本发明涉及一种益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物及其制备方法，属于功能性保健品领域。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo) 又名：黑节草、云南铁皮，属微子目，兰科多年生附生草本植物。主要分布于中国安徽、浙江、福建等地，其茎入药，属补益药中的补阴药，有生津养胃；滋阴清热；润肺止咳等功效。唐代医学经典《道藏》曾把铁皮石斛、天山雪莲、百二十年首乌、三两重人参、深山灵芝、花甲之茯苓、海底珍珠、冬虫夏草等列为中华九大“仙草”，铁皮石斛因其显著的滋补功效而名列“中华九大仙草”之首。现代药理学研究表明，石斛具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗血小板凝集、降血脂、降血压、促进消化等作用。
因石斛的生长周期缓慢，森林破坏日益严重，人们的过度采摘，导致野生铁皮石斛频临灭绝，自20世纪70年代以来，国内相关机构便开展了对铁皮石斛的组织培养、快速繁殖技术及人工栽培技术等方面的研究工作。铁皮石斛原球茎是铁皮石斛茎段经组织培养获得团块胚芽，再经干燥、灭菌等步骤制得。高建平（2002）等研究的铁皮石斛原球茎与铁皮石斛免疫调节作用的比较，表明均具有提高免疫功能的作用，且两者作用强度相似。赵龙（2014）研究铁皮石斛原球茎功能活性表明其具有抗氧化和改善睡眠的作用。韦丽文（2013）等对铁皮石斛与铁皮石斛原球茎质量比较的研究表明两者在化学成分、药理作用、石斛多糖成分均相差不大，认为铁皮石斛原球茎具有成为新药材资源的可能性。同时，我国卫生部已发布关于征求拟批准铁皮石斛原球茎为新资源食品意见的函（卫办监督函〔2012〕1050号）。上述表明铁皮石斛原球茎的资源开发已引起各方面的高度关注。
随着传统中医药材养生热潮的复兴，人们越来越意识到铁皮石斛原球茎的宝贵，使石斛产业迅速兴起，相关的加工制品也随之增加。如，一种铁皮石斛原球茎清凉饮料及其制备方法（公开号：CN105285642A），一种浑浊型铁皮石斛保健饮料的生产方法（公开号：CN103783624A）等，但上述饮品的制备方法简单粗放，虽具有一定功效，但真正能被人体所吸收利用的有效成分微乎其微，浪费严重。而传统的食用方法有鲜食、榨汁、煲汤、泡茶、浸酒等，养生保健作用更是微乎其微。故对铁皮石斛原球茎应进行深开发，使产品有效成分得以充分利用，科技含量更高，以满足消费者的需求。
技术实现要素：
人体肠道中寄居着大量的微生物种群，其中益生菌对人体健康起着至关重要的作用。益生菌可以分解代谢上消化道系统不能分解代谢的食物成分，产生短链脂肪酸，为胃肠粘膜细胞提供营养物质。同时对于口服药物尤其是天然药物的某些成分可以进行分解代谢，将药物的前体物质转化成为活性药物成分而发挥作用。
因此，本发明为解决现有产品的不足，以铁皮石斛原球茎为主要原料，利用现代生物技术，将铁皮石斛原球茎经益生菌发酵，体外模拟人体肠道环境，提前对铁皮石斛原球茎中的各种有效成分，进行分解，使其进入人体后直接被吸收，减轻人体负担，同时添加益生元，调节人体肠道环境。
本发明的一个目的是提供一种益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物，所述的组合物为铁皮石斛原球茎经干燥，粉碎成粉，经水浸，添加葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、酵母粉和甜味剂，添加无机盐，灭菌后经益生菌发酵处理，添加聚葡萄糖、低聚果糖浆，得到益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物。
所述的益生菌为纳豆芽孢杆菌、嗜酸链球菌、双歧杆菌、乳杆菌。
所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌或婴儿双歧杆菌；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌。
所述的铁皮石斛原球茎粉在益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物中的重量 g/体积 m1百分比为1~3%。
所述葡萄糖的加入量为重量g/体积ml比0.1~1.5%，蛋白胨的加入量为重量g/体积ml比0.05~1%，酵母膏的加入量为重量g/体积ml比0.01~0.2%，酵母粉的加入量为重量g/体积ml比0.01~0.1%。
