一种与猪肌肉pH值性状相关的分子标记及其应用的制作方法

一种与猪肌肉pH值性状相关的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于猪的遗传标记制备【技术领域】，具体涉及一种猪肌肉pH值相关的分子标记制备及在标记辅助选择上的应用。所述的分子标记由GYS1基因启动子序列克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。在序列表SEQIDNO：2所示序列的第267位碱基处有一个C267-T267的碱基突变，导致MvaIPCR-RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为开展高肌肉品质猪的标记辅助选择提供了新的遗传标记。
【专利说明】-种与猪肌肉pH值性状相关的分子标记及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于动物分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种与猪肌肉PH值性状相关 基因 GYSl基因启动子片段的克隆，分子标记的制备及其在标记辅助选择上的应用。

【背景技术】
[0002] 动物体内糖原的含量直接影响到肌肉的一些品质性状，比如屠宰后的肌肉PH值、 系水力、肌肉嫩度等。骨骼肌的蛋白质的分解和糖原合成过程直接关系到肌肉的品质。因 此，对骨骼肌糖原合成和分解代谢过程的研究，一直受到人们的关注。屠宰后肌肉最终的PH 值是衡量猪肌肉品质的重要指标，肌肉的pH值过高则容易形成DFD肉，如果肌肉的pH值过 低则容易形成PSE肉，这两种情况都对猪肉的品质造成了巨大的影响，并且对猪肉的深加 工带来了较大影响。肌肉糖原含量过高导致最终的PH值过低，使蛋白质对水的结合能力降 低，从而对猪肌肉的系水力、剪切力、肉色等肉质性状有影响。PH值只是我们通常测定的一 个品质性状指标，其实影响肌肉PH值的主要因素是屠宰时肌肉的糖原含量。目前肌肉糖原 含量和肌肉pH值相关性的研究较少，Immonen and Puolanne (2000)研究报道猪肉的最终 PH值和糖原含量有较高的相关性。Henckel等（2000)报道当肌肉内糖原含量较低时(小于 53 μ mol/g)糖原含量和屠宰后最终pH值有较高的相关性，而当肌肉内糖原含量比较高的 时侯，这种相关性则很低。
[0003] 糖原合成酶（GS)是糖原合成过程的限速酶，关键调控位点，在动物的肌肉和肝脏 的糖原的合成过程中起着重要的作用（Kaslow and Lesikar, 1984)。在哺乳动物中糖原合 成酶存在两种亚型，一种是肌肉类型糖原合成酶（LGS)，由GYSl基因编码，在组织中普遍表 达（Browner et al.，1989);另外一种肝脏类型糖原合成酶（MGS)，由GYS2基因编码，在组 织中肝脏特异表达（Kaslow et al.，1985; Bai et al.，1990)。肌肉类型糖原合成酶转基 因小鼠研究表明，转基因小鼠的肌肉糖原含量有明显的提高（Manchester et al.，1996)。 而敲除糖原合成酶基因后对小鼠的心肌和骨骼肌的糖原代谢有较大的影响，敲除小鼠比野 生型的小鼠在葡萄糖的清除上效率更高，并且能够维持一个更高的血清胰岛素水平，这些 结果表明糖原合成酶在控制组织的糖原代谢方面具有重要的作用。敲除糖原合成酶基因的 小鼠具有更多比例的慢速氧化型肌纤维（I型)，同时快速酵解型肌纤维（IIa型）的比例下 降（Pederson et al.，2005)。I型肌纤维肌浆中含有更多的线粒体和细胞色素，氧化酶活 力高具有更高的储存甘油三酯的能力；II型肌纤维肌浆中线粒体和细胞色素含量少，氧化 酶活力低、磷酸化酶和ATP酶活力高。
[0004] 目前发现并已经鉴定的影响肌肉品质的候选基因也大多是通过影响猪肌肉的糖 原代谢，从而影响肌肉品质。PRKAG3基因编码腺苷一磷酸激活蛋白激酶γ亚基。PRKAG3 基因在骨骼肌的能量和糖原合成代谢方面其着重要的作用，发现R225Q突变与肌肉内糖原 含量增加有相关（Milan et al.，2000)。RN-基因携带个体的背最长肌肉中糖原含量增加 了 70%，其最终的肌肉pH值比正常要低很多，并且猪肉色泽苍白和滴水损失增加。所以该不 同的基因型也很可能通过调节糖原代谢和葡萄糖的转运过程来影响肌肉内的糖原含量，从 而影响猪肌肉品质性状。左波等分离克隆猪糖原合成酶基因部分片段，并分析了在猪不同 组织中的表达规律，发现在肌肉和心脏中表达量最高（Zuo et al·，2005)。猪GYSl基因 定位于猪六号染色体（Fontanesi et al.，2003)，在这一区域存在大量影响猪肌肉品质性 状的QTL(de Koning et al·，1999; Clop et al·，2003)，所以糖原合成酶基因是影响猪 肌肉品质性状的重要的候选基因。到目前为止仍没有见到研究猪GYSl基因启动子SNP多 态性与猪肉质性状关系的研究的相关报道。所以 申请人:将猪GYSl基因作为影响猪肉质性 状的重要侯选基因，发现GYSl基因启动子区域存在一个突变位点，并且与猪肌肉pH值这一 重要肉质性状具有显著相关，可以进一步利用糖原合成酶基因开展优良肌肉品质猪分子标 记辅助育种。
