反转录pcr检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法

反转录pcr检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法，反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒包括引物、探针和FRET-PCR标准品，其特征在于：所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和Cy5探针；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述6-FAM探针具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述Cy5探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。本发明操作便捷，适合于检测大量样本,可以快速,高度灵敏、特异、快速检测的并分型所有登革病毒的血清型。
【专利说明】反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物科学【技术领域】，具体涉及反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂 盒及其检测方法。

【背景技术】
[0002] 登革热（Dengue fever, DF)是由登革病毒（Dengue virus, DENV)弓丨起的急性传 染病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。登革热作为一种急性传染病，其在流行地区的预 防，尤其是爆发流行地区的诊断和控制尤其重要。临床主要表现为高热、头痛、肌肉和关节 痛、皮疹、淋巴结肿大及白细胞减少等，严重者可出现出血或休克，甚至死亡。世界卫生组织 把登革热分为典型登革热、登革出血热（Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合 征（Dengue shock syndrome, DSS)三型，后两型病情严重，病死率高。该病主要流行于热带 和亚热带地区，目前全球已有100多个国家和地区有此病病例的报道，有约25-30亿人处于 登革病毒感染的危险中。在我国，自从1873年首次报道以来每年都有登革热感染人的病例 报道，该病在我国一直间断流行，病例分布的范围也在不断扩大。
[0003] 登革病毒属于黄病毒科（Flaviviridae)、黄病毒属（Flavivirus)病毒，其基因组 为单股正链RNA，根据其表面E抗原的不同可把登革病毒分为4个血清型（DENV1、DENV2、 DENV3和DENV4)，各血清型之间存在一定的交叉反应。登革病毒1-4型在我国出现反复的 交替流行，但以登革病毒1型为主，近年来出现了在某一地区连续数年主要流行一种血清 型别，例如广东：登革病毒1型的现象。
[0004] 目前，登革病毒的检测和诊断主要通过病毒分离培养、血清学方法以酶联免疫吸 附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)为主及分子生物学方法，以反转录 PCR为主）。病毒分离培养具有灵敏度高、特异性强等优点，但同时对培养环境、人员、培养 条件和仪器设备要求较高；血清学检测是目前应用最广泛的方法，但抗体一般会在机体感 染病毒5天后产生以及不同血清型的登革病毒之间的交叉反应，使得本方法对登革热集中 爆发时的检测和确诊比较困难；分子生物学检测，尤其是PCR，反转录PCR方法的建立和应 用，为登革热疾病的预防以及爆发时的确诊和诊断提供了准确、可靠的依据。
[0005] 目前登革病毒感染的检测方法主要有：（1)病毒分离培养。用于登革病毒分离和 培养的动物模型或细胞系包括乳鼠、蚊子和蚊子细胞系，本方法具有灵敏度高和特异性强 等优点，但同时耗时、耗力且对实验条件和人员要求较高；
[0006] 病毒分离培养。登革病毒是一种虫媒病毒，在体外培养比较困难，且不同血清型的 登革病毒最适的细胞系或动物是不同的。
[0007] 目前，登革病毒的体外接种培养的细胞或动物主要有：(a)乳鼠 Suckling mice。 登革病毒4个血清型DENV1-4都曾在乳鼠体内分离或接种成功。由于乳鼠母源抗体的干 扰，使其对接种病原体表现出较低易感性，而且操作极其繁琐，所以目前登革病毒的分离和 培养并不推荐此方法。
[0008] (b)蚊子细胞培养Mosquito cell cultures。目前为止，多种品种的蚊子细胞系 被建立。由于蚊子属于昆虫，其细胞系培养所需温度较低，且登革病毒对低温不敏感，所以 蚊子细胞系更有利于登革病毒的培养，其中C6/36Ae. albopictus细胞系对登革病毒表现 出较高的敏感性，应用较为广泛。
[0009] (c)蚊子接种Mosquito inoculation。此方法作为一种诊断和病毒扩增的方式， 为登革病毒的分离和培养提供一种较为敏感的方法。虽然细胞系和动物接种培养具有较高 的灵敏度，但由于其耗时、耗力，同时需要较高的实验条件和仪器设备等，在临床检测和诊 断中并不常用。
[0010] (2)血清学检测。登革病毒包括黄病毒属Flavivirus的其他病毒首次感染机体 后首先会产生IgM抗体，一段时间后当IgM抗体水平降低后IgG抗体随之增高；当登革病毒 [包括黄病毒属（Flavivirius)的其他病毒]第二次感染机体后，IgG和IgM抗体同时产 生，且IgG抗体占优势。所以，目前有两种分别针对IgG和IgM的商业化ELISA试剂盒。
