一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途。本发明的融合蛋白所述融合蛋白从N端到C端依次含有B区缺失的凝血八因子、连接肽和人IgGFc变体。在本发明中，在B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变体之间添加特殊设计的连接肽，可以使Fc区域远离B区缺失的凝血八因子分子的酶活性中心，从而提高融合蛋白的体外生物活性，且人的IgGFc变体在CH2区域的228、235、445位点含有氨基酸突变，从而降低抗体Fc片段的ADCC效应功能。与现有的同类产品比较，具有类似或更高的体外生物活性、更低的vWF蛋白的结合力、更长的半衰期、更长的给药间隔以及更低的用药剂量。
【专利说明】一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法 和用途。
【背景技术】
[0002] 甲型血友病是一种先天性由凝血第八因子缺乏引起的出血性疾病，亦即是由于 X-染色体关联的基因缺陷引起的体内凝血八因子的功能缺失，病人表现为创伤之后凝血功 能障碍和反复自发性出血，逐渐导致软组织和关节腔受损而残废，其发病率为每十万分人 口 15 ?20。
[0003] 甲型血友病最有效的治疗方法是输入正常人血浆、血浆来源的浓缩人凝血第八因 子制剂或基因重组来源的凝血第八因子制剂，以达到治疗出血或者预防出血的目的。静脉 输入基因重组凝血八因子制剂对甲型血友病患者进行预防性治疗的方案需要每周给药3 次，每次给药剂量为每公斤体重25国际单位（25IU/kg)，以维持患者体内凝血八因子水平 在正常人水平的1 %以上。
[0004] 欧美的发达国家都已经实现了用基因重组八因子对甲型血友病患者进行预防性 用药，使这些患者可以免受病痛的困扰，和正常人一样地生活和工作。美国百特（Baxter) 和拜耳（Bayer)两大公司最先推出全长的基因重组八因子。随后美国辉瑞（Pfizer)公司随 后推出B区缺失的八因子，这种产品的蛋白序列去除了八因子序列中无生物学功能的B区， 从而使八因子的分子量降低了 38%，这种修饰不影响八因子的凝血功能，但在哺乳动物细 胞表达水平上有显著提高。无论全长还是B区缺失的八因子都需要每周3次给药才能达到 预防性用药的目的。
[0005] 2014年美国百健艾代公司推出了第一个长效八因子Eloctate，Eloctate是B区 缺失的八因子与抗体Fc片段连接形成的融合蛋白rFVIII-Fc。融合蛋白的半衰期在凝血八 因子基因敲除的小鼠模型中为13. 7小时，较原型八因子制剂的半衰期提高近一倍。在人体 中的半衰期较原型八因子提高了 80 %，给药周期也从2天一次延长至3-5天给药一次，每次 给药剂量为每公斤体重50国际单位（50IU/kg)。第一次实现了甲型血友病预防性治疗的实 质性进步。由于修饰后八因子Fc融合蛋白半衰期没有大幅提升，这种治疗方案把甲型血友 病患者接受治疗的间隔延长了一倍左右，但是病人的总给药剂量没有改变，患者用药的负 担也没有降低。
[0006] 因此，设计功能更强的FVIII-Fc分子，从而在用于预防性治疗甲型血友病中可以 降低给药剂量或者延长给药间隔时间，是本发明要解决的技术问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种凝血八因子融合蛋白及其制 备方法和用途。本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，具有类似或更高的体外生物活 性、更低的vWF蛋白的结合力、更长的半衰期、更长的给药间隔以及更低的用药剂量。
[0008] 本发明的第一方面提供了一种凝血八因子融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端 依次含有B区缺失的凝血八因子、连接肽和人IgGFc变体。
[0009] 优选地，所述融合蛋白中，所述连接肽存在于B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变 体之间。
[0010] 更优选地，所述融合蛋白中，含有两个IgG Fc变体，其中一个IgGFc变体的N端与 所述B区缺失的凝血八因子的C端通过所述连接肽连接，形成含有B区缺失的凝血八因子 的IgG Fc变体，所述含有B区缺失的凝血八因子的IgG Fc变体的C端与另外一个IgG Fc 变体的N端以二硫键连接。
[0011] 优选地，所述融合蛋白中，所述B区缺失的凝血八因子是将原型全长凝血 八因子（NP_000123. I) 743-1635aa的B区序列删除并替换为新的14aa的融合多肽 "SFSQNPPVLKRHQR"所得。亦即，所得B区缺失的凝血八因子的轻链与原型全长八因子的轻 链相同，为原型全长八因子的1648到2332aa ;所得B区缺失的凝血八因子的重链为原型八 因子的重链后面加14aa的融合多肽"SFSQNPPVLKRHQR"。
[0012] 优选地，所述B区缺失的凝血八因子的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 优选地，所述融合蛋白中，所述人IgGFc变体为IgGIFc，IgG2Fc，IgG3Fc或IgG4Fc 变体。
[0014] 更优选地，所述人IgGFc变体为IgG4 Fe变体，所述IgG4 Fe变体是非裂解性的， 且与天然IgG4 Fe相比含有氨基酸突变。
[0015] 优选地，所述IgG4 Fe变体含有IgG4铰链区、CH2和CH3区域。其CH2区域在228、 235和445位（由EU编号体系确定的位置）含有氨基酸突变，从而降低Fe的效应子功能。 更优选地，所述氨基酸突变为S228P、L235E和L445P突变。
[0016] 优选地，所述IgG4 Fe变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0017] 优选地，所述融合蛋白中，所述连接肽含有2?31个氨基酸，且所述的连接肽含有 两个或更多选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。
