本发明属于食品发酵和生物技术，主要涉及一种水果酵素加工及其抗氧化功能的研究开发。
背景技术：
酵素参与人类生命活动的各种生理生化反应，是人体不可或缺的物质。研究表明，天然酵素具有抗氧化性能，可清除人体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。郭艳萍等研究证明葡萄酵素在天然发酵过程中，抗氧化能力与总酚的含量呈显著正相关并都出现增加的趋势。蒋增良等进一步研究蓝莓酵素在天然发酵过程中抗氧化能力变化，验证了郭艳萍的结果，dpph自由基清除能力、超氧自由基清除能力和abts自由基清除能力与总酚含量均具有显著的正相关性，且抗氧化能力更强，发酵过程中呈增加趋势。
抗氧化活性与自由基清除物质的结构、黄酮类物质苯环上的取代基和聚合度有关。有些研究已经报道具有潜在自由基清除活性的物质结构标准应该拥有：1.在不饱和碳环上有3-羟基取代基，2.在2,3-双键上有一个3-羟基取代基和碳环上有4-羟基取代基，3.苯环上有邻羟基取代并且这些羟基不被糖基化。因此，具有1和3类多酚结构物质基本具有较好抗氧化性。
郭爽等在此基础上研究酵素对小鼠的抗氧化功能，建立d-半乳糖氧化损伤小鼠模型，结果表明：酵素可显著降低脂质氧化产物丙二醛(mda)和蛋白质氧化产物蛋白质羰基的含量，显著降低氧化产物对小鼠机体的伤害；此酵素亦可显著提高抗氧化物质还原型谷胱甘肽和抗氧化物酶超氧化物歧化酶的含量，显著提高小鼠机体的抗氧化能力。因此，动物实验验证此酵素具有较高的抗氧化能力。马巧灵等建立ii型糖尿病小鼠模型，苹果酵素对血糖、甘油三酯和总胆固醇都有降低作用，因此苹果酵素对ii型糖尿病小鼠具有良好的降血糖、降血脂作用。
红树莓中可吸收的植物sod(超氧化物歧化酶)、ve含量居各种水果之首，可清除自由基，抗氧化；葡萄中含有类黄酮，具有强的抗氧化能力，但目前，将红树莓和葡萄混合制成酵素的方法尚未见报道，混合制成的酵素抗氧化性效果也未见验证。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种复合菌种发酵红树莓和葡萄酵素的方法，并验证复合酵素抗氧化性的目的。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种复合菌种发酵红树莓和葡萄酵素的方法，该方法包括以下步骤：(1)用无菌水在无菌条件下清洗红树莓和葡萄，并在榨汁机中加无菌水榨汁，红树莓、葡萄与水的质量比为1：1：2，将混合液进行超高温瞬时灭菌，温度135℃，3s；(2)将灭菌后混合液加酵母菌和乳酸菌两种菌种进行发酵处理；(3)发酵5周后，取出发酵好的酵素上清液进行调配，加入无菌白砂糖浆和蜂蜜，均质混匀，即为树莓葡萄酵素。
上述步骤2中，发酵温度为30-40℃，酵母菌和乳酸菌质量比例为1：2-2：1，混合菌种添加量为混合液的1-3wt％。
上述步骤2中，最优参数为：发酵温度40℃，酵母菌和乳酸菌质量比例1：2，混合菌种添加量3％。
上述步骤3中，无菌白砂糖浆占酵素上清液的质量分数为15％-20％；蜂蜜占酵素上清液的质量分数为5％。
本发明的优点效果如下：
因为红树莓和葡萄含有多酚和类黄酮等物质，具有较好的抗氧化性，在发酵过程中总酚含量、dpph自由基清除能力、超氧自由基清除能力和abts自由基清除能力总体呈逐渐增加趋势，因此抗氧化性相比发酵前显著增加，通过d-半乳糖构建的氧化损伤模型来考察水果酵素对小鼠机体的抗氧化功能有显著影响，说明树莓葡萄酵素具有良好的抗氧化性。
附图说明
图1是本发明总工艺路线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述。