[0011] ELISA 检测 IgMIgM antibody capture ELISA, MAC-ELISA。MAC-ELISA 方法是目前 在诊断实验室和商业化诊断试剂盒中应用最广泛的方法，可以检测登革病毒1-4型。但本 方法与黄病毒属中的其他病毒存在交叉反应，使得检测结果的可信度降低，尤其是在登革 病毒和其他黄病毒属病毒同时流行的地区。2)ELISA检测IgG。依据此原理的ELISA试剂 盒主要用于登革病毒或其他黄病毒属病毒二次感染的检测，但由于此检测方法的种属特异 性较差，不能区分感染的病毒种属，因此实用性不强。值得说明的是，机体内的抗体一般需 要在机体感染登革病毒至少5天后才能达到检测水平，同时ELISA检测方法在不同血清型 的登革病毒之间存在交叉反应，所以在登革热流行或爆发的时期，血清学方法不能及时的 检出感染病例并确定登革病毒的血清型，这十分不利于登革热这种急性传染病的诊断、监 测和控制。
[0012] (3)分子生物学方法。近年来，以反转录PCR，尤其是实时反转录PCR为主的分子 生物学方法的发展为登革热的控制和预防提供了更快速、更可靠的方法学和理论学依据。 本发明建立的RT-PCR体系可以检测到包括血液在内的各种样品中登革病毒的核酸并且确 定感染的登革病毒的血清型，尤其是病毒感染机体后而抗体产生前的5天，这就为登革热 流行和爆发时的及时诊断、控制和预防提供了坚实的基础。
[0013] 目前，缺乏一种高度灵敏、特异、快速检测的反转录PCR检测和分型登革病毒的试 剂盒及其检测方法。


【发明内容】

[0014] 本发明的目的是提供一种高度灵敏、特异、快速检测的反转录PCR检测和分型登 革病毒的试剂盒及其检测方法。
[0015] 本发明的技术方案如下：本发明提供了一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试 剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为 6-FAM探针和Cy5探针；
[0016] 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列；
[0017] 所述6-FAM探针具有SEQ ID No. 2的核苷酸序列；
[0018] 所述Cy5探针具有SEQ ID No. 3的核苷酸序列；
[0019] 所述下游引物具有SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
[0020] 进一步地，所述试剂盒包括：引物、6-FAM探针、Cy5探针、PCR缓冲液、热启动Taq 酶、dNTP、FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
[0021] 进一步地，所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对质粒标准 品DNA模板进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。
[0022] 更进一步地，所述质粒标准品DNA模板的浓度为IO4/ μ 1。
[0023] 本发明的一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的PCR扩增体系，所述实 时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括质粒标准品DNA模板、PCR阴性对照；
[0024] 所述实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20 μ 1的扩增体系：10 μ 1的样品 DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、1 μ M FRET-上游引物、1 μ M FRET-下游引物、 0. 2 μ M的6-FAM探针、0. 2 μ M的Cy5探针、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0025] 本发明的一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的PCR扩增体系，所述反 转录PCR扩增对象包括质粒标准品DNA模板、RNA提取的阴性对照和PCR阴性对照；
[0026] 所述反转录PCR扩增检测体系包括20μ 1的扩增体系：10μ 1的样品DNA模板或者 定量标准试剂、IxPCR缓冲液、ΙμΜ FRET-上游引物、ΙμΜ FRET-下游引物、0. 2μΜ的6-FAM 探针、0. 2 μ M的Cy5探针、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP、0. 14个单位的商业化反 转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