所述的无机盐为K2HPO4•3H2O 0.1g/100ml、KH2PO4 0.1g/100ml、FeSO4•7H2O 5.0mg/100ml、ZnSO4•7H2O 4.4mg/100ml、MgSO4•7H2O 25mg/100ml。
所述的甜味剂为重量g/体积ml百分比为3%的塔格糖和重量g/体积ml百分比为0.005%的三氯蔗糖。
所述聚葡萄糖的加入量为重量g/体积ml比2~6%；所述低聚果糖浆含量规格为G 55L，加入量为重量g/体积ml比0.1~0.7%。
本发明的另一个目的是提供一种益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）粉碎：将干燥铁皮石斛原球茎粉碎，细度在60-80目。
（2）提取：取铁皮石斛原球茎粉，加入蒸馏水浸泡30分钟，向浸泡液中添加葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、酵母粉，添加无机盐，添加甜味剂，调节pH 值6.5~7.0，115℃灭菌60分钟，得到无菌铁皮石斛原球茎提取物。
（3）一次发酵：当无菌铁皮石斛原球茎提取物温度降至35-40℃时，接种预培养的体积百分比为2%的纳豆芽孢杆菌，37℃有氧发酵48小时，为铁皮石斛原球茎一次发酵液。
（4）二次发酵：向铁皮石斛原球茎一次发酵液中接种预培养的体积百分比为1%的一种双歧杆菌菌液，常规培养约3~10小时后，再次接种预培养的体积百分比各为0.5%的一种乳杆菌和嗜热链球菌菌液，继续发酵20~24小时。当pH值降至4.1~4.2时，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH值降至3.9，结束发酵，即得到铁皮石斛原球茎二次发酵液。
（5）调配、灭活：将（4）中铁皮石斛原球茎二次发酵液过管式离心机过滤、离心，得离心液；离心液中添加聚葡萄糖、低聚果糖浆（G 55L），搅匀溶解；115℃左右灭菌30分钟后，得益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物。
本发明的再一个目的是提供益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物在制备提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、降血脂、降血压，调节肠道菌群平衡，改善胃肠功能的保健品或饮品中的应用。可将本发明的多株益生菌发酵铁皮石斛原球茎或其上清液，按照已知的常规方法，添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他功能成份或其混合物，如西洋参、玉竹、五味子等，配制成适于口服的合剂、乳剂等。
也可将本发明的多株益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物通过适当的干燥方法，制得固体粉末，添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他功能成份或混合物，如西洋参、玉竹、五味子等，配制成适于口服的胶囊、片剂、颗粒剂等剂型。
本发明具有以下优点：
1、本发明对铁皮石斛原球茎粉碎后进行高压、高温提取，大大增加了原料有效成分的提取率。
2、本发明将铁皮石斛原球茎粉直接作为益生菌发酵培养基，经高压、高温提取其有效成分，带原料渣进行发酵，提高了铁皮石斛原球茎的利用率，优化了工艺流程。
3、本发明模拟人体肠道环境，利用多株益生菌进行分批发酵，使铁皮石斛原球茎的有效成分变为易于被肠道吸收的活性物质，提高了利用率及功效，减少了人体肠道负担。
4、利用铁皮石斛原球茎为益生菌生长提供充足的营养，益生菌亦使铁皮石斛原球茎的效用得到提高。
5、本发明为铁皮石斛原球茎产品开发及推广，提供了新思路。
6、本组合物所加甜味剂为塔格糖，其甜度为蔗糖的92%，热量为蔗糖的1/3，既满足了饮品甜度的要求，又符合现代人对饮品低热量的需求。
7、本组合物中加入不被人体吸收的水溶性膳食纤维聚葡萄糖和低聚果糖，口感酸甜适口，状态稳定，可极大地改善人体肠道环境。
8、本组合物未添加任何防腐剂，经高温灭菌、无菌灌装，保质期长，绿色安全、饮用方便。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1：
