X IO6个/mL重息于化yoStor CSlO冻存液中，并分装在 40-70根2mL的冻存管中，每管ImU冻存管贴上防冻条码标签，进行冷冻保存；
[0076] 走、工作细胞库建立：
[0077] 从液氮罐中取主细胞库冻存管2-3支，在37C水浴中迅速复苏融化后，将细胞转 移至无血清培养基或者MesenGro培养基中，按照0. 5 X IO4个/cm2-2 X IO4个/cm2的接种 浓度接种于培养瓶中进行P4代培养，在37C、5%的C〇2培养箱中，采用无血清培养基或者 MesenGro培养基进行培养，每隔2-3天更换新鲜培养基，待细胞融合度达到70% -80%后， 采用IXTrypLE Select于37C消化3分钟，加入等量PBS或者生理盐水稀释收集消化后的 细胞于50血离也管中，离也5min，离也速度为1000-200化pm,弃上清液，将细胞重息于新的 无血清培养基，按照1:3-6的传代比例，传代到新的培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增 P5代培养，扩增过程每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70-80 %后，进 行工作细胞库建立工作；
[0078] 培养的P5代细胞采用PBS或者生理盐水洗去培养基，采用IXTrypLE Select37°C 消化3分钟，加入PBS或者生理盐水，并用移液管进行吹打，收集分散后的细胞息液于 50mL离也管中，取部分进行细胞计数、细胞活率测定，其余细胞息液离也5min，离也速度 为1000-20(K)巧m，留上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌、梅毒和病毒检测，弃多余上 清液，将细胞按照细胞最终浓度2 X IO6个/mL重息于化yoStor CSlO冻存液中，并分装在 60-90支2mL的冻存管中，每管ImU冻存管贴上防冻条码标签，进行冷冻保存，即完成多级 同种异体脂肪干细胞库的构建。
[0079] 步骤五所述无血清培养基为购买自Life Technologies公司的产品CTS StemPro MSC Xeno Rree。所述 MesenGro 购买自 Stem畑公司。
[0080] 本实施方式主细胞库和工作细胞库的脂肪干细胞在冻存前需要进行厌氧细菌菌、 需氧细菌、真菌、支原体、己肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、巨细胞病毒、邸病毒检和梅毒螺旋 体检测，确保细胞库内的样本没有外来微生物污染；在细胞冻存前和复苏后进行细胞活性 检测，确保冻存后的细胞未遭到损伤。
[0081] 对脂肪干细胞的鉴定，采用的是对冻存前脂肪干细胞表面标志物检测和细胞分化 能力检测（包括成脂肪分化能力、软骨分化能力、骨细胞分化能力H种）。对于脂肪干细胞 细胞周期稳定性检查、内毒素检查、核型分析，是在工作细胞库实际应用发放前进行检查。

【具体实施方式】 [0082] 八；本实施方式与走不同的是；步骤六所述病毒检测 为己肝、丙肝、艾滋、EB、CMV和HTLV检测。其它与走相同。

【具体实施方式】 [0083] 九；本实施方式与走不同的是；步骤六中冷冻保存的 具体方法为；将冻存管首先置于4C冰箱中，平衡30min，同时准备程序冷冻仪，将仪器降温 至4C后，将平衡好的细胞冻存管放入进行程序冻存处理，依次W-0.7°C/min速度从4C降 温至-1 TC，W -25C /min从-1 TC降温至-6(TC并停留1分钟，W +IOC /min速度从-6(TC 复温至-25°C，然后再W -0. 7°C /min速度从-25°C降温至-45°C，W -5°C /min速度从-45°C 降温至-6(TC，W -1(TC /min速度从-6(TC降温至-95°C，并在此温度平衡IOmin的冷冻程 序，最后将样本转移入-196C液氮罐中，在-150?-18(TC的液氮气相中长期保存。其它与 走相同。