[0018] 优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3-8所示，具体为：
[0019] GSGGGS (SEQ ID NO. 3)；
[0020] GSGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 4)；
[0021] GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 5)；
[0022] GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 6)；
[0023] GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 7)；
[0024] 或 GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 8)。
[0025] 更优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，
[0026] 具体为：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO. 5)。
[0027] 在本发明中，在B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变体之间添加特殊设计的连接 肽，可以使Fe区域远离B区缺失的凝血八因子分子的酶活性中心，从而提高融合蛋白的体 外生物活性，且人的IgG Fe变体在CH2区域的228、235、445位点含有氨基酸突变，从而降 低抗体Fe片段的ADCC效应功能。
[0028] 优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:9_14所示。
[0029] 优选地，所述融合蛋白在摩尔基础上，具有与B区缺失的凝血八因子类似或更高 的体外生物活性、更长的半衰期、更长的给药间隔和更低的给药剂量。
[0030] 本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码本发明的第一方面所述融合蛋白。
[0031] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0032] 编码所述融合蛋白的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的 技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科 学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法。
[0033] 在本案的较佳实施例中，所述融合蛋白，其核苷酸编码序列如SEQID NO. 15-20所 示。其对应的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 9-14所示。
[0034] 本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸。
[0035] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技 术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以 指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。
[0036] 较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒，如原核载体pIRES-DHFR质粒等。
[0037] 本发明第四方面提供了 一种宿主细胞，其被所述载体所转化。
[0038] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特 细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO, C0S. 293细胞、或Bowes 黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0039] 其中，特别优选CHO细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合性良 好、稳定性良好的融合蛋白。
[0040] 本发明第五方面公开了所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤：
[0041] 1)获得编码融合蛋白的融合基因序列；
[0042] 2)将获得的融合基因序列插入到合适的表达载体中，得到相应的核酸构建体；
[0043] 3)将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；
[0044] 4)在适宜的培养条件下，培养步骤3)的转染细胞，并从中分离纯化所表达的融合 蛋白。
[0045] 优选地，步骤1)中，所述融合基因序列如SEQID NO. 15-20所示。
[0046] 优选地，步骤2)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系 列载体和国内外广泛使用的PBV220载体，pIRES-DHFR质粒。
[0047] 优选地，步骤3)中，所述宿主细胞为CHO细胞，更优选为CH0-DXB11细胞。
[0048] 优选地，步骤4)中，分离纯化的方法具体为：先将细胞培养液离心后使用离子交 换层析，包括阴离子交换层析或阳离子交换层析捕获大量的融合蛋白，然后通过八因子亲 和层析纯化得到纯度超过90%的融合蛋白后，再利用离子交换层析包括阴离子交换层析或 阳离子交换层析精细纯化，最后通过凝胶过滤层析进一步精细纯化得到最终产品。
[0049] 本发明第六方面提供了一种提高前述融合蛋白的表达量的方法，所述方法包括：
[0050] 1)获得编码融合蛋白的融合基因序列；
[0051] 2)将获得的融合基因序列插入到合适的表达载体中，得到相应的核酸构建体；
