一种栅藻水提取物及其制备方法与应用与流程

本发明属于海洋生物技术领域，尤其涉及一种栅藻水提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

微藻是指在显微镜下才能辨别其形态的微小的藻群，是水体生态系统中主要的初级生产者。微藻具有极大的生物多样性和遗传多样性，可以适应各种类型的环境条件，通常以单细胞、多细胞群体或细长的丝状形式存在，在生物圈内分布广泛。地球上大约存在200000～800000种不同门类的微藻，其中约35000种已有描述，但目前仅有一小部分微藻在科学研究中有涉及，而在生产实践中得到开发和应用则更少。

微藻具有营养丰富，具有极大的生物多样性和遗传多样性，不占用耕地，生物量大，环境适应能力强，生长周期短，能够利用太阳能、二氧化碳和水进行光合自养，光合效率高等特点。随着社会和科技的进步，全球性食品、资源和能源短缺压力日益增加，微藻资源的研究成为了研究热点。但目前大部分微藻的应用研究都集中在高效产油方面，在医药、保健食品方面的应用研究较少，且主要集中在螺旋藻、小球藻、盐生杜氏藻和紫球藻等几种常见的微藻，其他微藻在医药、保健食品方面的应用研究则相对较少报道。

栅藻，又称栅列藻，是绿藻门绿球藻目栅藻科的一属，通常由4～8个细胞或16～32个细胞组成定型群体，极少为单细胞。细胞常为椭圆形或纺锤形，以长轴排成1～2列或多列。栅藻是淡水中常见的浮游藻类，极喜在营养丰富的静水中繁殖，繁殖迅速，适应性强，自身合成油脂能力强，许多种类对有机污染物具有较强的耐性，栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，如利用有机污水氧化塘养鱼，可获高产，大量繁殖的藻体也可作家禽的饲料。但是目前对栅藻的研究及应用主要集中在污水处理，生物能源和家禽饲料等方面，对其抗氧化方面的生物活性研究则鲜有报道。因此，开发栅藻作为保健食品具有很大的应用前景。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种栅藻水提取物。本发明提供的栅藻水提取物是通过将新鲜的栅藻湿藻反复冻融，离心去上清；取沉淀加乙醇进行超声提取，离心去上清；取沉淀，用水洗涤后加水进行加热提取制得，具有显著的抗氧化和抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。

本发明的技术方案将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

一种栅藻水提取物，其制备方法包括如下步骤：

s1、取新鲜的栅藻湿藻，在温度为-20℃～-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3～5次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；上清液即为栅藻胞内液；

s2、向步骤s1所述的沉淀中加入体积分数为70％～99％的乙醇超声提取2～4次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，即得栅藻乙醇提取物；

s3、用一级水洗涤步骤s2所述的沉淀1～3次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，去上清液，向沉淀中加入一级水在温度为70℃～100℃的条件下提取3～5次，每次30～60min，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取上清液，即得栅藻水提取物。

优选地，步骤s2中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入乙醇进行超声提取。

优选地，步骤s2中超声提取的频率为35～40khz，温度为4℃。

优选地，步骤s2中每次超声提取的时间为10～30min。

优选地，步骤s3中按湿藻与一级水的固液比1g/ml加入一级水进行加热提取。

本发明所述栅藻(scenedesmussp.)由中国科学院水生生物研究所提供，其在中国科学院淡水藻种库中的编号为fachb-16。

本发明发明人在对微藻进行研究的过程中，进行了大量的试验，意外发现不仅栅藻胞内液和栅藻乙醇提取物具有显著的抗氧化和抗衰老作用，提取了栅藻胞内液和栅藻乙醇提取物后的残渣加水进行加热提取得到的栅藻水提取物同样具有显著的抗氧化和抗衰老作用，且效果更为显著。

在整体动物水平上以氧化应激模型及衰老相关模型进行试验，试验结果表明本发明提供的栅藻水提取物能够显著延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率，且栅藻水提取物的终浓度为80mga/ml时的效果显著优于终浓度为40mga/ml、120mga/ml时的效果。栅藻水提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响试验的试验结果表明，本发明提供的栅藻水提取物能促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)的水平。本发明提供的栅藻水提取物具有显著的抗氧化和抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。

本发明栅藻水提取物可单独或与其他活性成分合用，作为唯一或主要活性成分应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品，所述保健食品和药品的剂型优选为片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。

本发明所述的抗氧化、抗衰老作用是指对以病理或生理条件下因发生氧化应激反应所产生的变化为主要特征的衰老及衰老相关疾病的防治作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的栅藻水提取物可以促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)水平，具有显著的抗氧化作用。