[0027] 本发明的一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的检测方法，所述PCR 扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得 循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：lx 2min@95°C ;18个温度 递减的高严谨循环：6x lsec@95°C，12sec@7(rC，8sec(g72t： ;9x lsec@95°C，12sec@68t：， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 个欠严谨的荧光获得循环：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集荧光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 个熔解循环：lx lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持续收集荧光；降温循环：lx lsec@38°C。
[0028] 本发明的一种所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的检测方法，所述 PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的 荧光获得循环和1个降温循环；
[0029] 反转录：lx 30min@55 °C ;预变性：lx 2min@95 °C ;18个温度递减的高 严谨循环：6x lsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C ;9x lsec@95 °C，12sec@68 °C， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 个欠严谨的荧光获得循环：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集荧光），30sec@67°C ,and 30sec@72°C ;降温循环：lx lsec@38°C。
[0030] 本发明所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法在登革热 病中的应用。
[0031] 本发明所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法在登革热 病的应用。
[0032] 有益效果：本发明操作便捷，适合于检测大量样本，可以快速，高度灵敏、特异、 快速检测的并分型所有登革病毒的血清型。为登革热爆发时的快速、准确地诊断大批临床 样品，并尽快地控制本病提供了坚实的基础。本发明具有如下优点：
[0033] (1)本发明可以特异性地检测所有登革病毒血清型。登革病毒属于黄病毒科、黄病 毒属病毒，其基因组为单股正链RNA，全长约llkb，编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白，结 构蛋白分别为衣壳蛋白C，膜蛋白PrM/M和包膜蛋白E。包膜蛋白E诱导生成血凝抑制抗体、 中和抗体和保护性抗体、根据E抗原可把登革病毒分为四个血清型（DENV1、DENV2、DENV3和 DENV4)，各血清型之间存在交叉反应。因此，能够同时检测到所有登革病毒的血清型很重 要，尤其对于同源性差别较大的血清型；同时，检测到所有的种或血清型可以更方便的发现 新的登革病毒血清型，并及时的更新登革病毒的分类，从而更好地认识该病原体。
[0034] (2)本发明RT-PCR体系具有极高的灵敏度。在病毒感染的早期或恢复期，机体内 病毒的含量相对较低，这就需要灵敏度、准确度更高的检测方法，从而能够及时、快速地诊 断、监测和控制传染病（尤其像登革热这种急性传染病）。本发明反转录PCR体系可以检测 到单拷贝的质粒核酸，载有埃博拉病毒5种亚型的DNA核酸，同时可以有效地扩增最低KT 7 禽流感病毒HlNl的RNA核酸，从鸡胚尿囊液中制备的RNA核酸标准品。
[0035] (3)本发明可以对不同血清型的登革病毒进行分型。不同血清型的登革病毒可 以引起不同的疾病和症状。世界卫生组织把登革热分为典型登革热、登革出血热dengue hemorrhagic fever, DHF 和登革休克综合征 dengue shock syndrome, DSS 三型，后两型病 情严重，病死率高。典型登革热起病急，表现为高热、头痛、肌肉和关节痛、淋巴结肿大、白细 胞减少等，约一半病例出现皮疹、血小板减少，部分病例出现眼眶后痛、呕吐、肝功能损伤、 鼻衄及牙龈渗血等。各型登革病毒均可导致DHF和DSS，但初次感染DENV-2和DENV-3, DHF 和DSS的发生率高于DENV-I和DENV-4。病人第二次感染不同型登革病毒后，可能发生抗体 依赖感染增强现象antibody-dependent enhancement, ADE而常发展为严重的DHF，危机生 命。DENV-2和DENV-3再次感染导致DHF的可能性是DENV-4的2倍。因此，能够检测并确 定感染登革病毒的血清型能够为更好地治疗和控制登革热提供科学依据。
[0036] (4)本发明根据登革病毒核酸序列保守区间建立了一种可以对所有登革病毒血清 型进行检测和分型的反转录PCR系统。首先从NCBI上获得所有登革病毒血清型以及与之 同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，并选择相对保守的区间设计引物（上游引物 和下游引物）和探针阳-FAM探针和Cy5探针），然后用该引物和探针对样品进行实时、定 量、灵敏和快速地检测。对于含有登革病毒RNA核酸的样品，在反转录PCR结果中其荧光曲 线会在660nm处出现或增强，同时对于不同登革病毒血清型其高分辨率熔解曲线的熔解峰 会出现在不同的温度处。因此，可以根据熔解峰温度（Tm值）区分不同血清型的登革病毒。 [0037] (5)本发明的原理和最核心的思路是发明一种高度灵敏、特异、快速检测和分型 所有登革病毒血清型DENV1-4的方法体系。同时确保此系统不扩增其它非登革病毒的 微生物，尤其是与其相近的其他病原体，如黄热病毒Yellow fever virus、乙型脑炎病毒 Japanese encephalitis virus 和西尼罗河热病毒 West Nile fever virus 等。本发明选 择登革病毒保守区域作为目的片段设计引物和探针。