[0052] 3)将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；
[0053] 4)在适宜的培养条件下，培养步骤3)的转染细胞，并从中分离纯化所表达的融合 蛋白。
[0054] 优选地，步骤1)中，所述融合基因序列如SEQID NO. 15-20所示。
[0055] 优选地，步骤2)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系 列载体和国内外广泛使用的PBV220载体，pIRES-DHFR质粒。
[0056] 优选地，步骤3)中，所述宿主细胞为CHO细胞，更优选为CHO-DXBl 1细胞。
[0057] 优选地，步骤4)中，分离纯化的方法具体为：先将细胞培养液离心后使用离子交 换层析，包括阴离子交换层析或阳离子交换层析捕获大量的融合蛋白，然后通过八因子亲 和层析纯化得到纯度超过90%的融合蛋白后，再利用离子交换层析包括阴离子交换层析或 阳离子交换层析精细纯化，最后通过凝胶过滤层析进一步精细纯化得到最终产品。
[0058] 本发明第七方面，提供了所述的融合蛋白或其编码基因在制备治疗甲型血友病药 物中的用途。
[0059] 本发明第八方面，提供了一种药物组合物，含有有效剂量的可溶性的所述凝血八 因子融合蛋白或其编码基因及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。
[0060] 本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用 于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴 鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种 形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学 领域的常规方法制备。
[0061] 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂 等。
[0062] 如上所述的融合蛋白的药物制剂可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经 静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。上述药物的优选剂量为50IU/kg体重，每4 天给药一次，优选的疗程为40至60天。无论采用何种给药方法，个体人的最佳剂量应根据 具体的治疗而定。
[0063] 本发明的有益效果为：
[0064] (1)本发明的融合蛋白的比活与原型B区缺失八因子蛋白相比都有显著差异 (P〈0. 01)，而含有不同长度连接肽的B区缺失的凝血八因子Fc融合蛋白（包括在实验室表 达与Eloctate相同序列的融合蛋白）之间比活性没有显著差异。
[0065] (2)我们惊奇地发现，本发明应用修饰后的抗体IgG4_Fc片段，并在与B区缺失八 因子序列连接的接头部位插入不同长度的富含甘氨酸（G)和丝氨酸（S)的连接肽序列所得 至IjB区缺失八因子Fc融合蛋白（SEQ ID NO. 9-14)，与已上市的原型B区缺失八因子对比，与 vWF蛋白的结合力进一步降低，半衰期都有显著延长。特别是含有GSGGGSGGGGSGGGGS连接 肽的B区缺失八因子融合蛋白（SEQ ID NO. ll)ka降低最明显，具有最低的与vWF结合的能 力；在其体外和动物体内生物学活性较现有最优的美国百健公司的已推出产品Eloctate 都有明显提升。该融合蛋白是较现有最优的长效凝血八因子产品Eloctate功能更强的 FVIII-Fc分子，如果应用在人体实验可能进一步延长给药间隔，同时有可能降低给药剂量。
【专利附图】
【附图说明】
[0066] 图1 :本发明的分离纯化后的融合蛋白SDS-PAGE变性电泳鉴定结果，其中1号泳 道为亲和层析分离后的八因子融合蛋白，2号泳道为通过精细分离得到的八因子融合蛋白。
【具体实施方式】
[0067] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0068] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0069] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0070] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition, 2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds. ),Academic Press,San Diego, 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0071] 本发明设计思路：在本发明中，B区缺失的凝血八因子可以通过不同柔性连接肽 与不同的IgGFc变体连接，形成融合蛋白。
[0072] 首先，所述B区缺失的凝血八因子，是将原型全长凝血八因子 (NP_000123. l)743-1635aa的B区序列删除并替换为新的14aa的融合多肽 "SFSQNPPVLKRHQR"所得。亦即，所得B区缺失的凝血八因子的轻链与原型全长八因子的轻 链相同，为原型全长八因子的1648到2332aa ;所得B区缺失的凝血八因子的重链为原型八 因子的重链后面加14aa的融合多肽"SFSQNPPVLKRHQR"。所述B区缺失的凝血八因子的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；B区缺失的凝血八因子简写为：BDD-FVIII。
[0073] 其次，柔性连接肽序列的氨基酸数目从2个到31个，主要为甘氨酸（G)和丝氨酸 (S)相互组合。
[0074] 含有6个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGS，命名为"LI"（SEQ ID NO. 3);