实施例1
一种复合菌种发酵红树莓和葡萄酵素的方法，该方法包括以下步骤：(1)用无菌水在无菌条件下清洗红树莓和葡萄，并在榨汁机中加无菌水榨汁，红树莓、葡萄与水的质量比例为1：1：2，将混合液进行超高温瞬时灭菌，温度135℃，3s；(2)将灭菌后混合液加酵母菌和乳酸菌两种菌种在进行发酵处理；发酵温度40℃，酵母菌和乳酸菌质量比例1：2，混合菌种添加量3％；(3)发酵5周后，取出发酵好的酵素进行调配，加入占酵素上清液质量分数17％的无菌白砂糖浆和占酵素上清液质量分数5％的蜂蜜，均质混匀，即为树莓葡萄酵素。
实施例2
上述步骤2中，发酵温度为30℃，酵母菌和乳酸菌质量比例为1：2，混合菌种添加量1％。步骤3中，加入占酵素上清液质量分数15％的无菌白砂糖浆和占酵素上清液质量分数5％的蜂蜜，其它步骤同实施例1。
实施例3
上述步骤2中，发酵温度为40℃，酵母菌和乳酸菌质量比例为2：1，混合菌种添加量2％。步骤3中，加入占酵素上清液质量分数20％的无菌白砂糖浆和占酵素上清液质量分数5％的蜂蜜，其它步骤同实施例1。
红树莓葡萄酵素抗氧化性最优参数筛选试验如下。
1材料与方法
1.1试验原料
试验仪器与设备
1.2试验方法
1.2.1总酚含量测定100μl样品加入到45.9ml去离子水，再加入1mlfolin-ciocalteau试剂，反应3min，最后加入3ml20％的碳酸钠溶液，25℃恒温水浴振荡2h，在760nm下测定吸光度，以去离子水为参比溶液。
1.2.2dpph自由基清除能力40μl样品加入到4ml0.1mmol/ldpph-甲醇溶液中，再加入450μl50mmol/ltris-hclbuffer(7.4)，25℃下恒温水浴30min。以去离子水为参比溶液。在517nm下测定吸光度。
1.2.3还原力测定30μl样品加入到2.5ml磷酸缓冲液(0.2mol/l，ph6.6)，然后加入2.5ml1％铁氰化钾(w/v)，50℃，反应30min，再加入10％三氯乙酸(w/v)2.5ml，在3000r/min下离心10min，立即取2.5ml上清液，加入2.5ml去离子水和0.5ml0.1％三氯化铁(w/v)。以去离子水为参比溶液。在700nm下测定。吸光度值越高，还原力越强。
1.2.4超氧自由基清除能力50μl样品加入到950μl磷酸缓冲液(0.1mol/lph7.4)，然后加入1ml120μmol/lpms(用磷酸缓冲液配制)，1ml936μmol/lnadh(用磷酸缓冲液配制)和1ml300μmol/lnbt(用磷酸缓冲液配制)。在环境温度下，反应5min。以去离子水为参比溶液，在560nm下测定吸光度。
1.2.5羟基自由基清除能力135μl样品加入到1.4ml6mmol/lh2o2，然后加入0.6ml20mmol/l水杨酸钠和2ml1.5mmol/l硫酸亚铁，37℃下恒温水浴1h。以去离子水为参比溶液。在562nm下测定吸光度。羟基自由基清除能力计算按照式(1)。
1.2.6abts自由基清除能力用7mmol/labts(用5mmol/l的pbs，ph7.4配制)，加入过硫酸钾最终浓度为2.45mmol/l，在室温下黑暗放置12h-16h。使用前把abts自由基用pbs稀释成在734nm下吸光度为0.7±0.02。取10μl样品加入到5ml上述稀释液中，在30℃下，反应5min。以去离子水为参比溶液。在734nm下测定吸光度。