【专利附图】

【附图说明】
[0038] 图1为本发明反转录PCR的上游引物的示意图；
[0039] 图2为本发明反转录PCR的6-FAM探针的示意图；
[0040] 图3为本发明反转录PCR的Cy5探针的示意图；
[0041] 图4为本发明反转录PCR的下游引物的示意图；
[0042] 图5为本发明登革病毒1型的扩增曲线的示意图
[0043] 图6为本发明登革病毒1型的熔解曲线的示意图；
[0044] 图7为本发明登革病毒2型的扩增曲线的示意图；
[0045] 图8为本发明登革病毒2型的熔解曲线的示意图；
[0046] 图9为本发明3登革病毒3型的扩增曲线的示意图；
[0047] 图10为本发明3登革病毒3型的熔解曲线的示意图；
[0048] 图11为本发明登革病毒4型的扩增曲线的示意图；
[0049] 图12为本发明登革病毒4型的熔解曲线的示意图；
[0050] 图13为本发明登革病毒1，2, 3,4型质粒的扩增曲线的示意图；
[0051] 图14为本发明登革病毒1，2, 3,4型质粒的熔解曲线的示意图；
[0052] 图15为本发明中反转录PCR体系的扩增曲线的示意图；
[0053] 图16为本发明中反转录PCR体系的熔解曲线的示意图；
[0054] 图17为本发明四种登革病毒血清型琼脂糖凝胶电泳的示意图。

【具体实施方式】
[0055] 下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对 本发明保护范围的限定。
[0056] 实施例1
[0057] 本发明提供了一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒，包括引物、探针和 FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和Cy5探针；
[0058] 上游引物：5 ' -GACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCTCC-3 ' SEQ ID No. 1，此引物序列与 DENVl型完全吻合，而与DENV2, DENV3和DENV4都有一个相同的错配碱基；
[0059] 6-FAM 探针：5' -CTGTAGAGACAGCAGGATCTCTGGTC-6-FAM-3' SEQ ID No. 2 ;反转录 PCR 的 6-FAM 探针序列：5' -CTGTAGAGACAGCAGGATCTCTGGTC-6-FAM-3'（26bp)，此序列为图 中获得序列的对称链核苷酸序列。此FAM探针序列与所有登革病毒血清型完全吻合；
[0060] Cy5 探针：5' -Cy5-CTCCCAGCGTCAATATGCTGTTT -磷酸基团-3' SEQ ID No. 3 ;反转 录 PCR 的 Cy5 探针序列：5' -Cy5-CTCCCAGCGTCAATATGCTGTTT -磷酸基团-3'（23bp)，此序 列为图中获得序列的对称链核苷酸序列。此FAM探针序列与DENVl和DENV3完全吻合，而 与DENV2和DENV4在相同位置有1个错配碱基；
[0061] 下游引物：5' -GGCGYTCTGTGCCTGGAWTGATG-3' SEQ ID No. 4 ;反转录 PCR 下游引物 序列：5'-GGCGYTCTGTGCCTGGAWTGATG-3'（23bp)，此序列为图中获得序列的对称链核苷酸序 列。此下游引物序列中有2个兼并碱基Y和W，其中兼并碱基Y可以同时扩增T和C碱基， 兼并碱基W可以同时扩增A和T碱基。因此，此引物序列和所有登革病毒血清型完全吻合。
[0062] 所述试剂盒包括：引物、6-FAM探针、Cy5探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、 FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
[0063] 所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对质粒标准品DNA模板 进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入PUC57载体构建而成的重组质粒。
[0064] 本发明试剂盒中提供登革病毒4个血清型浓度为104/ μ 1的质粒标准品DNA模 板。合成登革病毒4个血清型（DENV1，DENV2，DENV3，DENV4)目的片段的DNA序列。
[0065] 本发明的一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的PCR扩增体系，所述实 时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括质粒标准品DNA模板、PCR阴性对照；
