一种禹白附中总黄酮的提取工艺方法
【专利摘要】本发明公开了一种禹白附中总黄酮的提取工艺方法，包括称量、浸提、离心处理、定容和计算，采用此提取方法，禹白附中总黄酮的提取率可以达到4.7％。超声波辅助提取法要求设备简单，操作方便，重现性好，提取量高，提取溶剂对操作人损害小，且超声波对黄酮物质的活性无影响，是黄酮类等化合物提取优先选用的方法，采用此提取方法，禹白附中总黄酮的提取率可以达到4.7％，对于提取的粗黄酮提取液进行旋转蒸发浓缩、低温冷冻干燥进行生物活性研究，结果表明提取的粗黄酮具有一定的还原能力及对·OH、O-2·、ABTS+自由基的清除能力，以及对一些细菌具有一定的抑菌活性。
【专利说明】一种禹白附中总黄酮的提取工艺方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能性食品【技术领域】，具体涉及一种禹白附中总黄酮的提取工艺方 法。
【背景技术】
[0002] 河南省是一个中药资源大省，中药材的种植已有2000多年的历史，品种数量和储 存量均居全国前列。其中以四大怀山药、山茱萸、金银花、柴胡、连翘、山碴等种植量最多。 其中，河南省平顶山市禹州也是中药材种植基地，中药材种植量达40种左右，禹白附也是 其中一种。禹白附和关白附通称白附子，但两者功效不同，目前关白附研究的较多。禹白附 为独角莲的干燥块茎，以河南禹州产的禹白附最为地道，因其生品有毒，临床用其炮制品入 药。禹白附是临床常用中药，主要用于治疗头痛、破伤风、毒蛇咬伤等疾病。药理研究表明禹 白附具有抗肿瘤、镇静止痛、抗菌消炎、美白等多种功效，目前对其抗肿瘤作用研究较多；化 学成分主要有机酸及其酯类、挥发油类、氨基酸、脑苷酯、皂苷类、多糖以及一些微量元素。 关于禹白附总黄酮物质的提取工艺、分离纯化及结构鉴定国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种禹白附中总黄酮的提取工艺方法，克服了现有技术中没 有相关提取工艺的不足。
[0004] 本发明所采用的技术方案是，一种禹白附中总黄酮的提取工艺方法，具体按照以 下步骤实施：
[0005] 步骤1、禹白附样品的前处理和称量：将禹白附烘干至恒重、粉碎得到禹白附样 品；称取上述禹白附样品和乙醇溶液；
[0006] 步骤2、浸提：用乙醇溶液浸泡禹白附样品，超声提取并静置；
[0007] 步骤3、离心处理：离心分离残渣，留上清液；残渣用步骤2中的条件进行浸提处理 后再进行离心处理，留上清液；重复1-3次，其中步骤2和步骤3中用到的乙醇溶液的总量 为步骤1中称量的乙醇溶液总量；合并上清液，得到总黄酮提取物。
[0008] 本发明的特点还在于，
[0009] 禹白附的前处理条件：烘干条件为55°C-65°c，粉碎过60目筛。
[0010] 禹白附样品和乙醇溶液的质量体积比（g/mL)为1:15-1:35。
[0011] 步骤1中乙醇溶液的质量分数为20% -70%。
[0012] 浸提条件为：浸泡时间为15min-25min;超声时间为：20min-100min，超声温度为： 35°C-75°C，超声波功率为200W;静置时间为：3min-7min。
[0013] 离心处理的转速为：2500r/min-3500r/min;离心处理时间为：8min-12min;所述 浸提和离心处理的次数为1-3次。
