一种制备外源环状rna的方法及定量检测内源环状rna的方法

一种制备外源环状rna的方法及定量检测内源环状rna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备外源环状RNA的方法及定量检测内源环状RNA的方法。本发明将人工合成的DNA基因进行克隆，增殖，之后转录DNA基因为线性RNA，将RNA末端修饰后，首尾连接，制备成外源环状RNA分子。将外源环状RNA分子按特定比例加入总RNA中，作为内源环状RNA实时定量检测时的参考基因，首次实现了对内源环状RNA的实时定量检测。
【专利说明】一种制备外源环状RNA的方法及定量检测内源环状RNA的 方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种制备外源环状RNA的方法及定量检测 内源环状RNA的方法。

【背景技术】
[0002] 生物体内大部分的RNA(Ribonucleicacid,核糖核酸）为线性，但有少部分RNA首 尾连接形成环状，称之为环状RNA。近年来，环状RNA迅速成为RNA世界研究的热点,这是因 为环状RNA被发现与重要生物学功能及疾病等密切相关。另外，高通量测序技术被应用于 检测环状RNA，极大地加快了对环状RNA的发现及对环状RNA功能的分析。
[0003] 对于RNA来说，其表达量是一个十分重要的属性。RNA是否表达以及表达量的多 少，都决定着RNA的生物学功能。例如，很多疾病的产生就是因为RNA表达量的异常造成的。 要衡量RNA的表达量，就需要一个在各种状态下表达量相对恒定的RNA作为参考基因。经 过大量的研究发现，线性肌动蛋白（Actin)等基因的表达量相对恒定，常常作为线性RNA表 达的参考基因。
[0004] 在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
[0005] 已知的恒定表达基因均为线性RNA分子，不能作为环状RNA分子的参考基因，使得 不同样品间的环状RNA表达量比较缺乏参考标准，因而缺乏有效的环状RNA检测技术，极大 地限制了环状RNA的研究与应用。


【发明内容】

[0006] 为了解决现有技术中缺乏环状RNA的参考基因的问题，本发明实施例提供了一种 制备外源环状RNA的方法及定量检测内源环状RNA的方法。所述技术方案如下：
[0007] -方面，本发明实施例提供了一种制备外源环状RNA的方法，所述方法包括：
[0008] 选择外源线性RNA基因；
[0009] 将所述外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源线性RNA基 因；
[0010] 将所述克隆的外源线性RNA基因在体外转录，合成外源线性RNA;
[0011] 去除所述外源线性RNA的5'端的三磷酸结构，并在所述外源线性RNA的5'端合 成羟基；
[0012] 对5'端为羟基的所述外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5'端经磷酸化修饰的 所述外源线性RNA;
[0013] 将所述5'端经磷酸化修饰的外源线性RNA的5'端和3'端连接，合成外源环状 RNA；
[0014] 切掉未环化成功的所述外源线性RNA，得到外源环状RNA。
[0015] 具体地，所述外源线性RNA基因对应的DNA序列如序列表SEQIDNO: 1所示。
[0016] 具体地，采用RNA酶R切掉未环化成功的所述外源线性RNA。
[0017] 另一方面，本发明提供了一种定量检测内源环状RNA的方法，所述方法包括：
[0018] 采用上述的方法制备外源环状RNA;
[0019] 对所述外源环状RNA进行质量控制；
[0020] 向待检样本和对照样本的总RNA中加入所述外源环状RNA，所述总RNA与所述外源 环状RNA的质量比为2000:1，得到所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物；
[0021] 利用实时定量PCR方法分别检测所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物中的目 标环状RNA和所述外源环状RNA的含量；
[0022] 以所述外源环状RNA作为参考基因确定所述待检样本中所述目标环状RNA的表达 量。
[0023] 具体地，所述对所述外源环状RNA进行质量控制包括：
[0024] 利用随机引物对合成的所述外源环状RNA进行逆转录，合成外源cDNA;
[0025] 利用第一引物和第二引物分别对所述外源线性cDNA和所述外源环状cDNA进行实 时定量PCR扩增，分别获得CT1值和CT2值，所述第一引物包括如序列表中SEQIDN0:2所 示的第一正向引物和如序列表中SEQIDN0:3所示的第一反向引物，所述第二引物包括如 序列表中SEQIDN0:4所示的第二正向引物和如序列表中SEQIDN0:5所示的第二反向引 物；