一种益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物的制备，具体方法如下：
取干燥铁皮石斛原球茎，粉碎过60目筛，按重量g/体积ml比1%取铁皮石斛原球茎粉加蒸馏水浸泡30分钟；
向浸泡液中加入葡萄糖0.7%（重量g/体积ml）、蛋白胨0.4%（重量g/体积ml）、酵母膏0.13%（重量g/体积ml）、酵母粉0.08%（重量g/体积ml）、无机盐（K2HPO4•3H2O 0.1g/100ml、KH2PO4 0.1g/100ml、FeSO4•7H2O 5.0mg/100ml、ZnSO4•7H2O 4.4mg/100ml、MgSO4•7H2O 25mg/100ml）、塔格糖3.0%（重量g/体积ml）和三氯蔗糖0.005%（重量g/体积ml）。调节pH 6.5~7.0，115℃灭菌60分钟，得到无菌铁皮石斛原球茎提取物；
当无菌铁皮石斛原球茎提取物温度降至37℃时，接种预培养的体积百分比为2%的纳豆芽孢杆菌，37℃有氧发酵48小时，得到铁皮石斛原球茎一次发酵液；
向铁皮石斛原球茎一次发酵液中接入预培养好的短双歧杆菌（AS 1.2213）菌液，接种量为1%（体积/体积）。37℃发酵6小时后再接入预培养的植物乳杆菌（AS 1.19）菌液和嗜热链球菌（CGMCC 1.2471）菌液，接种量均为0.5%（体积/体积）。37℃继续发酵22小时，pH值降至4.15，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH降至3.9，结束发酵，即得到铁皮石斛原球茎二次发酵液。
将铁皮石斛原球茎二次发酵液过管式离心机离心，得离心液。向离心液中加入聚葡萄糖2%（重量g/体积ml）、低聚果糖浆（G 55L）0.7%（重量g/体积ml），搅匀溶解，得半成品。将半成品进行高压灭菌，115℃灭菌30分钟后，于无菌条件下灌装，得益生菌发酵铁皮石斛原球茎饮品成品（规格为100ml/瓶）。
实施例2：
一种益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物的制备，具体方法如下：
取干燥铁皮石斛原球茎，粉碎过70目筛，按重量g/体积ml比2%取铁皮石斛原球茎粉加蒸馏水浸泡30分钟；
向浸泡液中加入葡萄糖0.6%（重量g/体积ml）、蛋白胨0.3%（重量g/体积ml）、酵母膏0.1%（重量g/体积ml）、酵母粉0.06%（重量g/体积ml）、无机盐（K2HPO4•3H2O 0.1g/100ml、KH2PO4 0.1g/100ml、FeSO4•7H2O 5.0mg/100ml、ZnSO4•7H2O 4.4mg/100ml、MgSO4•7H2O 25mg/100ml）、塔格糖3.0%（重量g/体积ml）和三氯蔗糖0.005%（重量g/体积ml）。调节pH 6.5~7.0，115℃灭菌60分钟，得到无菌铁皮石斛原球茎提取物；
当无菌铁皮石斛原球茎提取物温度降至35℃时，接种预培养的体积百分比为2%的纳豆芽孢杆菌，37℃有氧发酵48小时，得到铁皮石斛原球茎一次发酵液；
向铁皮石斛原球茎一次发酵液中接入预培养好的婴儿双歧杆菌（AS1.853）菌液，接种量为1%（体积/体积）。发酵7小时后再接入预培养的德氏乳杆菌（AS 1.1480）和嗜热链球菌（CGMCC 1.2471）菌液，接种量均为0.5%（体积/体积）。37℃继续发酵23小时，pH值降至4.18，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH降至3.9，结束发酵，即得到铁皮石斛原球茎二次发酵液；
将铁皮石斛原球茎二次发酵液过管式离心机离心，得离心液。向离心液中加入聚葡萄糖4%（重量g/体积ml）、低聚果糖浆（G 55L）0.6%（重量g/体积ml），搅匀溶解，得半成品。将半成品进行高压灭菌，115℃灭菌30分钟后，于无菌条件下灌装，得益生菌发酵铁皮石斛原球茎饮品成品（规格为100ml/瓶）。
实施例3：
一种益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物的制备，具体方法如下：
取干燥铁皮石斛原球茎,粉碎过80目筛，按重量g/体积ml比3%取铁皮石斛原球茎粉加蒸馏水浸泡30分钟；