[0075] 含有11个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGS，命名为"L2"(SEQ ID NO. 4);
[0076] 含有16个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGS，命名为"L3"（SEQ ID NO. 5)；
[0077] 含有21个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，命名为"L4"(SEQ ID NO. 6)；
[0078] 含有26个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，命名为 "L5"（SEQ ID NO. 7);
[0079] 含有31个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，命名 为 "L6"（SEQ ID NO. 8)。
[0080] 再次，IgG4 Fc变体来源于免疫球蛋白IgG4的恒定区，它在消灭病原体的免疫 防御中起重要作用。Fc融合主要是为了增加它的体内循环半衰期和降低生产成本，而 Fc介导的"抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用"（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)功能是不必要的，甚至可能产生有害副作用。为了得到不具ADCC效 应子功能的非裂解性Fc，最有效方法是在天然Fc片段中的进行氨基酸突变，以减少或去除 ADCC效应子功能。我们优选的人的IgG4的Fc片段对其三个位点进行了修饰，其中第一个 修饰是Fc氨基酸序列按照EU编号系统的S228P，此修饰可以稳固链间二硫键的结构从而 达到稳定二聚体结构的作用；第二个修饰是EU编号系统的L235E，此修饰彻底消除Fc片 段Fe Y R的结合，从而将ADCC降到最低。第三个修饰是EU编号系统的L445P，这个修饰使 IgG4的Fc的C端氨基酸序列与IgGl和IgG2的Fc的C端氨基酸序列相同，从而增加C端 氨基酸序列的均一性。我们这个修饰后的Fc序列命名为"IgG4(S228P，L235E，L445P) (SEQ ID NO. 2)"，其中IgG4后面括号中的氨基酸根据EU编号。
[0081] 本发明所采用的对照融合蛋白分别为：美国辉瑞公司的Xyntha和美国百健艾代 公司的Eloctate，均可通过购买获得。其中，美国百健艾代公司的Eloctate的基因编码序 列如SEQ ID NO. 30,氨基酸序列如SEQ ID NO. 31所示，本领域技术人员根据自己的专业知 识即可构建获得该融合蛋白。
[0082] 含有不同长度连接肽序列的B区缺失的凝血八因子Fc融合蛋白的代码结构如 下：
[0083]
【权利要求】
1. 一种凝血八因子融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次含有B区缺失的凝血八 因子、连接肽和人IgGFc变体。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，含有两个IgG Fc变 体，其中一个IgGFc变体的N端与所述B区缺失的凝血八因子的C端通过所述连接肽连接， 形成含有B区缺失的凝血八因子的IgG Fc变体，所述含有B区缺失的凝血八因子的IgG Fc 变体的C端与另外一个IgG Fc变体的N端以二硫键连接。
3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述B区缺失的凝血八因子的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
4. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgGFc变体为IgG4Fc变体。
5. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述IgG4Fc变体含有IgG4铰链区、 CH2和CH3区域，所述CH2区域含有氨基酸突变，所述氨基酸突变为S228P、L235E和L445P 突变。
6. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述IgG4Fc变体的氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
7. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列选自SEQ IDN0. 3-8 所示。
8. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ IDNO :9-14 所示。
9. 一种多核苷酸，其编码权利要求1-8任一权利要求所述融合蛋白。
10. -种表达载体，其含有权利要求9所述多核苷酸。
11. 一种宿主细胞，其被权要求10所述载体转化。
12. -种如权利要求1-8任一权利要求所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤： 1) 获得编码融合蛋白的融合基因序列； 2) 将获得的融合基因序列插入到合适的表达载体中，得到相应的核酸构建体； 3) 将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞； 4) 在适宜的培养条件下，培养步骤3)的转染细胞，并从中分离纯化所表达的融合蛋 白。
13. 如权利要求1-8任一权利要求所述融合蛋白或其编码基因在制备治疗甲型血友病 药物中的用途。
14. 一种药物组合物，含有有效剂量的如权利要求1-8任一权利要求所述凝血八因子 融合蛋白或其编码基因及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。
【文档编号】C12N15/85GK104292341SQ201410531795
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】许必雄, 郭颀然, 陈汉胜 申请人:上海兴迪金生物技术有限公司