单核苷酸多态性rs77061563在检测麻风病易感基因中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了单核苷酸多态性rs77061563在检测麻风病易感基因中的应用。本发明所保护的一个技术方案是检测人基因组中rs77061563的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。可将检测rs77061563的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的物质)联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。
【专利说明】单核苷酸多态性rs77061563在检测麻风病易感基因中的 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】中单核苷酸多态性rs77061563在检测麻风病易感基因 中的应用。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)指基因组单个核苷酸 的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异 形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量 超过3000万。作为第三代遗传标记SNP数量众多、分布密集，易于检测，因而是理想的基因 分型目标。SNP分型检测在疾病基因组（如疾病易感性），药物基因组（药效、药物代谢差 异和不良反应）和群体进化等研究中具有重大意义。
[0003] 目前已有多种方法可用于SNP检测，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单 链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯 片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于"一步法" 反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合 反应的芯片，及基于荧光分子DM结合反应的芯片（张小燕等。用基因芯片检测单核苷酸 多态性反应原理。中国生物工程杂志。2005, 25(11):52?56)。
[0004] 麻风病是一种由麻风分枝杆菌感染所致的慢性传染病，在发展中国家这仍然是一 个严重的健康问题，每年全球新发病例数为250000。主要侵犯皮肤和外周神经，并导致不可 逆性的神经功能损害和慢性致畸致残。这已被证明在麻风的流行中环境因素和宿主遗传因 素起着至关重要的作用，估计遗传因素高达57 %。
[0005] 世界卫生组织的方案把麻风病的临床表现分为结核型和瘤型，分别对应了 Thl (细胞介导）和Th2 (体液介导）组织的人体的免疫应答。麻风病多样性的临床表现反 映出人体对同种病原体的两种截然不同的免疫应答，这就说明遗传易感性在麻风发病中的 重要性。遗传研究的结果表明遗传与麻风易感性和其临床亚型的病情进展都有关联。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供单核苷酸多态性rs77061563在检测与筛查麻风病中的应 用。
[0007] 本发明首先提供了下述Al)-A7)中的任一用途：
[0008] Al)检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型的物质在制备 筛查麻风病患者产品中的应用。
[0009] A2)检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型的物质在制备 检测麻风病易感性产品中的应用。
[0010] A3)检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型的物质在制备 检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。
[0011] A4)检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型的物质在制备 鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。
[0012] A5)人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型在制备筛查麻风病 患者产品中的应用。
[0013] A6)人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型在制备检测麻风病 易感性产品中的应用。
[0014] A7)含有检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型的物质的 产品，为a)-d)中的任一种产品：
[0015] a)检测与麻风病相关的单核苷酸多态性（即等位基因）或基因型的产品；
[0016] b)鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性（即等位基因）或基因型的产 品；
[0017] c)筛查麻风病患者产品；
[0018] d)检测麻风病易感性产品。
[0019] 上述用途中，所述检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型 的物质可为扩增包括rs77061563在内的基因组DNA片段的PCR引物和单碱基延伸引物。
[0020] 在本发明的实施例中，所述麻风病具体为中国汉族人群及少数民族麻风病。
[0021] rs77061563是人染色体16ql3. 13上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异 是转换（T/C，在其互补链上则为A/G)。所述rs77061563基因型是TT、TC或CC。所述TT 是rs77061563位点为T的纯合型，所述CC是rs77061563位点为C的纯合型，所述TC是 rs77061563位点为T和C的杂合型。所述检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位 基因）或基因型具体可为检测rs77061563的核苷酸种类。
[0022] 上述用途中，所述TT和所述TC基因型的个体在麻风病患者群体中的比例分别低 于对应的基因型在正常人群体中的比例，所述CC基因型的个体在麻风病患者群体中的比 例高于其在正常人群体中的比例。
[0023] 实验证明，在由8313个麻风病患者组成的病例群体和由11655个正常健康者组成 的对照群体及由4362个其他几种免疫相关疾病患者组成的对照群体中，rs77061563的P 值是6. 23X ΚΓ15,且rs77061563的相对危险度是0. 84,说明rs77061563是与麻风病相关 的单核苷酸多态性。rs77061563的风险等位基因为C，该等位基因在麻风病患者群体中的 比例比该等位基因在正常人群体中的比例高6.81%。rs77061563的三个基因型中，TT基 因型的个体和TC基因型的个体在麻风病患者群体中的比例分别低于对应的基因型在正常 人群体中的比例，CC基因型的个体在麻风病患者群体中的比例高于其在正常人群体中的比 例。在实际应用中，可将检测rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型的物质与其它 物质（如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性（即等位基因）或基因型的物质）联 合在一起制备筛查麻风病患者的产品。
[0024] 其中，检测人基因组中rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型的物质可为 通过下述至少一种方法确定rs77061563的多态性（即等位基因）或基因型所需的试剂和/ 或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP 芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等 位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于"一步法"反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、 基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反 应的芯片。
