一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤：（1）运用2对特异性引物对待鉴定菌株的基因组DNA进行LAMP扩增，所述的2对特异性引物的序列是：BC-F3；BC-B3；BC-FIP；BC-BIP；（2）利用上述引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，取琼脂糖凝胶电泳分析或用染料法进行观察；（3）进行结果判断，观察电泳结果是否有梯形条带出现或加入染料后产物是否为绿色，如果有梯形条带出现或产物为绿色，说明DNA来源为灰葡萄孢，如果没有梯形条带出现或产物不变色，说明DNA来源不是灰葡萄孢。实现了对灰霉病发病早期的快速检测，准确的预测预报。检测灰霉病，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠，具有广泛的实际应用价值。
【专利说明】一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种灰葡萄孢的早期快速分子的 检测方法，可用于植物灰霉病的早期快速诊断及流行预测。
【背景技术】
[0002] 由灰葡萄孢ciflerea)引起的灰霉病是一种在全世界广泛分布的重要 植物病害。它可以侵染包括茄科、豆科和蔷薇科等数百种植物，在多种蔬菜的生产种植过程 中也常造成严重的危害，可使蔬菜的产量减少20%以上，严重时可达60%以上。随着作物种 植面积的不断增加，塑料大棚的使用也越来越多，而在大棚中灰葡萄孢的生长繁殖速度更 快，这导致灰霉病的发生更加严重，而且灰霉病一旦发生，可迅速产生大量的分生孢子进行 传播扩散，难以有效防治，从而造成更大的经济损失。因此灰霉病是限制多种作物和蔬菜品 质和产量提高的主要因素之一。
[0003] 对于多种植物病害来说，在病害发生的早期进行针对性防治效果较好，因此针对 特定病害发展快速特异的早期分子检测手段至关重要。这种早期检测技术有基于PCR的快 速检测技术，也有基于环介导恒温扩增技术（LAMP)而建立起来的快速特异检测技术，LAMP 技术的引物设计比普通PCR要复杂得多，它是针对目标基因的6个不同区域设计出来4条 特异性引物，其中包括一对外引物及一对内引物，但LAMP技术相对于PCR技术具有灵敏度 高和特异性强的特点；LAMP技术对扩增设备要求简单、反应时间短，通常在60分钟内可完 成整个扩增反应，反应过程中不需要专业的PCR仪，只需要简单的水浴锅即可，易于农户操 作，而且扩增所需费用低；同时LAMP的扩增结果通过添加燃料的方法可直接用肉眼观察， 方便快捷。目前对于大多数的重要植物病害均开发出了一些基于PCR或LAMP的早期分子 检测技术，其中也包括针对灰葡萄孢的早期检测技术。但对于已报道的检测技术来说，基于 PCR技术设计的灰葡萄孢检测方法灵敏度有限，可检测的DNA为微克级，而基于LAMP技术的 灰葡萄孢检测方法灵敏度虽可达纳克级，但并未对葡萄孢属其它种及其近缘属进行特异性 检测区分。而已有报道显示葡萄孢属真菌包括灰葡萄孢、蚕豆葡萄孢、拟蚕豆葡萄孢等多个 种的病原真菌，在田间这些病原菌并不能有效进行区分，从而延误病害的有效防治，因此需 要借助特异性强、灵敏度高且简单易行的检测技术进行早期的检测区分。
[0004] 本发明依据华中农业大学李国庆课题组通过RAro方法扩增获得的灰葡萄孢特异 性片段进行LAMP的引物设计，发明了可用于科学研究及田间实践灰葡萄孢分子检测方法。 利用本发明进行灰葡萄孢的早期检测，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结 果判断简单可靠的特点，具有广泛的实际应用价值，将其应用于灰霉病病的预测预报中，必 将有利于田间灰霉病的综合管理，促进多种作物的增产增收。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是在于提供了一种田间灰霉病发病早期的快速分子的检测方法，实 现了对灰霉病发病早期的快速检测，为灰霉病的田间综合管理提供了科学、准确的预测预 报。检测灰霉病，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠的特 点，具有广泛的实际应用价值。
[0006] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案： 一种灰葡萄孢的早期快速分子的检测方法，其步骤是： 1.依据华中农业大学李国庆课题组通过RAro方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为 革巴标，利用在线软件Primer Explorer 5. 0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引 物（F3，B3)，上游内引物（FIP)，下游内引物（BIP)。本发明使用的引物序列如下 ： BC-F3 :5' -AATGATCGCCTACACAGC-3' BC-B3 :5' -AGCTACCACCGAGAACAA-3， BC-FIP :5' -TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3 BC-BIP :5' -TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3' 利用该引物在恒温（64°C )条件下，进行LAMP扩增，反应体系及程序如下： 表I. LAMP的反应体系（25 μ L)
【权利要求】
1. 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤是： (1)通过RAro方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为靶标，利用在线软件Primer Explorer 5. 0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引物F3, B3,上游内引物FIP， 下游内引物BIP，所述的2对特异性引物的序列分别是： BC-F3 :5' -AATGATCGCCTACACAGC-3' BC-B3 :5' -AGCTACCACCGAGAACAA-3， BC-FIP ：5, -TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3 BC-BIP :5' -TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3'， 利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，LAMP反应体系及条件； (2 )利用步骤（1)的引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，取5 μ L产物于2. 0 %质量体 积比琼脂糖凝胶电泳分析或用染料法进行观察； (3)进行结果判断，观察电泳结果有梯形条带出现或加入染料后产物为绿色，有梯形条 带出现或产物为绿色，DNA来源为灰葡萄孢，没有梯形条带出现或产物不变色，DNA来源不 是灰匍萄抱。
2. 根据权利要求1所述的灰一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其特征在于，所 述的利用引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，LAMP反应体系及条件是： LAMP的反应体系（25 μ L):
反应程序为：64°C 45 min，85°C 5 min。
【文档编号】C12Q1/04GK104293957SQ201410543134
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】程家森, 李斌, 姜道宏, 付艳苹, 谢甲涛, 李国庆 申请人:华中农业大学