(2)本发明提供的栅藻水提取物可以延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率，具有显著的抗衰老和抗氧化作用。

(3)本发明提供的栅藻水提取物的制备方法具有周期短，有机溶剂消耗少，工艺简单，安全无毒，稳定高效等特点，适合工业化生产。

附图说明

图1栅藻水提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响。

图2栅藻水提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响。

图3栅藻胞内液对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响。

图4栅藻乙醇提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例中，栅藻由中国科学院水生生物研究所提供，其在中国科学院淡水藻种库中的编号为fachb-16。

sbasal溶液：称取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于试剂瓶中，加入750ml去离子水，完全溶解后定容至1l，灭菌30min，冷却至40-50℃备用。

smedium溶液：取1l灭菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml胆固醇乙醇溶液，边加变振摇，使其充分溶解(溶液由无色透明转为微乳白透明，无明显沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m柠檬酸钾溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常温放置备用。

实施例1栅藻水提取物的制备

s1、取新鲜的栅藻湿藻，在温度为-20℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融5次，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为80％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为30min，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s3、用一级水洗涤步骤s2所述的沉淀2次，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，去上清液，向沉淀中按湿藻与一级水的固液比1g/ml加入一级水在温度为100℃的条件下提取4次，每次45min，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液，加一级水调节其相对于栅藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示栅藻湿藻)，即得栅藻水提取物。

此外，取步骤s1离心后分离得到的上清液，加一级水调节其相对于栅藻(湿藻)重量的浓度为2ga/ml(a表示栅藻湿藻)，即得栅藻胞内液。

取步骤s2离心后分离得到的上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于栅藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示栅藻湿藻)，即得栅藻乙醇提取物。

实施例2栅藻水提取物的制备

s1、取新鲜的栅藻湿藻，在温度为-30℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融4次，在转速为10000r/min的条件下离心5min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为90％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为35khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为10000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s3、用一级水洗涤步骤s2所述的沉淀3次，在转速为10000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，去上清液，向沉淀中按湿藻与一级水的固液比1g/ml加入一级水在温度为90℃的条件下提取3次，每次30min，在转速为10000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液，加一级水调节其相对于栅藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示栅藻湿藻)，即得栅藻水提取物。

实施例3栅藻水提取物的制备

s1、取新鲜的栅藻湿藻，在温度为-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3次，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为70％的乙醇超声提取4次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s3、用一级水洗涤步骤s2所述的沉淀2次，在转速为10000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，去上清液，向沉淀中按湿藻与一级水的固液比1g/ml加入一级水在温度为70℃的条件下提取5次，每次60min，在转速为10000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液，加一级水调节其相对于栅藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示栅藻湿藻)，即得栅藻水提取物。

实施例4栅藻水提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

百草枯，学名甲基紫精，是一种强氧化剂，可诱导体内大量产生活性氧自由基(ros)，使机体处于氧化胁迫环境，进而出现早衰现象。

取实施例1制得的栅藻水提取物，按终浓度40mga/ml、80mga/ml、120mga/ml分别加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)(由美国明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传信息保藏中心提供)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图1所示。

图1结果显示，栅藻水提取物能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率，且当栅藻水提取物终浓度为80mga/ml，效果最为显著。试验结果表明本发明提供的栅藻水提取物能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例5栅藻水提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的栅藻水提取物，栅藻水提取物的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组栅藻水提取物等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，每孔加入百草枯至终浓度为2mm，继续培养48h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，向上清液中加入终浓度为50μm的dcfh-da探针(购于sigma公司，cas号：2044-85-1)溶液，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度，室温检测2h，每10min测一次。结果用f检验分析，结果如图2所示。

图2结果显示，与对照组相比，经栅藻水提取物饲喂后，秀丽隐杆线虫体内ros水平显著下降。试验结果表明本发明提供的栅藻水提取物能够促进体内ros的清除，降低体内ros水平，具有显著的抗氧化能力。

实施例6栅藻胞内液对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

取实施例1制得的栅藻胞内液，按终浓度200mga/ml、600mga/ml分别加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图3所示。

图3结果显示，栅藻胞内液能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率，且当栅藻胞内液终浓度为600mga/ml，效果最为显著。试验结果表明本发明提供的栅藻胞内液能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例7栅藻乙醇提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响

向同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)中加入终浓度为100mga/ml的实施例1制得的栅藻乙醇提取物，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养，然后每隔1天统计秀丽隐杆线虫的存活情况，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的寿命以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图4所示。

图4结果显示，与对照组相比，栅藻乙醇提取物相能够延长自然条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命。试验结果表明本发明提供的栅藻乙醇提取物具有延缓衰老进程的作用，即，具有显著的抗衰老作用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。