[0026] 通过CT1值和CT2值以及公式2[eT2_eTl]x丨〇〇%,计算合成的所述外源环状RNA的 环化比例，并选用环化比例超过90%的所述外源环状RNA。
[0027] 具体地，所述向待检样本的总RNA中加入所述外源环状RNA，所述总RNA与所述外 源环状RNA的质量比为2000:1，得到所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物，包括：
[0028] 提取并纯化所述待检样本与所述对照样本的总RNA;
[0029] 测量纯化后的所述总RNA的质量浓度；
[0030] 根据所述待检样本和所述对照样本的总RNA的质量浓度按照所述总RNA与所述外 源环状RNA的质量比为2000:1的比例与所述外源环状RNA混合，得到所述外源环状RNA与 所述总RNA的混合物。
[0031] 进一步地，利用分光光度计测量所述待检样本与所述对照样本的总RNA的质量浓 度。
[0032] 具体地，所述利用实时定量PCR方法分别检测所述外源环状RNA与所述总RNA的 混合物中的目标环状RNA和所述外源环状RNA的含量，包括：
[0033] 利用所述随机引物对加入了所述外源环状RNA的所述总RNA进行逆转录，得到逆 转录产物，所述逆转录产物包括目标环状cDNA和所述外源环状cDNA;
[0034] 利用第三引物分别对所述待测样本与所述对照样本的所述目标环状cDNA进行定 量PCR检测，扩增后分别获得CT3值和CT4值，利用所述第二引物分别对所述待测样本与所 述对照样本的所述外源环状cDNA进行定量PCR检测，扩增后分别获得CT5值和CT6值；
[0035] 所述第三引物与所述第二引物的扩增产物均跨越了环状RNA的环化结点。
[0036] 进一步地，根据公式eT6_eT5_ eT4]x1〇〇%,计算所述待检样本中所述目标环 状RNA的比例。
[0037] 进一步地，所述实时定量PCR的扩增程序为：95°C20秒；95°C3秒，60°C20秒，共 40个循环。
[0038] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种制备 外源环状RNA的方法，其获得的外源环状RNA可作为内源环状RNA的参考基因，解决了内源 环状RNA由于缺乏参考基因而无法进行实时定量PCR检测的缺陷，有助于环状RNA的研究 与应用。本发明实施例提供的定量检测内源环状RNA的方法，将制备的外源环状RNA加入 待检样本与对照样本的总RNA中，并与待检样本与对照样本的总RNA-同进行扩增与检测。 因而，外源环状RNA实质上已经等同于了稳定表达的内源环状RNA，可以作为不同样本间检 测内源环状RNA表达量的参考基因，解决了没有内源环状RNA参照基因的难题，从而实现了 对内源环状RNA表达量检测的目的。

【专利附图】

【附图说明】
[0039] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0040] 图1是本发明实施例一提供的制备外源环状RNA的方法流程图；
[0041] 图2是本发明实施例二提供的制备外源环状RNA的方法流程图。

【具体实施方式】
[0042] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一 步地详细描述。
[0043] 实施例一
[0044] 本发明实施例提供了一种制备外源环状RNA的方法，如图1所示，该方法包括：
[0045] 步骤101 :选择外源线性RNA基因；
[0046] 步骤102 :将外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源线性RNA 基因；
[0047] 步骤103 :将克隆的外源线性RNA基因在体外逆转录，合成外源线性RNA;
[0048] 步骤104 :去除外源线性RNA的5'端的三磷酸结构，并在外源线性RNA的5'端合 成羟基；
[0049] 步骤105 :对5'端为羟基的外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5'端经磷酸化修 饰的外源线性RNA;
[0050] 步骤106 :将5'端经磷酸化修饰的外源线性RNA的5'端和3'端连接，合成外源 环状RNA;
[0051] 步骤107 :切掉未环化成功的所述外源线性RNA，得到外源环状RNA;
[0052] 步骤108 :纯化外源环状RNA。
[0053] 具体地，本发明实施例提供的待检样本为莱茵衣藻，且该莱茵衣藻的品系为 CC503 (购自于衣藻资源中心，网址为：http://chlamycollection.org/)。