【具体实施方式】 [0084] 十；本实施方式与走不同的是；步骤走中冷冻保存的 具体方法为；将冻存管首先置于4C冰箱中，平衡30min，同时准备程序冷冻仪，将仪器降温 至4C后，将平衡好的细胞冻存管放入进行程序冻存处理。分别W -0. 7C /min速度从4C降 温至-1 TC，W -25C /min从-1 TC降温至-6(TC并停留1分钟，W +IOC /min速度从-6(TC 复温至-25°C，然后再W -0. 7°C /min速度从-25°C降温至-45°C，W -5°C /min速度从-45°C 降温至-6(TC，W -1(TC /min速度从-6(TC降温至-95°C并在此温度平衡IOmin的冷冻程序， 最后将样本转移入-196C液氮罐中，在-150?-18(TC的液氮气相中长期保存。其它与具 体实施方式走相同。
[0085] 实验 1 :
[0086] -、脂肪采集及运输；对筛选后的供者进行脂肪采集，设定水动力吸脂设备的吸脂 负压强度为300mmHg，在水动力的推动下，缓慢吸取脂肪并将吸取的脂肪在真空导管的引导 下收集到上下均有筛网的脂肪收集器中，其中脂肪纤维块被上层滤网去除，大部分膨胀液 由收集器下面的筛分网滤去，用于脂肪干细胞提取的是收集在脂肪收集器中层的无菌脂肪 微团直径为0. 1-0. 5mm的脂肪组织微球，将此中层脂肪微团100克吸取到4个50mL注射器 中，去掉针头，用注射器帽盖将注射器密封后运输到干细胞制备车间。
[0087] 二、脂肪细胞活率：取2血脂肪组织微团，加入含有胶原酶I的生理盐水4mU生 理盐水中胶原酶I的浓度为0. 04% (w/v)，在37C 5% 0)2培养箱内震荡消化12min，取消 化后细胞重复打散后，经75 y m孔径的细胞筛过滤，得到单细胞息液，用台盼蓝I: I染色后 显微镜观察，记录有总细胞数和蓝色死细胞数，按照脂肪细胞活率=100% X (脂肪细胞总 数-死细胞数）/脂肪细胞总数公式进行计算，脂肪细胞活率为82 %。
[0088] H、脂肪干细胞分离：在生物安全柜中，将接收的盛装脂肪微团的4个50mL注射 器中分层后的膨胀液去掉，用等体积的生理盐水洗涂脂肪微团两次，每次5分钟，120化pm 离也后将脂肪层转移到新的离也管中，加入含有I型胶原酶的生理盐水，使得最终反应液 中的I型胶原酶浓度为0.05%，在37C 5% 0)2培养箱内震荡消化15min，消化后的细胞 息液在1500巧m下离也lOmin，弃去上层的脂肪细胞和中层的生理盐水，收集沉淀的富含脂 肪干细胞的基质血管成分（SVF)，用台盼蓝对脂肪基质血管组分进行细胞计数，W接种浓度 6 X l〇Ycm2接种于细胞培养瓶中进行原代培养。
[0089] 四、主细胞库细胞培养：在37°C、5 %的(?培养箱中，采用无血清培养基CTS StemPro MSC Xeno化ee进行培养，每隔2天更换一次新鲜培养基，待到细胞长到80 %融合 度后，加入IXTrypLE Select37°C进行消化3分钟，加入等量PBS或者生理盐水稀释收集 消化后的细胞于50血离也管中，150化pm离也lOmin。弃上清液，将细胞重息于新的无血清 培养基，采用台酷蓝进行细胞总数记录和活细胞数记录，按照1:3-1:6比例且接种密度在 0. 5 X IO4个/cm2将PO代细胞传代到新的多层培养瓶中进行培养，加入无血清培养基进行 扩增Pl代培养，扩增过程每隔2天更换新鲜无血清培养基，待到细胞长到70%融合度后， 如此重复上述的细胞消化传代过程，顺序完成P2、P3代脂肪干细胞的扩增、传代培养，待P3 代脂肪干细胞融合度达到80%后进行主细胞库建立工作。
[0090] 五、主细胞库建立；培养的P3代细胞采用生理盐水洗两遍去除残留培养基，加入 1 XTrypLE Select37°C消化2分钟，待干细胞成球形脱离培养瓶底部后，加入生理盐水稀释 消化液并用移液管进行轻柔吹打细胞息液，收集分散后的单个的细胞于50ml离也管中。取 10微升细胞按照1:1的比例与台酷蓝染色液混合后，记录干细胞活率为98. 5%。将细胞息 液采用120化pm速度离也5min，留细胞上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌、己肝、丙 肝、梅毒、艾滋病毒、巨细胞病毒、化TV、邸病毒和内毒素等项检测。弃多余上清液，将干细 胞按照细胞最终浓度2 X IO6个/血重息于化yoStor CSlO冻存液中，并分装于65根2血冻 存管中，每管ImU冻存管贴上防冻条码标签。