1.2.7取50只小鼠，适应性饲养3d后，随机分为空白对照组(10只)和d-半乳糖组(40只)。其中d-半乳糖组颈背部注射400mg/kgd-半乳糖，注射剂量为0.1ml/10g，每日1次，连续造模6周后，将d-半乳糖组随即分为一个模型对照组和低、中、高三个受试样品剂量组，其中低、中、高三个剂量组每天灌胃给予树莓葡萄酵素，灌胃剂量分别为10ml/kg，20ml/kg，30ml/kg，相当于人体推荐量口服剂量60ml/(人·d)的10倍、20倍、30倍，空白对照组和模型组经口灌胃给予生理盐水20ml/kg。各组动物每天灌胃1次，连续灌胃30d，每3d称重一次，按体重变化调整灌胃剂量。在灌胃给予受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量d-半乳糖颈背部皮下注射。
1.2.8测定丙二醛(mda)、蛋白质羰基、超氧化物歧化酶(sod)、还原型谷胱甘肽(gsh)小鼠末次给药1h后处死动物，取血清和肝脏，分别根据试剂盒方法进行测定血清中脂质氧化产物含量、还原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力，肝脏中蛋白质羰基含量。
2试验结果与讨论
2.1发酵温度对抗氧化性的影响见表1；由表1可知，随着发酵温度增加，树莓葡萄酵素的总酚含量、dpph清除率、羟自由基清除率、超氧自由基清除率、abts自由基清除率、还原力都呈现增加趋势。发酵温度升高，菌种的活性增加，并且繁殖数量加快，将大分子多酚和类黄酮物质分解成小分子，增加抗氧化指标，使酵素的抗氧化性增强。
2.2酵母菌与乳酸菌比例对抗氧化性的影响见表2；由表2可知，随着乳酸菌与酵母菌比例增加，树莓葡萄酵素dpph清除率、羟自由基清除率、超氧自由基清除率、abts自由基清除率、还原力都呈现增加趋势。乳酸菌比例升高，能将大分子多酚和类黄酮物质分解成小分子的数量增加，增大抗氧化指标，使酵素的抗氧化性增强。
2.3混合菌种添加量对抗氧化性的影响见表3；由表3可知，随着混合菌种添加量增加，树莓葡萄酵素总酚含量、dpph清除率、羟自由基清除率、超氧自由基清除率、abts自由基清除率、还原力都呈现增加趋势。发酵菌种数量增加，发酵过程中大分子多酚和类黄酮物质分解成小分子的加快，增大抗氧化指标，使酵素的抗氧化性增强。
2.4树莓葡萄酵素抗氧化性动物试验
2.4.1酵素对动物试验模型抗氧化性指标影响见表4；由表4可知，丙二醛和蛋白质羰基含量两组指标中，模型组高于空白组，说明d-半乳糖氧化损伤小鼠模型建立成功。并且丙二醛和蛋白质羰基指标中低剂量组、中剂量组和高剂量组低于模型组，说明树莓葡萄酵素可显著降低小鼠血清中脂质过氧化物丙二醛(mda)和蛋白质氧化产物蛋白质羰基的含量，减少d-半乳糖对小鼠的氧化损伤。还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶两组指标中，高、中、低剂量组都高于模型组，表明树莓葡萄酵素可提高小鼠血清中还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶(sod)含量，减少d-半乳糖对小鼠的氧化损伤。
3结论：本试验研究红树莓葡萄酵素加工及其抗氧化性。红树莓葡萄酵素加工参数：红树莓、葡萄与水质量比1：1：2，发酵温度40℃，发酵时间5周，酵母菌和乳酸菌质量比例1：2，混合菌种添加量3％。在酵素发酵过程中其抗氧化指标逐渐增加，抗氧化性增强。通过动物试验验证，树莓葡萄酵素能够增加小鼠的还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶，降低丙二醛和蛋白质羰基含量，减小小鼠的氧化损伤。
表1发酵温度对抗氧化性的影响
表2酵母菌与乳酸菌比例对抗氧化性的影响
表3混合菌种添加量对抗氧化性的影响
表4酵素对动物试验模型抗氧化性指标影响