[0054] 步骤101 :选择外源线性RNA基因，该外源线性RNA基因对应的DNA序列如序列表 SEQIDNO: 1所示。上述SEQIDNO: 1及其互补链由生工生物工程（上海）股份有限公司 合成。通过NCBI的BLAST程序检索，没有发现生物中存在外源线性RNA基因的同源性高的 基因。选择的外源线性RNA基因的长度不超过lOOObp。在外源线性RNA基因的5'端和3' 端分别添加了ctcgag和aagctt序列，该ctcgag和aagctt序列分别为限制性内切酶Xhol 和Hindlll的酶切位点，便于将外源线性RNA基因克隆进入原核表达载体，在外源线性RNA 基因的5'端连接的taatacgactcactata序列为17转录酶的启动子序列，其余序列为可转 录的序列，且在taatacgactcactata序列之后连接有ggg序列，ggg序列能够增加17转录 酶的转录效率。
[0055] 步骤102 :将外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源线性RNA 基因，包括：
[0056] 所选用的克隆载体为pBluescriptIISK(+)(该克隆载体从长沙赢润生物技术 有限公司购买，货号为VKS0288)，采用内切酶XhoI(购买自NEB公司，货号为R0146)和内 切酶HindIII(购买自NEB公司，货号为R0104)对pBluescriptllSK(+)载体进行双酶 切。具体地，在20iil的反应体系中，包含有lOiigpBluescriptIISK(+)载体、20U的内 切酶HindIII、20U的内切酶Xhol和2X的NEBuffer2. 1(由NEB公司提供）。将上述反 应体系混合均匀，经短暂离心，于37°C保温1小时后，经80°C20分钟将酶灭活，并获得线 性pBluescriptIISK(+)载体，该线性pBluescriptIISK(+)载体的浓度为 10/20 = 0. 5yg/y1 〇
[0057] 将外源线性RNA基因的DNA序列（如序列表SEQIDNO: 1所示）及其互补链用无 菌水溶解后，分别配制成浓度为〇. 5yg/yl的溶液，按体积比1 :1混合均匀，于PCR仪中依 次经历94°C10分钟；65°C10分钟；37°C10分钟，形成外源双链DNA基因。
[0058] 在20ii1的反应体系中包括线性的pBluescriptIISK(+)载体10ii1、外源双链 DNA基因liil、400U的T4DNA连接酶（购买自NEB公司，货号为M0202)和1XT4DNA连接酶 缓冲液（随T4DNA连接酶一起购买自NEB公司），16°C温育过夜后，65°C10分钟，T4DNA连 接酶经热失活，获得含有外源线性RNA基因的pBluescriptIISK(+)质粒载体。
[0059] 利用热激法将含有外源线性RNA基因的pBluescriptIISK(+)质粒载体转化进 入大肠杆菌，具体方法如下：取50yl感受态细胞（由北京全式金生物技术有限公司生产， 目录号为⑶501)在冰浴中自然解冻，加入含有外源线性RNA基因的pBluescriptIISK(+) 质粒载体，轻轻混匀，在冰浴上孵育30分钟，42°C热激30秒，快速转移至冰浴中冰浴3分 钟，该过程中不要摇动离心管，然后加入300yl不含抗生素的无菌LB液体培养基（LB液 体培养基成份：牛肉膏0. 5g，蛋白胨1. 0g，氯化钠0. 5g，蒸馏水100mL，pH7. 2?7. 5)，于 37°C200转/分钟，复苏1小时，取复苏后的菌液200 均匀涂布于含氨苄青霉素抗性的 LB固体培养基（LB固体培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和琼 脂粉15g/L)上，待菌液完全吸收后倒置于37°C恒温培养箱中，暗培养过夜。挑取LB固体培 养基上长出来的单克隆至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，经37°C200转/分钟，摇 菌扩增繁殖6-8小时，制备成感受态细胞。