[0091] 细胞冻存管首先置于4C冰箱中，平衡30min，同时准备程序冷冻仪，将仪器降温 至4C后，将平衡好的细胞冻存管放入进行程序冻存处理。分别W -0. 7C /min速度从4C降 温至-1 TC，W -25C /min从-1 TC降温至-6(TC并停留1分钟，W +IOC /min速度从-6(TC 复温至-25°C，然后再W -0. 7°C /min速度从-25°C降温至-45°C，W -5°C /min速度从-45°C 降温至-6(TC，W -1(TC /min速度从-6(TC降温至-95°C并在此温度平衡IOmin的冷冻程序， 最后将样本转移入-196C液氮展暂存罐中，在-150?-18(TC的液氮气相中保存，待细胞各 项质量指标检测合格后采用液氮转移管将此主细胞库细胞转移至最终液氮储存罐中长期 保存。
[0092] 六、工作细胞库细胞培养：从液氮罐中取主细胞库冻存管3支，在37C水浴中晃 动快速细胞复苏，立即将刚刚完全融化P3代细胞转移至MesenGro培养基，按照接种浓度 1 X IO4个/cm2接种于培养瓶中进行P4代培养。在37°C、5%的C〇2培养箱中，采用无血清 培养基MesenGro进行培养，每隔2天更换新鲜培养基，待到细胞长到80 %融合度后，采用 IXTrypLE Select3rC进行消化3分钟，加入等量PBS稀释收集消化后的细胞于50血离 也管中，离也5min，离也速度为1500巧m，弃上清液，将细胞重息于新的无血清培养基，按照 1:4的比例传代，传代到新的多层培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增P5代细胞培养，扩 增过程每隔2天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达长到70 % -80 %后，进行工作细胞 库建立工作。
[0093] 走、工作细胞库建立；培养的P5代细胞在培养瓶中，采用生理盐水洗两次洗去培 养基，采用IXTrypLE Select37°C消化2. 5分钟，加入生理盐水并移液管进行轻柔吹打，收 集分散后的单个的细胞于50ml离也管中，进行台酷蓝染色细胞计数、细胞活率测定，离也 5min，离也速度为HOOrpm,留细胞上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌和病毒等项检 巧Ij，弃多余上清液，将细胞按照细胞最终浓度2 X IO6个/mL重息于化yoStor CSlO冻存液 中，并分装在75根2mL冻存管中，每管ImU冻存管贴上防冻条码标签。
[0094] 细胞冻存管首先置于4C冰箱中，平衡30min，同时准备程序冷冻仪，将仪器降温 至4C后，将平衡好的细胞冻存管放入进行程序冻存处理。分别W -0. 7C /min速度从4C降 温至-1 TC，W -25C /min从-1 TC降温至-6(TC并停留1分钟，W +IOC /min速度从-6(TC 复温至-25°C，然后再W -0. 7°C /min速度从-25°C降温至-45°C，W -5°C /min速度从-45°C 降温至-6(TC，W -1(TC /min速度从-6(TC降温至-95°C并在此温度平衡IOmin的冷冻程序， 最后将样本转移入-196C液氮罐中，在-150?-18(TC的液氮气相中长期保存。过程中需 要进行的检测：冻存前后的无菌、无病毒检测，细胞冻存前活性和复苏后活性检测，细胞内 毒素检查、细胞表面标志物检查、细胞分化能力。
[0095] 八、主细胞库/工作细胞库中脂肪干细胞样本外源物质检查；P3代主细胞库冻存 前，取消化后的离也细胞上清液3mU进行微生物检测。其中需氧/厌氧细菌、真菌的检查采 用直接培养法，己肝病毒、丙肝病毒、艾滋病等病毒、巨细胞病毒、化TV、邸病毒等项检测采 用化ISA法，其中丙肝和艾滋加测PCR法，梅毒螺旋体是分别采取血清检测（TRUST)和明胶 凝集检测（TPPA)两项检测法，支原体采用固体培养法和PCR法，内毒素采用當试剂法。检 测结果如表1 ;
[0096] 表 1
[0097]

【权利要求】