[0005] 参考文献： Baij G. , Zhang, Z. J. , Werner, R. , Nuttallj F. Q. , Tan, A. W. and Lee, E. Y. The primary structure of rat liver glycogen synthase deduced by cDNA cloning. Absence of phosphorylation sites la and lb. J Biol Cheml^ (1990)，pp. 7843-8. Browner, M. F. , Nakanoj K. , Bang, A. G. and Fletterickj R. J. Human muscle glycogen synthase cDNA sequence: a negatively charged protein with an asymmetric charge distribution. Proc Natl Acad Sci U S (1989)，pp. 1443-7. Clop, A. , Oviloj C. , Perez-Encisoj M. , Cercosj A. , Tomas, A. , Fernandez, A. , Coll, A. , Folchj J. M. , Barraganj C. , Diaz, I.，Oliver, M. A. , Varonaj L， Silioj L，Sanchez, A. and Nogueraj J. L. Detection of QTL affecting fatty acid composition in the pig. Mamm GenomeW (2003)，pp. 650-6. de Koningj D. J. , Janssj LL，Rattinkj A. P. , van Oersj P. A. , de Vries, B. J. , Groenenj M. A. , van der Poelj J. J. , de Grootj P. N. , Brascampj E. W. and van Arendonkj J. A. Detection of quantitative trait loci for backfat thickness and intramuscular fat content in pigs (Sus scrofa). Gene tics 152 (1999)，pp. 1679-90. Henckel P， Karlsson A， Oksbjerg N， et al. Control of postmortem pH decrease in pig muscles:experimental design and testing of animal models. Meat Scij 2000， 55: 131-138. Immonen K， Puolanne E. Variation in residual glycogenglucose concentration at ultimate pH values below 5.75. Meat Scij 2000, S5: 279-283. Kaslowj H. R. and Lesikarj D. D. Isozymes of glycogen synthase. FEBS LettYJl (1984) ，pp. 294-8. Kaslowj H. R. , Lesikarj D. D. , Antwij D. and Tan, A. W. L-type glycogen synthase. Tissue distribution and electrophoretic mobility. J Biol Chem2&Q (1985) ，pp. 9953-6. Manchester, J., Skuratj A. V., Roach, P. , Hauschkaj S. D. and Lawrence, J. C., Jr. Increased glycogen accumulation in transgenic mice overexpressing glycogen synthase in skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A93 (1996), pp. 10707-11. Milan, D. , Jeon, J. T. , Looftj C. , Amargerj V. , Robicj A. , Thelanderj M., Rogel-Gaillardj C. , Paul, S. , Iannuccellij N. , Raskj L，Ronnej Η. , Lundstromj K. , Reinschj Ν. , Gellinj J. , Kalmj Ε. , Royj Ρ· L，Chardonj Ρ. and Anderssonj L A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle. Science288 (2000), pp. 1248-51. Pederson, B. A., Schroederj J. M. , Parker, G. E., Smith, M. W. , DePaoli-Roachj A. A. and Roach, P. J. Glucose metabolism in mice lacking muscle glycogen synthase. DiabetesbA (2005), pp. 3466-3473. Zuoj B. , Xiong, Y. Z. , Deng, C. Y. , Suj Y. H. , Wang, J. , Leij M. G.，Li, F. E., Jiang, S. W. and Zheng, R. Polymorphism, linkage mapping and expression pattern of the porcine skeletal muscle glycogen synthase (GYSl) gene. Anim Genets (2005)，pp. 254-7.


