技术领域本发明涉及一种复合植物提取物在抑制赭曲霉毒素A产生中的应用。
背景技术：
植物提取物是一类植物源次生代谢物质,分子量较小、可随水蒸气蒸出、具有一定气味的挥发性油状物质。植物提取物具有抑菌、杀虫、抗氧化等活性，在医药、农药、饲料添加剂、食品防腐保鲜等方面有广泛应用。植物提取物具有来源于天然、对人体相对安全、与环境友好、生物活性多样等特点，越来越引起人们的关注。抗菌活性较高的植物提取物主要是醇、醛、酮以及酚类化合物，如百里香酚、肉桂醛、丁香酚、香紫苏醇、柠檬醛、香茅醛、香茅醇、大蒜素、姜黄素等。赭曲霉毒素(Ochratoxin)属于异香豆素类的衍生物，共有A、B、C、D4种。此外，还包括一些OTA的代谢产物和赭曲霉毒素B的代谢产物。其中OTA(OchratoxinA，OTA)分布最为广泛，毒性最强，而且最容易被检出。OTA主要由赭曲霉(Aspergillusochraceus)、炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)、黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicilliumverrucosum)等产生。赭曲霉毒素A(OTA)常常污染谷物、咖啡、葡萄酒、啤酒和香辛料等，其中赭曲霉主要污染大米、小麦、燕麦、咖啡及其饮料等，黑曲霉和炭黑曲霉主要污染葡萄、葡萄干及葡萄酒等。赭曲霉毒素A(OTA)作为一种天然污染物，尤其在那些处于温带地区的国家污染严重。德国、英国、加拿大、美国和北欧各国均报道了各类粮食制品及饲料中的赭曲霉毒素A的污染情况。市售的葡萄及葡萄酒、干果、咖啡豆、可可粉及其产品中，均有赭曲霉毒素A的检出。秦筱茂(2011)研究发现印度药材赭曲霉毒素A的污染情况比较严重，样品污染率高达21％，市售的黑胡椒、姜黄粉中赭曲霉毒素A的样品污染率分别达到54％和36％。李增宁(2007)根据AOAC调查河北小麦中赭曲霉毒素A的污染情况，调查结果表明，所采取的61份小麦样品中有24份小麦样品受到了赭曲霉毒素A的侵染，赭曲霉素A的污染程度远远高于文献报道。唐坤甜等(2011)也发现河北省中南部地区有39.34％的大麦都受到了赭曲霉毒素A的污染，而河北省北部地区也将近有35.48％的大麦受到了赭曲霉毒素A侵染，中南部和北部地区小麦中赭曲霉毒素A污染程度都高于现在已有的报道。敖志刚和陈代文(2008)从黑龙江、辽宁、江西、北京等全国14个省份地区采集了玉米样品44份，饲料样品83份，3份小麦样品，21份豆粕样品，37份副产品，测定后发现95.1％的样品都检测出了赫曲霉毒素。杨家岭等(2008)采集了来自全国18个城市的主要粮食类共计486份样品，并检测样品中赭曲霉毒素A的含量，分析赭曲霉毒素A在这18个城市的分布情况，解析赭曲霉毒素A在粮食种类中的分布规律，结果发现，大米、面粉及其制品、大豆等4种样品中的赭曲霉毒素A含量超过国家最高限量；2.47％的粮食类食品中检出赭曲霉毒素A，有11.8％的挂面样品中的赭曲霉毒素A超过了我国标准的最高限量，污染最严重；并且有6个抽样城市的样品中的赭曲霉毒素A含量超出了我国国家标准、CAC与美国、欧盟规定的的最高限量5μg/Kg。杨晓飞等(2007)采集了四川地区的玉米、小麦及其他谷物副产品等主要饲料原料样品，均发现有赭曲霉毒素A的污染。众多研究结果都发现粮食、饲料和原料中普遍存在赭曲霉毒素污染。Zimmerli和Dick首次检测出了葡萄酒中的赭曲霉毒素A。据研究报道，葡萄酒中赭曲霉毒素A最高含量一般为3.4μg/Kg，甜酒中最高含有赭曲霉毒素A3.9μg/Kg，含量都相对较低；葡萄汁中赭曲霉毒素A的含量较高；葡萄干中的赭曲霉毒素A含量最高。J.Blesa等(2004)检测也发现葡萄酒中赭曲霉毒素A含量一般相对较低，低于1ng/mL。RitaSerra等(2004)在葡萄牙的葡萄园中的葡萄酒也检测出了赭曲霉毒素A。蒋春美(2012)研究发现在葡萄表面存在赭曲霉毒素产生菌的污染。动物主要以粮食为饲料，如果饲料被赭曲霉毒素A污染，那么动物进食后会导致赭曲霉毒素在动物体内富集。赭曲霉毒素A在动物体很难被代谢降解，因此在肾脏、肝脏、肌肉以及奶和奶制品等动物性食品中经常检测出含有赭曲霉毒素A。同样，人体食用被赭曲霉毒素A污染的农作物和动物食品也会受到赭曲霉毒素A的危害。在已发现的真菌毒素中，赭曲霉毒素A(OTA)的危害性仅次于黄曲霉毒素，毒理学研究表明，OTA主要损害肝脏和肾脏，具有很强的肝脏毒性和肾脏毒性，大量的毒素也可能引起肠粘膜炎症甚至坏死；OTA被认为是目前致癌力最强的天然物质之一，被IARC定为二级致癌物。