[0060] 利用天根生化科技（北京）有限公司生产的快速质粒小提试剂盒（货号为DP105) 从上述感受态细胞中，提取并纯化含有外源线性RNA基因的pBluescriptIISK(+)质粒 载体的DNA，提取与纯化的方法按照随试剂盒提供的说明书进行。利用分光光度计（美国 Quawell公司生产，型号为Q5000)中的双链DNA程序，检测纯化后的pBluescriptIISK(+)质粒的质量浓度。利用外源线性RNA基因的PCR引物从纯化后的pBluescriptIISK(+) 质粒上扩增外源线性RNA基因。具体地，20iU的扩增体系包括：纯化后的pBluescriptII SK(+)质粒50ng、10illQ5高保真扩增混合物（购自于NEB公司，货号为M0492)和10iiM 的外源线性RNA基因的PCR引物（该PCR引物为正向引物与反向引物的等摩尔比混合物）。 扩增程序如下：98°C30秒；98°C8秒，56°C20秒，72°C20秒，共30个循环。将PCR产物利用 乙醇沉淀进行纯化，纯化产物溶解于10U1无酶水中，获得外源线性RNA基因的PCR产物， 利用Q5000(美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中的双裢DNA定量程序对PCR产物进 行定量检测，检测结果表明：本次扩增获得的外源线性RNA基因的PCR产物浓度为560ng/ U1。将外源线性RNA基因的PCR产物送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认克隆的外 源线性RNA基因的正确性，从而获得带有正确克隆的外源线性RNA基因的pBluescriptII SK(+)质粒。
[0061] 其中，外源线性RNA基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQIDN0:9所示，夕卜 源线性1^基因的？〇?引物的反向引物如序列表中5￡0 10勵:10所示。序列表中5￡0 10 N0:9中的多聚T序列是为了在转录时获得多聚A，用于模拟生物RNA的多聚A尾巴，具有多 聚A尾巴的RNA可以被Poly⑴弓丨物逆转录成cDNA。同时，多聚A尾巴也可用于纯化RNA。
[0062] 步骤103 :将克隆的外源线性RNA基因在体外转录，合成外源线性RNA，包括：
[0063] 采用I7RNA快速高效合成试剂盒（购自于NEB公司，货号为E2050)转录合成外源 线性RNA。该试剂盒中的成份包括：无酶水、含有NTP的缓冲液混合物和I7RNA聚合酶混合 物，该反应体系中包括：1Ug上述外源线性RNA基因的PCR产物、lOiil含有NTP的缓冲液 混合物和2 I7RNA聚合酶混合物，加水补足20 混合均匀，并短暂离心，经37°C保温2 小时后，加入30ill无酶水和2illDNase1(购自于NEB公司，货号为M0303)，混合均匀后， 经37°C保温15分钟，去除DNA模板。再利用DynabeadsmRNA纯化试剂盒（由ABI公司生 产，货号为61006)进行纯化，并用50ill无酶水溶解纯化产物，获得纯化的外源线性RNA。
[0064] 步骤104 :去除外源线性RNA的5'端的三磷酸结构，并在外源线性RNA的5'端合 成羟基。因体外合成的外源线性RNA的5'端为三磷酸结构，使得外源线性RNA的5'端无 法与3'端连接形成环状，所以必须去除该5'端的三磷酸结构，再在5'端加上单磷酸结构， 这样外源线性RNA的首尾才能相连成环状，具体步骤包括：
[0065] 采用小牛肠碱性磷酸酶（购自于NEB公司，货号为M0290)去除外源线性RNA的5' 端的三磷酸结构，配制如下反应体系：20yg纯化的外源线性RNA和7U的小牛肠碱性磷酸 酶，用水补足20yl后混合均匀，经短暂离心，于37°C保温1小时，获得去除5'端三磷酸结 构的外源线性RNA。利用DynabeadsmRNA纯化试剂盒（由ABI公司生产，货号为61006)纯 化去除了 5'端三磷酸结构的外源线性RNA，得到5'端为羟基的外源线性RNA。
[0066] 步骤105 :对5'端为羟基的外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5'端磷酸化修饰 的外源线性RNA，包括：
[0067] 利用T4PNK激酶（由NEB公司，货号为M0201)修饰该5'端为羟基的外源线性 RNA。随酶一起提供的有10XT4PNK激酶缓冲液。在50iU的反应体系中，包含如下成份： 1XT4PNK激酶缓冲液、ImMATP、10UT4PNK激酶、以及上述获得的5'端为羟基的外源线性 RNA，用水补足50ill并混合均匀，经短暂离心，于37 °C保温30分钟。利用DynabeadsmRNA 纯化试剂盒（由ABI公司生产，货号为61006)进行纯化，操作方法按该试剂盒的说明书进 行，获得5'端磷酸化修饰的外源线性RNA。
[0068] 步骤106 :将5'端磷酸化修饰的外源线性RNA的5'端和3'端连接，合成外源环 状RNA,包括：
[0069] 利用T4RNA连接酶I(NEB公司生产，货号为M0204)对该5'端磷酸化修饰的外源线 性RNA的5'端与3'端进行连接。随该T4RNA连接酶I一起提供的成份还包括：10XT4RNA 连接酶反应缓冲液、10mMATP和PEG8000。在2〇111的反体系中包含如下成份：1\了41?隱 连接酶反应缓冲液、l〇U/yl的T4RNA连接酶1ill、10U/ill的RNA酶抑制剂0. 5ill、浓度 为10%的PEG8000、20-50iiM的ATP和上述获得的5'端磷酸化修饰的外源线性RNA，用水 补足20iU并混合均匀，经短暂离心，于PCR仪中于16°C过夜，经95°C2分钟终止反应，得 到外源环状RNA。