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于克隆与猪肌肉pH值性状相关的基因 GYSl基因的启动子区域， 寻找基因突变位点，并建立相应的多态性检测方法进行猪肌肉PH值性状关联分析，为猪的 标记辅助选择提供一种有用的分子标记。
[0007] 本发明通过以下技术实现： 一种作为分子标记应用的与猪肉质性状相关的GYSl基因启动子区域序列，全长为 785bp，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所述。依据获得的如序列表SEQ ID NO: 1所述DNA序列设计引物，通过扩增和测序获得了 GYSl基因启动子部分核苷酸序列，该 序列长度为296bp，其中第267bp处有一个C267-T267的碱基突变，导致MvaI-PCR-RFLP 多态性。所述引物对为：Promoter-SNP-F :AGGCCTCTTTGCTAAGGCC ;Promoter-SNP-R : CCCCGGGCCAGTGTCATT。
[0008] -种制备所述的与猪肉质性状相关的GYSl基因启动子序列的方法，按照以下步 骤： (1)以猪GYSl基因的cDNA为信息探针，在猪基因组数据库做同源序列筛选，获得一个 包含猪GYSl基因的一个BAC克隆子，以BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品 种梅山猪的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得猪GYSl基因 启动子序列，如序列表SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。
[0009] (2)选择3头大白猪和3头梅山猪为试验材料，从血液中提取猪基因组DNA，设计 引物，PCR扩增、PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO :2所述的猪GYSl基因 启动子部分核苷酸序列。
[0010] 在本发明的实施例中 申请人:已将制备的与猪肌肉pH值性状相关分子标记应用在 猪分子标记辅助育种的关联分析中的应用。
[0011] 本发明的效果是：发现了一个与猪肌肉pH值性状相关的分子标记，为猪的分子标 记辅助选择提供了一个新的分子标记。
[0012] 更详细的技术方案请参见《【具体实施方式】》中的实施例。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的猪肌肉pH值性状相关基因 GYSl基因的启动 子核苷酸序列。
[0014] 序列表SEQID NO :2是本发明克隆的猪肌肉pH值性状相关基因 GYSl基因的启动 子区域部分核苷酸序列。
[0015] 图1 :是本发明中猪GYSl基因启动子序列的MvaI-RFLP三种基因型电泳图谱。图 中：M :DNA 分子量标准（DL2000 ladder)。
[0016] 图2 :是本发明所扩增得到的猪GYSl基因启动子部分核苷酸序列，片段大小为 296bp，图中下划线分别为正、反向引物序列。括号内所显示的是碱基突变。

【具体实施方式】
[0017] 实施例1:(一）猪GYSl基因启动子区域DNA序列扩增 (1)引物设计： 用猪GYSl基因的cDNA (GenBank登录号：GQ845034)为信息探针，利用美国国家生物技 术信息中心（NCBI)的BLAST工具在Genomic Biology猪基因组数据库中做同源序列筛选。 获得一个包含猪GYSl基因的一个BAC克隆子CH242-517N5 (GenBank登录号：FP102974)， 以该BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品种梅山猪的基因组DNA为模板，获得 猪GYSl基因启动子序列。用Primer Premier 5.0软件设计1对引物扩增SEQ ID NO :1， 所述的序列，它们的序列大小分别为785bp。
[0018] 所述1对引物的DNA序列如下： SNP-IF :5, - ATCCTAGCGGAAACGGAA-3' SNP-IR :5' - ACAAAGTGCGGCTTAGAG-3'。
[0019] (2) PCR扩增反应 PCR反应体系为25 μ 1，其中模板为猪DNA为100ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物 浓度为lOmmol/L，2U的Taq DNA聚合酶，加去离子水至总体积25 μ 1。PCR反应程序：94°C 预变性4min ;然后94°C变性40s、59°C退火40s、72°C延伸50s，共35个循环；最后72°C延伸 7min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0020] (3 ) PCR产物的回收、纯化、克隆和测序 PCR产物经纯化(按照上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒 说明书操作）。载体连接体系组成：10><131^€61'，]^1^$1?18-1'￥6(31:〇1'(50叩），]^1^ ;回收 的PCR扩增片段，8μ? ;总体积为1〇μ?并混和均勻，于16°C连接4小时或者4°C过夜连接。 将1〇μ?的连接产物与IOOPL感受态细胞混匀，在冰上放置30min，然后于42°C的循环水浴 中热击90s。迅速将管转移到冰浴中5min。加入40〇μ? LB液体培养基，37°C复苏培养lh。 4000r/min离心6分钟后弃部分上层液，取10〇μ?转移到LB培养基平板上。待液体被吸收 后，倒置平皿，于37°C培养12-16h。挑取单个菌落加入含有氨苄青霉素的LB培养基中培养 6h以上，然后进行PCR扩增，电泳检测，挑取阳性克隆子。鉴定正确的菌液送北京奥科生物 技术有限责任公司进行序列测定。