由于赭曲霉毒素A(OTA)的毒性，国内外都公布了食品和饲料中OTA的限量标准，以规范生产，控制OTA的污染，最大限度地保障人和动物的食用安全，表1列举了欧盟、中国及台湾地区赭曲霉毒素的限量标准。表1欧盟、中国及中国台湾对食品中OTA先行的限量标准因此，筛选和开发能够高效抑制赭曲霉毒素A产生，安全、无毒的天然活性物质，用于防控食品受到赭曲霉毒素A的污染，提升食品安全水平，具有十分重要的经济价值和社会意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供复合植物提取物在抑制赭曲霉毒素A产生中的应用。本发明提供的复合植物提取物在抑制赭曲霉毒素A产生中的应用。上述的应用中，所述复合植物提取物由肉桂醛、柠檬醛和丁香酚组成。上述的应用中，所述肉桂醛、所述柠檬醛和所述丁香酚的体积比可为2～6：2～6：1，具体可为2：2：1；所述复合植物提取物的pH值可为6.5～7.0。上述的应用中，所述赭曲霉毒素A为赭曲霉、黑曲霉、疣孢青霉和炭黑曲霉中至少一种代谢产生。上述的应用中，所述复合植物提取物抑制如下产品中所述赭曲霉毒素A产生：谷物、食品和/或饮料；所述复合植物提取物占所述产品的浓度可为100～500μL/L，具体可为150μL/L、200μL/L、250μL/L、150～200μL/L或200～250μL/L。上述的应用中，采用熏蒸的方法处理所述产品；所述谷物和食品的水分含量均可为0～15％，具体可为12％、15％、12～15％或5～15％。上述的应用中，所述熏蒸处理的温度可为-10～37℃，具体可为28℃、-10～28℃、28～37℃或10～35℃；所述熏蒸处理的时间可为3～45d，具体可为14d、3～14d、14～45d或10～25d；所述熏蒸处理在密闭系统中进行。上述的应用中，所述谷物为小麦、大麦、大米、玉米、黑麦和燕麦中的至少一种；所述食品为咖啡豆、花生、核桃、开心果、榛子、腰果、杏仁、葵花籽、鲜葡萄和葡萄干中的至少一种；所述饮料为葡萄汁、葡萄酒、咖啡饮品、麦芽饮料、酒精饮料、燕麦饮料和大米饮料中的至少一种。本发明还提供了一种赭曲霉毒素A产生抑制剂，该抑制剂的活性成分为所述复合植物提取物。本发明具有以下优点：1、本发明复合植物提取物各组分肉桂醛、柠檬醛、丁香酚的原料资源在我国来源广，生产工艺比较简易、成本低，对人畜安全性好，对环境无污染，并且有花的清香，有效期可达一年以上。2、本发明扶着植物提取物各组分肉桂醛、柠檬醛、丁香酚，均已被列入食品添加剂目录(GB2760-2011食品安全国家标准-食品添加剂使用标准)。3、磷化氢类化学抑菌剂，虽然挥发性良好但难除尽，并且易燃，严重威胁操作人员的人身安全和身体健康；而本发明复合植物提取物为食品级生物制剂，不仅挥发性好，用量少，易排除，在限量范围内使用对人体无害。4、本发明所用的抑菌剂为复合植物提取物，与单种植物提取物相比，效果更为显著且不易产生抗药性。附图说明图1为不同浓度复合植物提取物对赭曲霉毒素A产生的影响。图2为复合植物提取物抑制小麦(水分含量12％)中赭曲霉毒素A产生的效果。图3为复合植物提取物抑制小麦(水分含量15％)中赭曲霉毒素A产生的效果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，使用的赭曲霉(Aspergillusochraceus)购于CGMCC，该菌株在CGMCC的编号为3.4412，其代谢产生赭曲霉毒素A。实施例1、不同浓度复合植物提取物对赭曲霉毒素A产生的影响复合植物提取按照如下方法制备：(1)植物提取物混合液的配制：按照体积比为4:4:2的比例取肉桂醛：柠檬醛：丁香酚；按照用量由少到多的比例依次混合三种植物提取物，边加边搅拌，混合均匀获得复合植物提取物；(2)上述复合植物提取物所用原料植物提取物纯度均较高，无需除杂；(3)复合植物提取物的pH调节：用三乙醇胺调节步骤(1)的复合植物提取物混合液的pH至6.5-7.0，即得到复合植物提取物。PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，用蒸馏水定容至1000mL，加去离子水补足1L，115℃高压灭菌30分钟，降温到55℃左右倒平板，每平板20mL。YES培养基(1L)：2％酵母提取物、15％蔗糖、0.5％MgSO4·7H2O。菌种活化：把赭曲霉接种于PDA培养基上，28℃下生长14天，4℃储藏。