水稻粒长基因gs3的功能标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于农业生物【技术领域】，提供了一种水稻粒长基因GS3的功能标记及其应用，通过设计合成了三条引物：gs3In、gs3F和gs3R，三条引物同时在PCR体系中对不同水稻DNA 进行扩增，然后对扩增产物通过电泳检测是否含有gs3等位基因。此过程中，扩增产物不需要进行酶切，直接通过电泳就能检测出是否含有gs等位基因，简化了步骤，不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种群体是否含有gs等位基因，而且在育种应用中加速了选育进程，提高了效率。
【专利说明】水稻粒长基因GS3的功能标巧及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物【技术领域】，设及一种水稻粒长基因GS3的功能标记及其应 用。
【背景技术】
[0002] 水稻是重要的粮食作物，为全球一半的人口提供口粮。随着世界人口的增长，水稻 作为主要粮食作物面临着提高产量的迫切需要。预计到2030年，水稻产量需要提高40% W 上才能满足人类的需要。
[0003] 水稻单株产量是由有效穗数、每穗粒数和粒重=个因素共同决定的，对于水稻的 整体产量而言，该=个因素表面上是独立的但又相互关联，很多情况下会出现此消彼长的 矛盾。在有效穗数和每穗粒数达到一个相对理想的较高水平时，提高巧粒的重量将是提高 水稻产量的关键因素之一。研究表明，水稻粒重是由水稻粒长和粒宽决定的，最先鉴定的控 制水稻粒长的主效QTL(quantitative trait locus,数量性状基因座）位点GS3是控制水 稻粒重和粒长的主效Q化，同时也是控制水稻粒宽和巧粒充实度的微效QTL。GS3CDNA全长 95化P，包含5个外显子，编码为一个由232个氨基酸组成的跨膜蛋白。经过序列分析表明， 与小粒品种相比，大粒品种GS3第2外显子中编码第55位半脱氨酸的密码子TGC突变成终 止密码子TGA，造成蛋白翻译提前终止（缺失了 178个氨基酸）。
[0004] 现有研究中，GS3开发有功能标记Sf28,由正反两条引物构成，PCR扩增后需要限 制性内切酶切消化过夜，再进行电泳检测，成本高，耗时长，不适应高通量的分子标记辅助 选择。
【发明内容】
[0005] 针对W上技术问题，本发明提供了一种水稻粒长基因GS3的功能标记及其应用。
[0006] 水稻粒长基因GS3的功能标记，所述水稻粒长基因GS3的粒长等位基因的显性分 子标记M-GS3由S条引物构成：
[0007] gs3F 引物；ATTGGCTTGATTTCCTGTGC ;
[0008] gsSIn 引物；GCAGGCTGGCTTACTTTCTT ;
[0009] gs3R 引物；TTGCTCTTACGGGAGGACAC ;
[0010] 其中，所述gs3In的序列与所述GS3等位基因匹配，并在3'末端引入一个错配。
[0011] 作为本发明的进一步改进，扩增水稻基因组DNA时，如果同时含有720bp和308bp 两条特征条带，则为含粒长gs3等位基因；如果仅含有72化P的特征条带，则为不含粒长 gs3等位基因。
[0012] 作为本发明的进一步改进，所述水稻粒长基因GS3的功能标记采用W下步骤进行 分子标记：
[001引步骤1)冰稻植株基因组DNA的提取；
[0014] 步骤。；PCR扩增；将所述的gs3F、gs3In和gs3R引物加入到PCR反应体系中， 并对所述水稻植株基因组DM进行扩增得到扩增产物；所述PCR反应程序为；94°C预变性 5min ;然后94°C变性30s、55°C变性30s、72°C变性45s，循环35次；然后72°C延伸lOmin后 得到扩增产物；
[0015] 步骤3):将扩增产物在质量比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，然后漠化己锭 染色，紫外灯下观察并拍照得到电泳图；
[0016] 步骤4);根据电泳图进行分析，如果同时含有720bp和308bp两条特征条带，则为 含粒长gs3等位基因；如果仅含有72化P的特征条带，则为不含粒长gs3等位基因，为短粒 品种。
[0017] 作为本发明的进一步改进，上述步骤中，所述PCR反应体系为20 UL的体系： 2. 0 y L 的 10XBuffer、2. 0 y L 的 dNTPs、4mol/L 的 gs3F、4mol/L 的 gs3In 和 4mol/L 的 gs3R 引物各 l.OuUO. 2yL Taq DM 聚合酶，2. OuL 模板 DNA，12. 8yL (1地2〇。
[0018] 本发明还提供了水稻粒长基因GS3的功能标记在水稻育种中的应用。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0020] 本发明针对技术问题，设计了一条能匹配长粒等位基因gs3的引物gs3In(3'端错 配一个碱基），并在其上游一条引物gs3F，下游设计一条gs3R。S条引物同时在PCR体系中 进行扩增，长粒等位基因gs3的序列与gs3In只有一个碱基错配，故gs3F与gs3In之间的 308bp能扩增出来；而短粒等位基因GS3与引物gs3In有两个碱基错配，则308bp的带就不 能扩增出来。该样，扩增产物不需要进行酶切，直接电泳检测是否含有308bp的条带，就能 检测出是否含有gs等位基因；简化了步骤，不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种 群体是否含有gs等位基因，而且在育种中加速了选育进程，提高了效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是本发明粒长等位基因的扩增示意图；