[0021] (二）PCR-RFLP诊断方法建立 (1)引物序列和PCR扩增条件 选择3头大白猪和3头梅山猪，通过实施例1获得的GYSl基因启动子序列为试验材料， 设计了以下引物，引物序列如下： Promoter-SNP-F ：AGGCCTCTTTGCTAAGGCC ； Promoter-SNP-R :CCCCGGGCCAGTGTCATT。
[0022] 用该引物分别在3头"大白猪"和3头"梅山猪"基因组DNA中进行PCR扩增。PCR 反应体系为25μ 1，其中模板DNA为50ng，dNTPs浓度为10mmol/L，每条引物浓度为IOmmol/ L，IU的7? DNA聚合酶，加去离子水至总体积25 μ 1。PCR反应程序：94°C预变性4min ;然 后94°C变性40s、61°C退火40s、72°C延伸25s，共35个循环；最后72°C延伸7min。PCR产 物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0023] (2) RFLP 检测 PCR产物酶切反应体积是10 μ 1，其中PCR产物6 μ 1，双蒸水2.7 μ 1，IXbuffer Tango 1 μ 1，限制性内切酶MvaI为0. 3μ I (lOU/μ I)，将样品混匀后离心，37°C培养箱放置6h， 用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
[0024] 利用引物 Promoter-SNP-F/Promoter-SNP-R 对启动子区域 1432(T/C)处建立了 MvaI-PCR-RFLP酶切分型方法，如图2所示，当该位点为C时，电泳时只有一条296bp电泳 条带（C等位基因），而当该位点为T时，是限制性内切酶MvaI的切点，所以电泳时有266bp 和30bp两条带（T等位基因）。
[0025] 实施例2 :分子标记在不同猪群中的多态性分布 在三种地方品种(梅山猪48头、通城猪21头和清平猪22头)和三种外来品种(大白32 头、长白35头和杜洛克28头）中进行两处变异的多态性分布检测，结果如表1所示，GYSl 启动子区域MvaI-RFLP多态性分布，在地方品种中T等位基因占主要地位，而在外来品种中 C等位基因占主要地位，中外品种中也存在显著差异(表1)。
[0026] 表1不同猪品种中GYSl基因多态性的基因型和基因频率

【权利要求】
1. 一种作为分子标记应用的与猪肌肉pH值相关的GYS1基因启动子片段，它的核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO :2所述。
2. 根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于：在序列表SEQ ID NO :2所述的第 267bp处有一个C267-T267的碱基突变，导致Mval-PCR-RFLP多态性。
3. 检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物的DNA序列如下所示： Promoter-SNP-F ：AGGCCTCTTTGCTAAGGCC ； Promoter-SNP-R :CCCCGGGCCAGTGTCATT。
4. 制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤： (1) 以猪GYS1基因的cDNA为信息探针，在猪基因组数据库做同源序列筛选，获得一个 包含猪GYS1基因的一个BAC克隆子，以BAC克隆子序列作模板设计引物，以中国地方猪品 种梅山猪的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得猪GYS1基因 启动子序列； (2) 提取猪基因组DNA，以SEQ ID N0:1所述的核苷酸序列为模板设计引物，PCR扩增、 PCR产物纯化和测序，获得猪GYS1基因启动子部分核苷酸序列，获得如序列表SEQ ID NO :2所述的核苷酸序列。
5. 权利要求2所述的遗传标记在猪背最长肌肉PH值、股二头肌肉PH值、半膜肌肉pH 值性状关联分析中的应用。
【文档编号】C12N15/54GK104372006SQ201410570996
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】王林杰, 王薏琳, 王艳, 李利, 张红平, 仲涛 申请人:四川农业大学