[0066] 所述实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20 μ 1的扩增体系：10 μ 1的样品 DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、1 μ M FRET-上游引物、1 μ M FRET-下游引物、 0. 2 μ M的6-FAM探针、0. 2 μ M的Cy5探针、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0067] 本发明的一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的PCR扩增体系，所述反 转录PCR扩增对象包括质粒标准品DNA模板、RNA提取的阴性对照和PCR阴性对照；
[0068] 所述反转录PCR扩增检测体系包括20μ 1的扩增体系：10μ 1的样品DNA模板或者 定量标准试剂、IxPCR缓冲液、ΙμΜ FRET-上游引物、ΙμΜ FRET-下游引物、0. 2μΜ的6-FAM 探针、0. 2 μ M的Cy5探针、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP、0. 14个单位的商业化反 转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
[0069] 制备PCR用的标准定量试剂。
[0070] (I) FRET-PCR标准品的制备
[0071] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中国南京）合成登革病毒4个血清型（DENV1，DENV2， DENV3, DENV4)目的片段的DNA序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的 基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10 μ 1合成物的稀释试剂含10, 〇〇〇 拷贝、1，000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的目的基因作为标准品。本发明试剂盒中提供 登革病毒4个血清型浓度为104/μ 1的质粒标准品。
[0072] (2)反转录PCR标准品的制备
[0073] 用禽流感病毒（HlNl)感染鸡胚后收取其尿囊液，用商业RNA提取试剂盒（High Pure RNA Isolation Kit，罗氏，德国）进行RNA核酸提取后，用TE缓冲液（PH 8.0)进行 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8梯度稀释后作为检测反转录PCR系统效率的标准品。
[0074] 本发明的一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的检测方法，所述PCR 扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得 循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：lx 2min@95°C ;18个温度 递减的高严谨循环：6x lsec@95°C，12sec@7(rC，8sec(g72t： ;9x lsec@95°C，12sec@68t：， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 个欠严谨的荧光获得循环：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集荧光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 个熔解循环：lx lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持续收集荧光；降温循环：lx lsec@38°C。
[0075] 本发明的一种所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的检测方法，所述 PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的 荧光获得循环和1个降温循环；
[0076] 反转录：lx 30min@55 °C ;预变性：lx 2min@95 °C ;18个温度递减的高 严谨循环：6x lsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C;9x lsec@95 °C，12sec@68 °C， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 个欠严谨的荧光获得循环：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集荧光），30sec@67°C ,and 30sec@72°C ;降温循环：lx lsec@38°C。
[0077] 本发明所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法在登革热 病中的应用。
[0078] 琼脂糖凝胶电泳：
[0079] 图15为本发明中反转录PCR体系的扩增曲线的示意图；图16为本发明中反转录 PCR体系的熔解曲线的示意图；