1. 人脂肪干细胞的获取方法，其特征在于该方法按以下步骤进行： 一、 供者的筛选： 供者要求身体健康，供者血液中HCV、HBsAg、HBcAb、CMV、HIV、Syphi 1 is、HLTV和EBV病 毒检测为阴性，血液中厌氧菌、需氧菌、广谱支原体和真菌检测均为阴性，排除有既往病史、 有家族遗传病史、有吸毒史、无炎症、无伤口愈合困难和依从性差的患者，若供体为女性则 要求其处于非孕期和非生理期状态，供者对麻醉药无过敏反应； 二、 脂肪采集： 对步骤一筛选后的供者进行脂肪采集，脂肪采集采用负压强度为200-350mmHg的水动 力吸脂技术，供者局部麻醉后，在腹部或者大腿切l_2mm刀口，注入50-400mL膨胀液，并在 水动力的推动下，进行低负压吸脂，吸取的脂肪直接收集到带有筛分网的无菌接收器中，月旨 肪组织在接收器中停留5分钟，大部分膨胀液和筛分后的脂肪根据其比重不同自然分离， 采用50mL带帽Luer Lock注射器将获得的0. 1-1_直径的脂肪组织微球吸入注射器中； 三、 脂肪的运输： 将步骤二采集到的脂肪组织采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输，或者将上述 已吸入脂肪的50mL无菌Luer Lock注射器去掉针头，用注射器帽将注射器密封后进行直接 、一 、?》/ 送； 四、 人脂肪干细胞的分离： 在生物安全柜中，将脂肪组织分装在50mL离心管中，于1000-1500r/min离心lOmin， 用移液管吸取离心后的中间层脂肪组织转移于新的离心管中，加入等体积无菌生理盐水 或PBS清洗，再于1000-2000rpm离心lOmin，吸取清洗后的上层脂肪置于新离心管中，力口 入质量百分浓度为〇. 03% -0. 06%的I型胶原酶，混匀盖好盖，于37°C培养箱中震荡消化 15-30min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，将细胞悬液经过75 y m孔径细胞滤器 过滤，得到单细胞悬液，于1000-2000rpm离心lOmin，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS重 新洗涤细胞一次，离心，沉淀即为人脂肪干细胞。
2. 根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的获取方法，其特征在于步骤一所述供者的年 龄为18-40岁。
3. 根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的获取方法，其特征在于步骤二中水动力吸脂 技术的负压强度为210-300mmHg。
4. 根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的获取方法，其特征在于步骤二注射器中的脂 肪细胞活率大于80%，脂肪重量为30-100克。
5. 根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的获取方法，其特征在于步骤三中所述采用多 功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输的具体操作过程是：用无菌50mL注射器将脂肪转移到 装有DMEM保存液的脂肪采集运输瓶中，运输瓶用弹性胶圈固定在运输试剂盒中，试剂盒两 侧放置冰袋的位置中放入冰袋，使得运输试剂盒运输温度保持在4-12°C，脂肪样品在1小 时内运输到洁净生产车间进行脂肪干细胞分离。
6. 根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的获取方法，其特征在于步骤三中所述用注射 器帽将注射器密封后进行直接运送的过程中，将带帽注射器的帽朝下垂直摆放，使得运输 过程中残留的膨胀液和脂肪细胞分离开来，注射器所处环境温度为4-12°C。