[0070] 纯化外源环状RNA，具体地，向得到的含有外源环状RNA的混合物中加入以下成 份：5M的醋酸铵（Ambion公司生产，货号为AM9071) 10iil、浓度为100%的乙醇200iil和 水80iil，混合均匀，经短暂离心，置于-80°C冰箱（海尔公司生产，型号为DW-86L626)中放 置30分钟；取出后经14000rpm4°C离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液，向沉 淀中加入300iU浓度为70%的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm4°C离心5分钟后吸去 上层清液，于室温下，空气中干燥10分钟，用于去除残留的乙醇，再用10Ul无酶水溶解沉 淀，获得纯化的外源环状RNA。
[0071] 步骤107 :利用RNA酶R切掉未环化成功的外源线性RNA，得到外源环状RNA，具体 步骤包括：
[0072] 在获得的纯化的外源环状RNA中，还有部分未环化成功的外源线性RNA，利用RNA 酶R(由Epicentre公司生产，货号为RNR07250)切掉未环化成功的外源线性RNA。随该RNA 酶R-起提供的还有10XRNA酶R反应缓冲液，向获得的纯化的外源环状RNA中加入2ill 10XRNA酶R反应缓冲液、1ill20U/ill的RNA酶R和水7ill并混合均勻，经短暂离心后 于40°C保温1小时，获得去除了外源线状RNA的外源环状RNA。
[0073] 步骤108 :纯化去除了外源线状RNA的外源环状RNA，包括：
[0074] 向获得的去除了外源线状RNA的外源环状RNA中加入以下成份：5M的醋酸铵 (Ambion公司生产，货号为AM9071) 10ill、浓度为100%的乙醇200ill和水80ill并混合均 匀，经短暂离心，置于_80°C冰箱（海尔公司生产，型号为DW-86L626)中放置30分钟，取出 后经14000rpm4°C离心25分钟，用移液器的枪头小心吸去上层清液，向沉淀中加入300yl 浓度为70%的乙醇，用于清洗沉淀，再经14000rpm4°C离心5分钟后吸去上层清液，于室温 下，空气中干燥10分钟，用于去除残留的乙醇，用50yl无酶水溶解沉淀，获得纯化的外源 环状RNA。
[0075] 本发明实施例提供的制备外源环状RNA的方法，为了确定内源环状RNA的表达量 人工合成外源环状RNA作为参考基因，按比例加入总RNA中，以模拟体内稳定表达的内源环 状RNA。在本发明实施例提供的人工合成外源环状RNA中，首先，所设计的外源环状RNA与 外源线性RNA在体内应该没有相同序列以及同源性高的序列，因为加入总RNA后，是无法将 外源RNA与内源RNA区分开的，若二者存在重叠，将与"参考基因恒定表达"这一实时定量 基本假设矛盾，直接影响后期定量的准确性。此外，外源基因长度也不能太长，否则影响环 化效率。考虑到合成的RNA量较大，且需要经常使用，本发明实施例将RNA对应的DNA序列 转入质粒中，质粒转入大肠杆菌中，随着大肠杆菌增殖而增殖质粒，同时，增加了相应的DNA 的量，从而灵活获得大量DNA序列。再通过体外转录，将质粒DNA变为RNA。为此，在DNA前 端设计了体外转录启动子序列。转录成的RNA需要纯化，为了实现这一目的，又在DNA的未 端设计了寡聚T，转录后形成寡聚A尾巴，寡聚A可用于纯化RNA。合成的外源RNA是线状， 需要环化后才能成为环状RNA。由于合成时的RNA的5'端为三磷酸基团，而连接时，需要的 是单磷酸基团，为此，去掉了外源RNA的三磷酸基团后，再加上单磷酸基团这一步，从而合 成能够环化成环的前体RNA的状态，最终将该RNA的首尾连接，闭合成环，制备成为外源环 状RNA分子。将制备的外源环状RNA加入待检样本的总RNA中，并与待检样本的总RNA- 同进行扩增，因而，可以作为内源环状RNA的参考基因，用于衡量内源环状RNA的表达量，从 而用于内源环状RNA定量检测。
[0076] 实施例二
[0077] 本发明实施例提供了一种定量检测环状RNA的方法，如图2所示，该方法包括：
[0078] 步骤100 :采用本发明实施例一提供的方法制备外源环状RNA。
[0079] 步骤200 :对外源环状RNA进行质量控制。
[0080] 步骤300 :向待检样本与对照样本的总RNA中加入外源环状RNA，总RNA与外源环 状RNA的质量比为2000:1，得到外源环状RNA与总RNA的混合物。