[0080] 如图17所示，图17为本发明四种登革病毒血清型琼脂糖凝胶电泳。本发明RT-PCR 体系扩增四种登革病毒血清型（DENV1，DENV2, DENV3和DENV4)DNA的目的核苷酸片段大小 为200个碱基对bp。各泳道依次为：泳道-1 :标准品Ladder，泳道-2 :登革病毒1型DENV1， 泳道-3 :登革病毒2型DENV2,泳道-4 :登革病毒3型DENV3,泳道-5 :登革病毒4型DENV4， 泳道-6:阴性对照。
[0081] 配制3 %琼脂糖凝胶，取10 μ I PCR扩增产物，并用SYBKx. Safe DNA Gel Stain 染色，在紫外灯下观察，可以看到200bp处的目的条带。所使用的标准品为20bp DNA Ladder(Thermo Scientific OjRangeRuler 20bp DNA Ladder, ready-to-use, Fermentas? by Thermo Scientific?,美国）]，且其条带大小依次为 20bp, 40bp, 60bp, 80bp, IOObp, 120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，300bp。对于不同血清型的登革病毒，其熔解峰的温度， Tm值会有差异。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中的条带大小为200bp。
[0082] PCR结果的判定：
[0083] 图5为本发明登革病毒1型的扩增曲线。扩增曲线图5表明本发明系统可以检测 到反应体系中单拷贝的登革病毒1型DNA分子，且具有可重复性；图6为本发明登革病毒1 型的熔解曲线，表明本发明系统对于登革病毒1型具有稳定的Tm值；
[0084] 图7为本发明登革病毒2型的扩增曲线的示意图，表明本发明系统可以检测到反 应体系中单拷贝的登革病毒2型DNA分子，且具有可重复性；图8为本发明登革病毒2型的 熔解曲线的示意图，表明本发明系统对于登革病毒2型具有稳定的Tm值；
[0085] 图9为本发明3登革病毒3型的扩增曲线的示意图；可以检测到反应体系中单拷 贝的登革病毒3型DNA分子，且具有可重复性；图10为本发明3登革病毒3型的熔解曲线 的示意图；表明本发明系统对于登革病毒3型具有稳定的Tm值；
[0086] 图11为本发明登革病毒4型的扩增曲线的示意图，表明本发明系统可以检测到 反应体系中单拷贝的登革病毒4型DNA分子，且具有可重复性；图12为本发明登革病毒4 型的熔解曲线的示意图，表明本发明系统对于登革病毒4型具有稳定的Tm值；
[0087] 如图13和图14所示，本发明根据登革病毒核苷酸序列中保守区间巧妙地设计了 一对引物（上游引物和下游引物）和探针出-FAM探针和Cy5探针）并依此建立可以检测所 有血清型登革病毒的反转录PCR体系，同时本发明体系可以将登革病毒4个血清型（DENV1、 DENV2、DENV3和DENV4)依据其RT-PCR高分辨率熔解曲线的Tm值的不同分为DENVI、DENV3、 DENV2/DENV4三个组；图13为本发明登革病毒1，2,3,4型质粒的扩增曲线的示意图；本发 明系统可以检测到反应体系中单拷贝的登革病毒1，2,3,4型DNA分子，且具有可重复性； FRET-PCR扩增对象包括质粒标准品DNA模板、PCR阴性对照，所述PCR阴性对照为双蒸水； 反转录PCR扩增对象包括标准品RNA模板、RNA提取的阴性对照和PCR阴性对照。图14为 本发明登革病毒1，2,3,4型质粒的熔解曲线的示意图。此发明有着高度的特异性，不仅能 检测到四种登革病毒血清型的核酸，如图14所示，为表明本发明系统对于登革病毒1，2, 3， 4型具有稳定的Tm值，同时依据Tm值的不同可以将登革病毒1，2, 3,4型分为DENVl，DENV2/ DENV4、DENV3三个组；而且能够根据PCR熔解曲线将其分为3组：登革病毒1型、登革病毒 3型、登革病毒2型/4型。阳性样品和阳性对照FRET-PCR的荧光扩增曲线在660nm有荧光 的出现或增强，且熔解曲线中有熔解峰出现。
[0088] 实施例2
[0089] 转录方法验证本发明PCR体系
[0090] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中国南京）合成含有登革病毒1型目的片段DNA和 17启动子的质粒PUC57,用合适的限制性内切酶（Sac I，宝生物，大连）对质粒进行酶切； 通过PCR扩增提高目的DNA浓度；用商业化转录试剂盒（MEGAscripPKit，amhior# by life technoioges%美国）对PCR扩增产物进行转录并获得RNA产物；转录完成后，将转录 产物直接用于反转录PCR进行扩增。
[0091] (1)质粒的稀释
[0092] 将含有合成质粒的微型离心管4000转离心2分钟，然后加入40 μ 1双蒸水或TE 缓冲液（PH8. 0)配成质粒浓度为IOOng/ μ 1的溶液；
[0093] (2)质粒的酶切

【权利要求】
1. 一种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品， 其特征在于：所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和Cy5探针； 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列； 所述6-FAM探针具有SEQ ID No. 2的核苷酸序列； 所述Cy5探针具有SEQ ID No. 3的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒，其特征在于：所 述试剂盒包括：引物、6-FAM探针、Cy5探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、FRET-PCR标 准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