7. 多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行： 一、 供者的筛选： 供者要求身体健康，供者血液中HCV、HBsAg、HBcAb、CMV、HIV、Syphi 1 is、HLTV和EBV病 毒检测为阴性，血液中厌氧菌、需氧菌、广谱支原体和真菌检测均为阴性，排除有既往病史、 有家族遗传病史、有吸毒史、无炎症、无伤口愈合困难和依从性差的患者，若供体为女性则 要求其处于非孕期和非生理期状态，供者对麻醉药无过敏反应；所述供者的年龄为18-40 岁； 二、 脂肪采集： 对步骤一筛选后的供者进行脂肪采集，脂肪采集采用负压强度为200-350mmHg的水动 力吸脂技术，供者局部麻醉后，在腹部或者大腿切l_2mm刀口，注入50-400mL膨胀液，并在 水动力的推动下，进行低负压吸脂，吸取的脂肪直接收集到带有筛分网的无菌接收器中，月旨 肪组织在接收器中停留5分钟，大部分膨胀液和筛分后的脂肪根据比重不同自然分离，采 用50mL带帽Luer Lock注射器将获得的0. 1-1_直径的脂肪组织微球吸入注射器中，注射 器中的脂肪细胞活率大于80%，脂肪重量为30-100克； 三、 脂肪的运输： 将步骤二采集到的脂肪组织采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输，或者将上述 已吸入脂肪的50mL无菌Luer Lock注射器去掉针头，用注射器帽将注射器密封后进行直接 、一 、?》/ 送； 所述采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输的具体操作过程是：用无菌50mL注射 器将脂肪转移到装有DMEM保存液的脂肪采集运输瓶中，运输瓶用弹性胶圈固定在运输试 剂盒中，试剂盒两侧放置冰袋的位置中放入冰袋，使得运输试剂盒运输温度保持在4-12°C， 脂肪样品在1小时内运输到洁净生产车间进行脂肪干细胞分离； 所述用注射器帽将注射器密封后进行直接运送的过程中，将带帽注射器的帽朝下垂直 摆放，使得运输过程中残留的膨胀液和脂肪细胞分离，注射器所处环境温度为4-12°C ; 四、 人脂肪干细胞的分离： 在生物安全柜中，将脂肪组织分装在50mL离心管中，于1000-1500r/min离心lOmin， 用移液管吸取离心后的中间层脂肪组织转移于新的离心管中，加入等体积无菌生理盐水 或PBS清洗，再于1000-2000rpm离心lOmin，吸取清洗后的上层脂肪置于新离心管中，力口 入质量百分浓度为〇. 03% -0. 06%的I型胶原酶，混匀盖好盖，于37°C培养箱中震荡消化 15-30min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，将细胞悬液经过75 y m孔径细胞滤器 过滤，得到单细胞悬液，于1000-2000rpm离心lOmin，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS重 新洗涤细胞一次，离心，沉淀即为人脂肪干细胞； 五、 脂肪干细胞培养、传代、扩增： 对步骤四获得的人脂肪干细胞进行细胞计数，以接种浓度3X 104个/cm2-8X 104个/ cm2接种于培养瓶中进行原代培养，在37°C、5%的C02培养箱中，每隔2-3天更换新鲜培养 基，待细胞融合度达到70% -80%后，采用lXTrypLESelect于37°C消化3分钟，加入等体 积PBS或生理盐水稀释，反复吹打，将细胞清洗干净，然后将清洗后的细胞移入50mL离心管 中，离心5min，离心速度为1000-2000rpm，弃上清液，将细胞重悬于新的无血清培养基，按 照1:3-6的传代比例，传代到新培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增P1代培养，扩增过程 每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70%-80%后，如此重复上述的细胞 消化传代过程，完成P2和P3代传代和扩增培养，待P3代细胞融合度达到70% -80%后，用 于建立主细胞库；原代培养所用培养基为无血清培养基或者MesenGro培养基； 六、 主细胞库建立： 将步骤五获得的P3代人脂肪干细胞采用PBS或者生理盐水清洗，采用 1 XTrypLESelect37°C消化3分钟，加入PBS或者生理盐水，并进行吹打，收集分散后的细胞 悬液于50mL离心管中，取部分进行细胞计数、细胞活率测定，其余细胞悬液离心5min，离心 速度为1000-2000rpm，留上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌、梅毒和病毒检测，弃多 余上清液，将细胞按照细胞最终浓度2 X 106个/mL重悬于CryoStor CS10冻存液中，并分 装在40-70根2mL的冻存管中，每管lmL，冻存管贴上防冻条码标签，进行冷冻保存； 七、 工作细胞库建立： 从液氮罐中取主细胞库冻存管2-3支，在37°C水浴中迅速复苏融化后，将细胞转移 至无血清培养基或者MesenGro培养基中，按照0. 