[0014] 本发明的有益效果是：超声波辅助提取法要求设备简单，操作方便，重现性好，提 取量高，提取溶剂对操作人损害小，且超声波对黄酮物质的活性无影响，是黄酮类等化合物 提取优先选用的方法，采用此提取方法，禹白附中总黄酮的提取率可以达到4. 7%，提取的 粗黄酮具有一定的还原能力及对?0H、0_2 ?、ABTS+自由基的清除能力，以及对一些细菌具 有一定的抑菌活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是本发明乙醇浓度对总黄酮得率的影响曲线图；
[0016] 图2是本发明超声提取时间对总黄酮得率的影响曲线图；
[0017] 图3是本发明超声提取温度对总黄酮得率的影响曲线图；
[0018] 图4是本发明料液比对总黄酮得率的影响曲线图；
[0019]图5是本发明提取次数对总黄酮得率的影响曲线图；
[0020] 图6是本发明总黄酮的定性结果图；
[0021] 图7是本发明黄酮粗提物的还原能力测定曲线图；
[0022] 图8是本发明黄酮粗提物对?OH自由基清除率的测定图；
[0023] 图9是本发明黄酮粗提物对CT2?的清除率测定图；
[0024] 图10是本发明黄酮粗提物对ABTS+清除率的测定图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0026] 本发明提供一种禹白附中总黄酮的提取工艺方法，具体按照以下步骤实施：
[0027] 步骤1、禹白附样品的前处理和称量：将禹白附于55°C-65°C的条件下，烘干至恒 重，粉碎，过60目筛，得到禹白附样品；按照质量体积比（g/mL)为1:15-1:35称取禹白附样 品和质量分数为20% -70 %的乙醇溶液；
[0028] 步骤2、浸提：用质量分数为20%-70%的乙醇溶液浸泡禹白附样品151^11-251^11， 在超声波功率为200W，35°C-75°C条件下超声提取20min-100min，静止3min-7min;
[0029] 步骤3、离心处理：用低速离心机在转速为2500r/min-3500r/min下离心 8min-12min分离残渣，留上清液；残渣用步骤2中的条件进行浸提处理后再进行离心处理， 重复1-3次，其中步骤2和步骤3中用到的质量分数为20% -70%的乙醇溶液的总量为步 骤1中称量的质量分数为20% -70%的乙醇溶液总量；合并上清液，得到总黄酮提取物。
[0030] 步骤4、按照体积比为1:1分别称取上清液和质量分数为5 %的NaNO2溶液，摇匀 静置3min-8min，再加入与上清液等体积的质量分数为10 %的Al(NO3) 3溶液，摇匀，放置 3min-8min，加入10倍量的上清液的质量分数为5%的NaOH溶液，再用体积分数30%乙醇 定容至25mL，混勻静置8min_12min;
[0031] 步骤5、计算：以质量分数为20% -70%的乙醇溶液为对照组，于510nm波长处测 定吸光值。根据标准曲线回归方程，由吸光度求出提取液中的芦丁含量，按下列公式计算出 待测样中总黄酮的含量；
[0032] 总黄酮的提取量Hi1(mg)=CXV1XV2
[0033] 总黄酮的得率％ =Hi1Ai2X100
[0034] 式中：C为测得吸光值，带入回归方程计算出的总黄酮浓度（mg/mL)J1为总黄酮 提取液体积（mL)，V2为测量总黄酮含量时的定容体积（mL)。Hi1为粗提取物中黄酮的重量 (mg)，m2为禹白附样品重量（mg)。