3. 根据权利要求2所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒，其特征在于：所 述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对质粒标准品DNA模板进行扩增获 得的扩增核苷酸片段插入PUC57载体构建而成的重组质粒。
4. 根据权利要求3所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒，其特征在于：所 述质粒标准品DNA模板的浓度为104/ yl。
5. -种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的PCR扩增体系，其特征在于：所述 实时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括质粒标准品DNA模板、PCR阴性对照； 所述实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20 yl的扩增体系：10 yl的样品DNA 模板或者定量标准试剂、lxPCR缓冲液、1 ii M FRET-上游引物、1 ii M FRET-下游引物、0. 2 ii M 的6-FAM探针、0. 2 ii M的Cy5探针、2个单位的商业化Taq酶、200 ii M dNTP。
6. -种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的PCR扩增体系，其特征在于：所述 反转录PCR扩增对象包括标准品质粒标准品DNA模板、RNA提取的阴性对照和PCR阴性对 昭. >、、、? 所述反转录PCR扩增检测体系包括20iU的扩增体系：10ia的样品DNA模板或者定量 标准试剂、lxPCR缓冲液、1 ii M FRET-上游引物、1 ii M FRET-下游引物、0. 2 ii M的6-FAM探 针、0. 2 ii M的Cy5探针、2个单位的商业化Taq酶、200 ii M dNTP、0. 14个单位的商业化反转 录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
7. -种反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述PCR 扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得 循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：lx 2min@95°C ;18个温度 递减的高严谨循环：6x lsec@95°C，12sec@7(rC，8sec(g72t： ;9x lsec@95°C，12sec@68t：， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 个欠严谨的荧光获得循环：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集荧光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 个熔解循环：lx lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持续收集荧光；降温循环：lx lsec@38°C。
8. -种所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所 述PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨 的荧光获得循环和1个降温循环； 反转录：lx 30min@55 °C ;预变性：lx 2min@95 °C ;18个温度递减的高严谨循 环：6x lsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C ;9x lsec@95 °C，12sec@68 °C，8sec@72 °C ; 3x lsec@95 °C，12sec@66 °C，8sec@72 °C ;40 个欠严谨的荧光获得循环：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集荧光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;降温循环：lx lsec@38°C。
9.权利要求1-4任一项所述的反转录PCR检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法 在登革热病中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK104328222SQ201410655886
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】王成明, 张继垒, 陆光武 申请人:扬州大学