向浸泡液中加入葡萄糖0.5%（重量g/体积ml）、蛋白胨0.2%（重量g/体积ml）、酵母膏0.08%（重量g/体积ml）、酵母粉0.04%（重量g/体积ml）、无机盐（K2HPO4•3H2O 0.1g/100ml、KH2PO4 0.1g/100ml、FeSO4•7H2O 5.0mg/100ml、ZnSO4•7H2O 4.4mg/100ml、MgSO4•7H2O 25mg/100ml）、塔格糖3.0%（重量g/体积ml）和三氯蔗糖0.005%（重量g/体积ml）。调节pH 6.5~7.0，115℃灭菌60分钟，得到无菌铁皮石斛原球茎提取物；
当无菌铁皮石斛原球茎提取物温度降至39℃时，接种预培养的体积百分比为2%的纳豆芽孢杆菌，37℃有氧发酵48小时，得到铁皮石斛原球茎一次发酵液；
向铁皮石斛原球茎一次发酵液中接入预培养好的两歧双歧杆菌（正常人体分离，经中国科学院微生物研究所鉴定）菌液，接种量为1%（体积/体积）。发酵8小时后再接入预培养的罗伊氏乳杆菌（ATCC 53608）和嗜热链球菌（CGMCC 1.2471）菌液，接种量均为0.5%（体积/体积）。37℃继续发酵21小时，pH值降至4.1，降低发酵温度至28℃，继续发酵至pH降至3.9，结束发酵，即得到铁皮石斛原球茎二次发酵液；
将铁皮石斛原球茎二次发酵液过管式离心机离心，得离心液。向离心液中加入聚葡萄糖3%（重量g/体积ml）、低聚果糖浆（G 55L）0.5%（重量g/体积ml），搅匀溶解，得半成品。将半成品进行高压灭菌，115℃灭菌30分钟后，于无菌条件下灌装，得益生菌发酵铁皮石斛原球茎饮品成品（规格为100ml/瓶）。
实验例1：本实验主要针对本发明物对清除自由基的效果进行测定；对照组样品为与实施例1、2、3中铁皮石斛原球茎相同浓度的高压提取物。实验所用药品及仪器均为市售；测定方法为现有常规方法，略有改进。
方法
1.1.1 益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物体外清除羟基自由基能力的测定方法：
利用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系检测·0H。向各具塞试管中分别加入0.75mmol/L邻二氮菲溶液1.0mL,0.15mo1/L pH7.4的磷酸缓冲溶液1.5mL充分混匀后,加入0.75mmol/LFeSO4溶液1.0mL,每加一管,迅速混匀。然后分别加入1mL稀释5倍的益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物,充分混匀,加水补充至总体积为5.3mL,再加入0.01%H2O2 1.0mL,在37℃保温lh,测A536,三次重复。另取两支试管为空白组1和空白组2,空白组2不加H202,以蒸馏水补充体积,同法操作。按下列公式计算抑制率,抑制率=[(A2-A1)/(A0-A1)]*100%,其中,A0为空白组2的A536值,A1为空白组1的A536值,A2为实施例的A536值。
1.1.2 益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物体外清除超氧阴离子自由基能力的测定方法：
过硫酸铵/N,N,N’,N’-四甲基乙二胺体系检测02·。向各具塞试管中分别加入A(lmol/L盐酸48.0mL,三羟甲基氨基甲烷36.69,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺0.23mL用蒸馏水定容于100mL的容量瓶中)溶液0.40mL,B(0.149过硫酸铵用蒸馏水定容于100mL的容量瓶中)溶液1.6mL,混合反应lmin后,向试管分别加入1mL稀释5倍的益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物混匀,加水补充至总体积为3.5mL,空白组以蒸馏水代替组合物溶液，操作同上，再向各管加10mmol/L盐酸羟胺0.40mL,在25℃下混合反应20min,反应后向以上各管加入17mmol/L对氨基苯磺酸2mL和7mmol/L的α-奈胺2mL,在25℃下混合反应25min,反应后的显色液用正丁醇充分摇匀,静置分层,取正丁醇相,测A530,三次重复。按下列公式计算抑制率,抑制率=[(a-b)/a]*100%,其中,a为空白组的A530值,b为对照组及实施例的A530值。
结果及结论
1.2.1 益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物体外清除羟基自由基效果：