赭曲霉孢子液制备：用无菌棉签挑取平板培养基上的赭曲霉孢子溶于0.01％吐温20中，用无菌水稀释初始孢子液至孢子浓度为1×105cfu/mL。赭曲霉毒素A标准品制备：赭曲霉毒素A标准品粉末中加入1mL乙腈(色谱纯)溶解，制成1mg/mL的储备液，用乙腈：水(1:1,V:V)稀释到10、20、50、100、200μg/kg，用高效液相色谱检测，绘制赭曲霉毒素A标准曲线。赭曲霉毒素A提取方法：10mL的滤液中加入10mL甲醇，混匀，震荡1min后在14000rpm的转速下离心10min，用0.45μm的微孔滤膜过滤，洗脱液用氮吹仪60℃吹干，残留物用流动相(乙腈：水：乙酸(99:99:2,V:V:V))复溶，然后放进冰箱，-18℃储存，以备用HPLC检测。高效液相色谱检测赭曲霉毒素A条件：安捷伦C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；Waters荧光检测器2487型，激发波长330nm，发射波长460nm；柱温：30℃；以乙腈：水：乙酸(99:99:2,V:V:V)为流动相；进样量：50μL；流速：1.0mL/min。每个三角瓶中分装50mLYES培养基，灭菌后加入复合植物提取物1.25μL、2.5μL、3.75μL、5μL、7.5μL、10μL，使复合植物提取物的浓度分别为25、50、75、100、150、200μL/L，接入100μL孢子液(1×105cfu/mL)，放进ZWY-2102C摇床28℃培养7天。培养后，YES培养液中的菌丝用无菌滤纸过滤，并用无菌水冲洗菌丝，从菌丝中提取赭曲霉毒素A并用HPLC检测。结果表明，复合植物提取物在较低的浓度25-50μg/mL就可以显著地抑制赭曲霉毒素A的积累，浓度上升到75-200μg/mL时完全抑制赭曲霉毒素A的产生。实施例2、复合植物提取物熏蒸抑制赭曲霉毒素A在小麦(水分含量为12％)中的产生复合植物提取物同实施例1。菌种活化和赭曲霉孢子液制备方法同实施例1。赭曲霉毒素A的提取和HPLC检测条件同实施例1。小麦样品经1％次氯酸钠溶液清洗消毒，无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分。根据与预调目标水分差值加入定量无菌水，放于4℃静置24h使水分含量平衡，获得实验所需水分含量(12％)的小麦。将小麦以300g为单位分装到1L锥形瓶中，加入1mL孢子悬液(浓度2×106个/mL)，轻轻摇动瓶子使孢子均匀覆盖到小麦上。紧接着滴加复合植物提取物于无菌滤纸上，放入锥形瓶内，使复合植物提取物添加浓度分别为0、50、100、150和200μL/L，密封后恒温恒湿箱28℃培养14d，测定小麦赭曲霉毒素A含量。每组做3个重复。结果表明，与对照相比，所有实验浓度复合植物提取物均能显著抑制小麦中赭曲霉毒素A的产生，并且随着复合植物提取物浓度的升高而增强，当复合植物提取物浓度达到150μL/L时小麦中赭曲霉毒素A与对照相比由437μg/kg降低到12μg/kg，抑制率为97.3％，复合植物提取物浓度为200μL/L时完全抑制赭曲霉毒素A的产生。实施例3、复合植物提取物熏蒸抑制赭曲霉毒素A在小麦(水分含量为15％)中的产生复合植物提取物同实施例1。菌种活化和赭曲霉孢子液制备方法同实施例1。赭曲霉毒素A的提取和HPLC检测条件同实施例1。小麦样品经1％次氯酸钠溶液清洗消毒，无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分。根据与预调目标水分差值加入定量无菌水，放于4℃静置24h使水分含量平衡，获得实验所需水分含量(15％)的小麦。将小麦以300g为单位分装到1L锥形瓶中，加入1mL孢子悬液(浓度2×106个/mL)，轻轻摇动瓶子使孢子均匀覆盖到小麦上。紧接着滴加复合植物提取物于无菌滤纸上，放入锥形瓶内，使复合植物提取物添加浓度分别为0、100、150、200和250μL/L，密封后恒温恒湿箱28℃培养14d，测定小麦中赭曲霉毒素A含量，每组做3个重复。结果表明，与对照相比，所有实验浓度复合植物提取物均能显著抑制小麦中赭曲霉毒素A的产生，并且随着复合植物提取物浓度的升高而增强，当复合植物提取物浓度为150μL/L时，小麦中赭曲霉毒素A含量由437μg/kg降低到26μg/kg，抑制率为94.1％；复合植物提取物浓度为200μL/L时，小麦中赭曲霉毒素A含量降低到3.2μg/kg，抑制率为99.3％；浓度为250μL/L时完全抑制赭曲霉毒素A的产生；水分含量15％小麦的赭曲霉污染率明显高于12％的小麦。