[0035]在上述提取方法中，本方法的关键试剂是：芦丁标准品、无水乙醇、NaN02、 Al(N03) 3。采用这几种试剂是因为芦丁是属于黄酮类物质的一种，常用于测定黄酮含量的 标准品，而测定方法通常采用NaNO2-Al(N03)3比色法测定总黄酮含量。对于黄酮的提取通 常采用微波提取法、膜分离法、双水相提取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法、有机 溶剂提取法、热水提取法等，这些方法各有优缺点，但超声波辅助提取法要求设备简单，操 作方便，重现性好，提取量高。利用超声波所具有的空化作用破坏植物的细胞膜，从而有助 于黄酮类物质快速溶解于溶剂中。同时，超声波促使提取溶剂不断震荡有助于溶质扩散，超 声波的热效应对原料还具有水浴作用。另外，还利用其次效应，如机械振动、扩散、击碎等， 使其加速被提取成分的扩散、释放。
[0036] 有机溶剂常用甲醇、乙醇、丙酮等溶剂，但是甲醇和丙酮毒性大，而乙醇提取溶剂 对操作人损害小，因而采用无水乙醇作为溶剂，且超声波对黄酮物质的活性无影响，是黄酮 类等化合物提取优先选用的方法，采用此提取方法。本方法关键的参数是质量体积比为1 : 20g/mL、提取次数3次，提取时间40-80min、乙醇浓度50-70%、提取温度为55-75°C，在此工 艺条件下，总黄酮的提取率为4. 0% -4. 7%。
[0037] 结合图1，随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率在不断浮动。在乙醇浓度60%时，总 黄酮得率达到最大值。如图2所示，随着超声提取时间的增加，总黄酮得率先上升后下降。 在超声提取时间为60min时，总黄酮得率达到最大值。如图3所示，随着提取温度的增加， 总黄酮得率在不断浮动。在提取温度达到75°C时，总黄酮得率达到最大值。温度的升高使 黄酮在乙醇中的溶解度逐渐增加，从而其提取率逐渐升高。但是温度过高也影响溶剂挥发， 造成溶剂的损失以及影响黄酮类物质的生物活性。因此，综合考虑选择提取温度为75°C为 最佳提取温度。如图4所示，随着乙醇提取液体积的增加，总黄酮得率先上升后下降。在乙 醇提取液体积为20mL时，总黄酮得率达到最大值。可能原因在于一定的料液比范围内，禹 白附中黄酮类物质的溶出速度随着料液比的增大而增加，当料液比达到1 : 20时，黄酮类 物质的溶出速度达到最大。如图5所示，随着提取次数的增加，总黄酮得率在不断上升，提 取三次时总黄酮得率达到最大值。
[0038] 实施例1
[0039] 将禹白附于60°C的条件下，烘干至恒重，粉碎，过60目筛，得到禹白附样品；准确 称取I.OOg禹白附样品，以50%乙醇溶液为提取液，按Ig:20mL的料液比，用乙醇溶液浸 泡20min后用超声波辅助法在超声波功率为200W、75°C提取80min，静止5min后在转速为 3000r/min下，用低速离心机离心IOmin分离残渣，留上清液，重复3次，上述乙醇溶液的总 量为称量的乙醇溶液总量；合并上清液，得到总黄酮提取物；取ImL总黄酮提取物于试管 中，加入LOmL质量分数5%的NaNO2溶液，摇匀静置5min后，再加入LOmL质量分数10% Al(NO3) 3溶液，摇匀，放置5min后加入IOmL质量分数5 %NaOH溶液，再用体积分数30 %乙 醇定容，混匀静置lOmin，以试剂空白为对照组，于510nm波长处测定吸光值。根据标准曲线 回归方程，由吸光度求出提取液中的芦丁含量，按下列公式计算出待测样中总黄酮的含量。
[0040] 总黄酮的提取量In1 (mg) =CXV1XV2
[0041] 总黄酮的得率％ =In1Zm2X100
[0042] 式中：C为测得吸光值，带入回归方程计算出的总黄酮浓度（mg/mL)。V1为总黄酮 提取液体积（mL)，V2为测量总黄酮含量时的定容体积（mL)。Hi1为粗提取物中黄酮的重量 (mg)，m2为禹白附样品重量（mg)。根据此工艺条件该禹白附中总黄酮的提取率为4. 7%。