5 X 104个/cm2-2X 104个/cm2的接种浓 度接种于培养瓶中进行P4代培养，在37°C、5%的0)2培养箱中，采用无血清培养基或者 MesenGro培养基进行培养，每隔2-3天更换新鲜培养基，待细胞融合度达到70% -80 %后， 采用lXTrypLE Select于37°C消化3分钟，加入等量PBS或者生理盐水稀释收集消化后的 细胞于50mL离心管中，离心5min，离心速度为1000-2000rpm，弃上清液，将细胞重悬于新的 无血清培养基，按照1:3-6的传代比例，传代到新的培养瓶中，采用无血清培养基进行扩增 P5代培养，扩增过程每隔2-3天更换新鲜无血清培养基，待细胞融合度达到70-80 %后，进 行工作细胞库建立工作； 培养的P5代细胞采用PBS或者生理盐水洗去培养基，采用lXTrypLE Select37°C 消化3分钟，加入PBS或者生理盐水，并用移液管进行吹打，收集分散后的细胞悬液于 50mL离心管中，取部分进行细胞计数、细胞活率测定，其余细胞悬液离心5min，离心速度 为1000-2000rpm，留上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体、真菌、梅毒和病毒检测，弃多余上 清液，将细胞按照细胞最终浓度2 X 106个/mL重悬于CryoStor CS10冻存液中，并分装在 60-90支2mL的冻存管中，每管lmL，冻存管贴上防冻条码标签，进行冷冻保存，即完成多级 同种异体脂肪干细胞库的构建。
8. 根据权利要求7所述的多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，其特征在于步骤六 所述病毒检测为乙肝、丙肝、艾滋、EB、CMV和HTLV检测。
9. 根据权利要求7所述的多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，其特征在于步骤六 中冷冻保存的具体方法为：将冻存管首先置于4°C冰箱中，平衡30min，同时准备程序冷冻 仪，将仪器降温至4°C后，将平衡好的细胞冻存管放入，进行程序冻存处理，依次以-0. 7°C / min速度从4°C降温至-11 °C，以_25°C /min从-11 °C降温至_60°C并停留1分钟，以+10°C / min速度从-60°C复温至-25°C，然后再以-0. 7°C /min速度从-25°C降温至-45°C，以-5°C / min速度从-45°C降温至_60°C，以-10°C /min速度从-60°C降温至_95°C，并在此温度平衡 10min的冷冻程序，最后将样本转移入-196°C液氮罐中，在-150?-180°C的液氮气相中长 期保存。
10. 根据权利要求7所述的多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，其特征在于步 骤七中冷冻保存的具体方法为：将冻存管首先置于4°C冰箱中，平衡30min，同时准备程 序冷冻仪，将仪器降温至4°C后，将平衡好的细胞冻存管放入进行程序冻存处理。分别 以-0. 7°C /min速度从4°C降温至-ll°c，以-25°c /min从-ire降温至-60°c并停留1分 钟，以+10°C /min速度从-60°C复温至-25°C，然后再以-0. 7°C /min速度从-25°C降温 至-45°C，以_5°C /min速度从-45°C降温至_60°C，以-10°C /min速度从-60°C降温至_95°C 并在此温度平衡lOmin的冷冻程序，最后将样本转移入-196°C液氮罐中，在-150?-180°C 的液氮气相中长期保存。
【文档编号】C12N5/0775GK104357382SQ201410525337
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】张怡, 王灵娟, 芦慧颖, 王浩宇, 梁丽潮, 付寅生, 赵新新 申请人:黑龙江天晴干细胞有限公司