[0022] 图2是本发明检测24个水稻品种分子标记的电泳图。
[0023] 图中，M 为 Marker200,从上到下条带分别为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp 和 lOObp ;1-II-32B ;2-BX-16 ;3-岗 4她；4-特 B ;5-良丰 B ;6-112B ;7-西菲 B ;8-龙 丰 B ;9-博 IIB ;10-158B ;11-地谷 B ;12-福伊 B ;13-谷梅 4 号；14-02428 ;15-南梗 46 ; 16-BL122 ;17-博 IIIB ;18-协青早 B ;19-B5 ;20-IRBB7 ;21-L427 ;22-金 23B ;23-内香 B ; 24-泰丰B。
【具体实施方式】
[0024] W下将结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步地详述。
[00巧]实施例1
[0026] 具体实施步骤如下：
[0027] (1)水稻基因组DNA提取
[002引分别取种植于南宁的24份水稻叶片，通过CTAB法（十六烧基=甲基漠化锭法） 提取水稚基因组DNA ;
[0029] (2) PCR 扩增
[0030] PCR 反应体系为 20yL 的体系；2. OuL 10XBuffer，2. OuL dNTPs，gs3F、gs3In 和 gs3R 引物各 1.0yL(4mol/L)，0. 2yL Taq DM 聚合酶，2. OuL 模板 DNA，12. 8yL (1地2〇。 PCR 反应程序为 94°C 5min ;然后 94°C 30s、55°C 30s、72°C 45s，循环 35 次；最后 72°C延伸 lOmin得到扩增产物；
[0031] (3)将扩增产物在1. 2%琼脂糖凝胶中进行电泳，漠化己锭染色，紫外灯下观察拍 照得到电泳图；
[00对 （4)结果与分析；
[0033] 24个水稻品种的分子标记的电泳图详见图1，24个水稻品种的粒长表型和基因性 详见表1。由图1和表1可见；基因型为"+ "为图1中有720bp和308bp两条带的品种，其 粒长较长；基因性为为图1中仅有720bp条带的品种，其粒长均较短。
[0034] 表1 24个水稻品种及其粒长表型和基因性
[0035]
【权利要求】
1. 水稻粒长基因GS3的功能标记，其特征在于，所述水稻粒长基因GS3的粒长等位基因 的显性分子标记M-GS3由三条引物构成： gs3F引物：AITGGCTTGAITTCCTGTGC; gs3In引物：GCAGGCTGGCTTACTTTCTT; gs3R引物：TTGCTCTTACGGGAGGACAC。
2. 根据权利要求1所述的功能标记，其特征在于：扩增水稻基因组DNA时，如果同时含 有720bp和308bp两条特征条带，则为含粒长gs3等位基因；如果仅含有720bp的特征条 带，则为不含粒长gs3等位基因。
3. 根据权利要求1或2所述的功能标记，其特征在于，采用以下步骤进行分子标记： 步骤1):水稻植株基因组DNA的提取； 步骤2) :PCR扩增：将所述的gs3F、gs3In和gs3R引物加入到PCR反应体系中，并对所 述水稻植株基因组DNA进行扩增得到扩增产物；所述PCR反应程序为：94 °C预变性5min ;然后94°C变性30s、55°C变性30s、72°C变性45s，循环35次；然后72°C延伸10min后得 到扩增产物； 步骤3):将扩增产物在质量比浓度为1. 2%的琼脂糖凝胶中电泳，然后溴化乙锭染色， 紫外灯下观察并拍照得到电泳图； 步骤4):根据电泳图进行分析，如果同时含有720bp和308bp两条特征条带，则为含粒 长gs3等位基因；如果仅含有720bp的特征条带，则为不含粒长gs3等位基因，为短粒品种。
4. 根据权利要求3所述的功能标记，其特征在于：所述PCR反应体系为20yL的体系： 2.0yL的 10XBuffer、2.0yL的dNTPs、4mol/L的gs3F、4mol/L的gs3In和 4mol/L的 gs3R引物各 1.0yL、0.2yLTaqDNA聚合酶，2.0yL模板DNA，12.8yLddH20。
5. 权利要求1所述的水稻粒长基因GS3的功能标记在水稻育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104513859SQ201410852508
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】邓国富, 高利军, 周萌, 周维永, 陈小林, 颜群, 戴高兴, 梁海福, 陈仁天, 李瑞芳, 陈韦韦 申请人:广西壮族自治区农业科学院水稻研究所, 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所