自由基在人体内产生过多或清除过慢，会对人体产生一系列损害，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病，结果表明（表1）：实施例组的抑制率均高于60%，明显优于对照组，说明本发明组合物具有较强的除羟基自由基的能力。
表1 本发明组合物对·OH的清除作用
1.2.2益生菌发酵铁皮石斛原球茎的组合物体外清除超氧阴离子自由基效果：
结果表明（表2）：实施例组的抑制率均高于70%，明显优于对照组，说明本发明组合物具有较强的除超氧阴离子自由基的能力。
表2 本发明组合物对O2.的清除作用
实验例2：益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物体内抗肿瘤实验及对免疫功能的影响
未发酵组样品为与发酵组（实施例1、2、3）中铁皮石斛原球茎相同浓度的高压提取物；灌胃剂量为相对人体正常使用量的10倍（100ml/人/次/日），浓度按每毫升含干药材量计算，需将发酵组及未发酵组适当浓缩或稀释，每次0.2ml；昆明小鼠，体重18~22g（1个月龄），雌雄各半，由山东大学动物室提供，所用肿瘤细胞为肝癌H22；实验所用药品及仪器均为市售；测定方法为现有常规方法，略有改进。
2.1方法
体内抗肿瘤实验：在无菌条件下，取腹腔接种肝癌H22瘤株后第7天的瘤液，用显微镜计数癌细胞，然后用灭菌生理盐水将活癌细胞稀释至浓度约为1.0*107个/mL的细胞悬液。小鼠禁食给水12h后,于每只小鼠前肢右腋窝皮下注射接种0.2mL活癌细胞混悬液(正常对照组除外)。接种后次日,称鼠重,随机分为9组并编号(每组10只,雌雄各半):正常对照组、模型对照组、环磷酞胺组(Cy)、发酵组和未发酵组。实验给药方法如下:①环磷酸胺组(Cy):环磷酞胺3Omg/kg,于接种肿瘤后第一天,第三天,第五天腹腔注射给药,共3次；②正常对照组及模型对照组:灌胃给等体积水(0.2ml),连续10天,每天1次；③发酵组和未发酵组:每个实施例及对应的未发酵组均以0.2ml灌胃给药,每天1次,共给药10天。小鼠停药并禁食1天后,首先称重,体重增长量=接种给药10d后的体重-给药前的体重；随后摘眼球取血,颈椎脱臼处死小鼠,剥取瘤块,瘤块表面血污用滤纸吸干后,置于电子天平上称重,计算肿瘤生长抑制率;最后解剖出胸腺和脾脏,称重计算脏器系数。
2.2结果与结论
2.2.1益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物对小鼠肝癌H22生长的抑制
如表3所示，未发酵组和发酵组对小鼠肝癌H22生长均有不同的抑制效果，抑瘤率均随浓度的增加而增高，呈正相关，与模型对照组相比仅未发酵组1未有显著差异，其余组均有显著性差异（P＜0.05）；通过发酵组与未发酵组相比，发酵组的抑瘤率均高于相应未发酵组，说明发酵可使药效得到很大提高；Cy是临床上常规应用的抗癌化疗药物，其抑瘤率最大，达到了48.3%，但对小鼠体重增长有极显著的抑制作用，小鼠处死前，Cy组小鼠的体重增量极显著低于模型对照组的体重增量(p<0.01)，暗示Cy对小鼠有毒副作用，而实验各组小鼠的体重增量与模型对照组相比无显著性差异(p>0.05)，即对小鼠体重变化影响不大，不影响小鼠的正常生长。
表3 益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物对小鼠肝癌H22生长的抑制效果
注：*表示未发酵组、发酵组与模型对照组相比。
△表示发酵组与相应未发酵组相比。
2.2.2益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物对H22肝癌小鼠免疫器官重量的影响
胸腺和脾是机体重要的免疫器官，其重量的改变可以直观地显示小鼠免疫机能的变化。由表4可知，与模型对照相比，实验组的胸腺指数和脾指数均有一定程度的上升，同时随浓度的增加而升高，说明铁皮石斛原球茎能增强肝癌小鼠的机体免疫力，与浓度正相关；发酵组与未发酵组相比，胸腺及脾指数均有大幅提高，说明发酵后的组合物增强肝癌小鼠的机体免疫力更强。
表4 益生菌发酵铁皮石斛原球茎组合物对H22肝癌小鼠免疫器官重量的影响
注：*表示未发酵组、发酵组与模型对照组相比。
△表示发酵组与相应未发酵组相比。
由上述实验结果可知：本发明的组合物与未发酵的原料提取物相比，在清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、抗癌和提高免疫力方面，具有十分优越的效果，说明本组合物在抗氧化，防衰老，抗肿瘤方面具有较好的作用，市场前景十分广阔。