[0043] 根据上述实验做定性实验，分别向提取液中加入0. 1 %三氯化铁溶液、1 %三氯化 铝溶液、20%氢氧化钠溶液；黄酮类化合物在其基本碳架上含有碱性氧原子，而绝大多数 都是带有酚性羟基的衍生物，因而能与某些金属离子产生络合反应，以及与某些较强的还 原剂发生颜色反应。如图6所示，1号试管是对照；2号试管是超声提取液中加入20%的氢 氧化钠，试样变成棕黄色；3号试管是超声提取液中加入三氯化铁，溶液变成了浅绿色，可 能由于黄酮量比较少的缘故，溶液颜色没有变成墨绿色；4号试管是超声提取液中加入1% 的三氯化铝溶液，会发现有少许黄色络合物生成。由定性试验可知，超声提取物中含有黄酮 类物质。
[0044] 对于上述黄酮提取液通过旋转蒸发仪进行浓缩，低温冷冻干燥机干燥，得到禹白 附黄酮粗提物，对于此粗提物进行抑菌和抗氧化活性研究如下：
[0045] (1).禹白附中黄酮粗提物的抑菌活性测定
[0046] 称取禹白附中黄酮粗提物500mg，用10%乙醇配成溶液，并用滤膜过滤除菌。分别 取制备好的4种供试菌（金黄色葡萄球菌ATCC25923,绿脓杆菌CCTCC2620,嗜水气单胞菌， 大肠杆菌ATCC25922)悬液（IO6个/mL) 100iiL均匀涂布琼脂平板，然后在平板上打孔，孔 穴直径为6mm，每孔穴依次加入300?50mg/mL不同浓度的黄酮粗提取液50iiL，同时以抗 生素（盐酸左氧氟沙星）和10%乙醇作对照，分别在37°C温度下培养24h后，测量孔穴周 围抑菌圈直径，用以表示抗菌活性（抗菌活性=抑菌圈直径一 6mm)。结果如表1所示。
[0047] 表1.榴莲果皮总黄酮提取物对微生物的抑菌圈直径（cm)
[0048]
【权利要求】
1. 一种禹白附中总黄酮的提取工艺方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施： 步骤1、禹白附样品的前处理和称量：将禹白附烘干至恒重、粉碎得到禹白附样品；称 取上述禹白附样品和乙醇溶液； 步骤2、浸提：用乙醇溶液浸泡禹白附样品，超声提取并静置； 步骤3、离心处理：离心分离残渣，留上清液；残渣用步骤2中的条件进行浸提处理后再 进行离心处理，留上清液；重复1-3次，其中步骤2和步骤3中用到的乙醇溶液的总量为步 骤1中称量的乙醇溶液总量；合并上清液，得到总黄酮提取物。
2. 根据权利要求1所述的禹白附中总黄酮的提取工艺方法，其特征在于，所述禹白附 的前处理条件：烘干条件为55°C -65°C，粉碎过60目筛。
3. 根据权利要求1所述的禹白附中总黄酮的提取工艺方法，其特征在于，所述步骤1中 禹白附样品和乙醇溶液的质量体积比（g/mL)为1:15-1:35。
4. 根据权利要求1所述的禹白附中总黄酮的提取工艺方法，其特征在于，所述步骤1中 乙醇溶液的质量分数为20% -70%。
5. 根据权利要求1所述的禹白附中总黄酮的提取工艺方法，其特征在于，所述浸提条 件为：浸泡时间为15min-25min ;超声时间为：20min-100min，超声温度为：35°C -75°C，超 声波功率为200W ;静置时间为：3min-7min。
6. 根据权利要求1所述的禹白附中总黄酮的提取工艺方法，其特征在于，所述离心处 理的转速为：2500r/min-3500r/min ;离心处理时间为：8min-12min ;所述浸提和离心处理 的次数为1-3次。
【文档编号】A23L1/30GK104351804SQ201410647047
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】洪军, 胡建业, 王福梅, 柳静, 杜海霞, 赵安芳, 王佩 申请人:河南城建学院