[0025] 所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由引物 和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的组合产品。
[0026] 本发明的一个实施例中，采用PCR引物扩增包括rs77061563在内的基因组DNA片 段，以得到的PCR扩增产物为模板，采用单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，对得到的延 伸产物的序列进行检测，确定rs77061563的多态性和基因型。所述PCR引物在序列上没有 特殊要求，只要能扩增出包括rs77061563在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表中 SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的单链DNA。所述延伸引物根据人基因组中rs77061563 上游（不包括该SNP位点）设计，所述延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中 rs77061563的前1位核苷酸，如所述延伸引物具体可为序列表中的SEQ ID No. 12所示的 单链DNA，当然也可将序列表中SEQ ID No. 12所示的单链DNA按照人基因组中rs77061563 的下游序列延长一个以上核苷酸，或按照人基因组中rs77061563的下游序列缺失一个以 上核苷酸，只要能使该单碱基延伸引物的3'末端延伸出rs77061563位点的核苷酸即可。
[0027] 本发明在一个来自中国人群的样本（8313个麻风病患者和16017个健康者）中发 现rs77061563是与麻风病相关的单核苷酸多态性。可将检测rs77061563的多态性（即等 位基因）或基因型的物质与其它物质（如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性（即 等位基因）或基因型的物质）联合在一起制备筛查麻风病患者的广品。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为未排除以往发现位点处及MHC区域的SNP的P值与在排除了以往发现位点 处及MHC区域的SNP后的SNP的P值。其中，左图为未排除以往发现位点处及MHC区域的 SNP的P值，右图为在排除了以往发现位点处及MHC区域的SNP后的SNP的P值。
[0029] 图2为样本的取样区域。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0031] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例 I、rs2221593、rs73058713、rsl0817758 和 rs77061563 是与麻风病相关的 单核苷酸多态性
[0034] 伦理声明
[0035] 本研究通过了山东省医学科学院、山东省皮肤病与性病防治研究所的伦理委员 会（IRB)批准，所有麻风病患者、其他几种免疫相关疾病（牛皮癣（psoriasis)、白癫风 (vitilogo)、过敏性皮肤炎（atopic dermatitis)和红斑狼疮（SLE))患者及正常健康对照 者均签署了知情同意书。
[0036] 研究对象
[0037] 在发现阶段（第一阶段），进行了两个独立的研究。第一个独立研究的研究对 象为样本1和作为种群对照的4362例中国北方汉族的其他几种免疫相关疾病（牛皮癣 (psoriasis)、白癫风（vitilogo)、过敏性皮肤炎（atopic dermatitis)和红斑狼疮（SLE)) 病例，该样本1包含706例北方汉族麻风病例和1225例北方汉族正常健康对照，他们全部 为中国北方汉族血统。第二个独立研究的研究对象为样本2,该样本2包含2006-2011年间 在中国招募的955例（质控筛选之后样本总量为842例）麻风病例和1040例（质控筛选 之后样本总量为925例）正常健康对照，包括中国北方汉族的436例（质控筛选之后为376 例）麻风病例和533例（质控筛选之后为511例）正常健康对照，中国南方汉族的289例 (质控筛选之后为265例）麻风病例和305例（质控筛选之后为263例）正常健康对照，中 国南方壮族和其他少数民族的230例（质控筛选之后为201例）麻风病例和202例（质控 筛选之后为151例）正常健康对照，见表1与图2。
[0038] 验证阶段应用了两个独立的样本，样本3和样本4。验证阶段1 (第二阶段）的样 本为样本3,该样本3包括北方汉族的2761例麻风病例和3038例正常健康对照，见表1与 图2。验证阶段2 (第三阶段）的样本为样本4,该样本4包括4004例麻风病例和6467例 正常健康对照，包括北方汉族的277例麻风病例和2626例正常健康对照，西南汉族的1494 例麻风病例和1474例正常健康对照，东南汉族的418例麻风病例和306例正常健康对照， 西部汉族的418例麻风病例和395例正常健康对照，以及南方少数民族的1397例麻风病例 和1666例正常健康对照。验证阶段总计6765例麻风病例（样本3中麻风病例数与样本4 中麻风病例数之和）和9505例正常健康对照（样本3中病例数与样本4中正常健康对照 数之和），见表1与图2。
[0039] 其中，中国麻风病患者的诊断标准是符合下述4条中的2条或2条以上，或符合第 3条者确立诊断：1、皮损伴有感觉障碍及闭汗，或有麻木区；2、周围神经受累，表现为神经 干粗大伴相应功能障碍；3、皮损组织切片或组织液涂片查到麻风杆菌；4、病理可见特征性 改变。
[0040] 正常健康对照者的诊断标准：无麻风病史且无麻风的家族史（包括麻风患者的一 级、二级和三级亲属）；无其他传染病病史；无其他自身免疫性疾病病史、系统性疾病病史 及家族史。
[0041]
【权利要求】
1. 检测人基因组中rs77061563的多态性或基因型的物质在制备筛查麻风病患者产品 中的应用。
2. 检测人基因组中rs77061563的多态性或基因型的物质在制备检测麻风病易感性产 品中的应用。
3. 检测人基因组中rs77061563的多态性或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的 单核苷酸多态性的产品中的应用。
4. 检测人基因组中rs77061563的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与麻 风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。
5. 人基因组中rs77061563的多态性或基因型在制备筛查麻风病患者产品中的应用。
6. 人基因组中rs77061563的多态性或基因型在制备检测麻风病易感性产品中的应 用。
7. 含有检测人基因组中rs77061563的多态性或基因型的物质的产品，为a)-d)中的任 一种产品： a) 检测与麻风病相关的单核苷酸多态性或基因型的产品； b) 鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性或基因型的产品； c) 筛查麻风病患者产品； d) 检测麻风病易感性产品。
8. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述检测人基因组中rs77061563的多态 性或基因型的物质为扩增包括rs77061563在内的基因组DNA片段的PCR引物和单碱基延 伸引物。
9. 根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述PCR引物为序列表中SEQ ID No. 7所 示的单链DNA和序列表中SEQ ID No. 8所示的单链DNA。
10. 根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No. 12所示的单链DNA。
【文档编号】C12N15/11GK104293950SQ201410531724
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】张福仁 申请人:山东省皮肤病性病防治研究所