[0081] 步骤400 :利用实时定量PCR方法分别检测外源环状RNA与总RNA的混合物中的 目标环状RNA和外源环状RNA的含量。
[0082] 步骤500 :以外源环状RNA为参考基因，确定待检样本中的目标环状RNA的相对表 达量。
[0083] 其中，本发明实施例提供的待测样本是在实时定量PCR检测中需要检测表达变化 的样本，对照样本是实时定量PCR检测待测样本中基因表达变化时的参照样本。
[0084] 在前期研究中，利用高通量测序的方式发现在莱茵衣藻中一个表达量较高的环状 RNA，命名为环状cRNA006,CRNA006的线性序列如序列表中SEQIDN0:8所示，将线性的CRNA006的5'端与3'端首尾相连，便形成了环状CRNA006。通过高通量测序等技术分析表 明：与正常生长条件（对照样本：生长温度为25°C)比较，莱茵衣藻在低温生长条件下（待 测样本：生长温度为5°C，且待测样本与对照样本的其他条件均相同），环状CRNA006的表达 量下降了 2倍以上，表明CRNA006是一个低温响应的环状RNA分子，可能具有耐冷的生物学 功能，值得进一步研究，因而，需要进一步确认其表达变化趋势。本实施例利用所制备的外 源环状RNA为参考基因，验证了CRNA006在低温条件下的下调表达趋势。
[0085] 步骤200 :对外源环状RNA进行质量控制，包括：
[0086] 1、利用随机引物对合成的外源环状RNA进行逆转录，合成外源cDNA，具体地，利用 分光光度计（美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中RNA定量程序，测定并获得纯化的 外源环状RNA的质量浓度，本实施例提供的外源环状RNA的质量浓度为355ng/iil。
[0087] 取获得纯化的外源环状RNA0. 5iig，与下列成分混合：5ill浓度为1iiM的6碱 基随机逆转录引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、2ul浓度为10mM的 dNTP、20U的逆转录酶（美国Invitrigen公司生产，货号为18064-014)、5iil浓度为lOOmM 的DL-二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT，随逆转录酶一起由美国Invitrigen公司提 供）和10li1 5X逆转录反应缓冲液（随逆转录酶一起由美国Invitrigen公司提供），用 水补足50yl混匀后，经42°C保温2小时，75°C保温15分钟，使酶失活，合成外源cDNA。
[0088] 2、利用第一引物和第二引物分别对外源线性cDNA和外源环状cDNA进行实时定量 PCR扩增，并分别获得CT1值和CT2值，第一引物包括如序列表中SEQIDN0:2所示的第一 正向引物和如序列表中SEQIDN0:3所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中 SEQIDN0:4所示的第二正向引物和如序列表中SEQIDN0:5所示的第二反向引物；其中， 第一引物的扩增产物不跨越外源环状RNA的环化连接点，使得该第一引物既可扩增外源线 性cDNA，又可扩增外源环状cDNA;第二引物或其扩增产物均跨越外源环状RNA的环化连接 点，使得该第二引物只能扩增外源环状cDNA。实时定量PCR包括两类扩增，一类利用第一 引物扩增，另一类利用第二引物扩增，两类扩增平行进行，除引物不同外，其他所有其它反 应成份与条件均相同。具体扩增过程如下：取2ill上述外源cDNA、3ill浓度为1iiM的第 一引物、10111定量？〇?混合物（由！'〇7〇13〇公司生产，货号为0?5-201)和0.411150倍的 R0X荧光校正染料（由Toyobo公司随QPS-201 -起提供）混合均匀后，经短暂离心，在ABI StepOne实时定量PCR仪中按如下扩增程序进行实时定量PCR扩增：95°C20秒；95°C3秒， 60°C20秒，后二步（95°C3秒，60°C20秒）共40个循环，在每一次循环的最后一步收集荧 光信号，该荧光信号的强弱用于衡量表达量的多少。
[0089] 3、通过CT1值和CT2值以及公式

【权利要求】
1. 一种制备外源环状RNA的方法，其特征在于，所述方法包括： 选择外源线性RNA基因； 将所述外源线性RNA基因克隆到原核表达载体中，获得克隆的外源线性RNA基因； 将所述克隆的外源线性RNA基因在体外转录，合成外源线性RNA ; 去除所述外源线性RNA的5'端的三磷酸结构，并在所述外源线性RNA的5'端合成羟 基； 对5'端为羟基的所述外源线性RNA进行磷酸化修饰，合成5'端经磷酸化修饰的所述 外源线性RNA ; 将所述5'端经磷酸化修饰的外源线性RNA的5'端和3'端连接，合成外源环状RNA ; 切掉未环化成功的所述外源线性RNA，得到外源环状RNA。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源线性RNA基因对应的DNA序列如 序列表SEQ ID NO: 1所示。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R切掉未环化成功的所述外源 线性RNA。
4. 一种定量检测内源环状RNA的方法，其特征在于，所述方法包括： 采用如权利要求1-3任一项所述的方法制备外源环状RNA ; 对所述外源环状RNA进行质量控制； 向待检样本和对照样本的总RNA中加入所述外源环状RNA，所述总RNA与所述外源环状 RNA的质量比为2000:1，得到所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物； 利用实时定量PCR方法分别检测所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物中的目标环 状RNA和所述外源环状RNA的含量； 以所述外源环状RNA为参考基因，确定所述待检样本中所述目标环状RNA的表达量。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对所述外源环状RNA进行质量控制包 括： 利用随机引物对合成的所述外源环状RNA进行逆转录，合成外源cDNA ; 利用第一引物和第二引物分别对所述外源线性cDNA和所述外源环状cDNA进行实时定 量PCR扩增，分别获得CTl值和CT2值，所述第一引物包括如序列表中SEQ ID NO: 2所示的 第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列 表中SEQ ID N0:4所示的第二正向引物和如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二反向引物； 通过CtI值和CT2值以及公式( H] X丨〇〇%,计算合成的所述外源环状RNA的环化 比例，并选用环化比例超过90%的所述外源环状RNA。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，向所述待检样本和所述对照样本的所述 总RNA中加入所述外源环状RNA，所述总RNA与所述外源环状RNA的质量比为2000:1，得到 所述外源环状RNA与所述总RNA的混合物，包括： 提取并纯化所述待检样本与所述对照样本的总RNA ; 测量纯化后的所述总RNA的质量浓度； 根据所述待检样本和所述对照样本的总RNA的质量浓度按照所述总RNA与所述外源环 状RNA的质量比为2000:1的比例与所述外源环状RNA混合，得到所述外源环状RNA与所述 总RNA的混合物。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用分光光度计测量所述待检样本与所 述对照样本的总RNA的质量浓度。
8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述利用实时定量PCR方法分别检测所 述外源环状RNA与所述总RNA的混合物中的目标环状RNA和所述外源环状RNA的含量，包 括： 利用所述随机引物对加入了所述外源环状RNA的所述总RNA进行逆转录，得到逆转录 产物，所述逆转录产物包括目标环状cDNA和所述外源环状cDNA ; 利用第三引物分别对所述待测样本与所述对照样本的所述目标环状cDNA进行定量 PCR检测，扩增后分别获得CT3值和CT4值，利用所述第二引物分别对所述待测样本与所述 对照样本的所述外源环状cDNA进行定量PCR检测，扩增后分别获得CT5值和CT6值； 所述第三引物与所述第二引物的扩增产物均跨越了环状RNA的环化结点。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据公式2[eT3+〇r6_eT5_eT4]x 1〇〇%，计算 所述待检样本中的所述目标环状RNA的相对表达量。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时定量PCR的扩增程序为： 95°C 20 秒；95°C 3 秒，60°C 20 秒，共 40 个循环。
【文档编号】C12N15/10GK104328112SQ201410604749
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】彭海, 李利利, 陈利红, 高利芬, 张继, 方治伟, 章伟雄, 卢龙, 李甜甜, 周俊飞 申请人:江汉大学