一种防治仔猪细菌性腹泻的中药益生菌发酵代谢产物的制备方法与流程

本发明涉及防治仔猪细菌性腹泻领域。具体涉及一种利用豆粕、玉米粉和天然抗炎中药为原料，利用多种产抗菌肽的益生菌协同发酵，获得富含多种抗菌肽和中药抗炎活性成分的益生菌代谢产物，作为饲料添加剂以防治仔猪细菌性腹泻。

背景技术：

益生菌能产生抗菌肽等抑菌活性物质，有效杀灭肠道有害微生物如大肠杆菌、沙门氏杆菌等，预防和治疗腹泻等消化道细菌性疾病。效果比较显著的益生菌有芽胞杆菌类和乳酸菌类。芽胞杆菌类中枯草芽胞杆菌有广泛的杀菌效果，地衣芽胞杆菌对一些消化道细菌性疾病有显著疗效。屎肠球菌对大肠杆菌、沙门氏杆菌等有害细菌有显著抑制作用，已广泛用于人类婴幼儿消化道疾病防治。通过多种益生菌协同发酵，获得含有不同抗菌肽的活菌制剂，可以提高益生菌防治仔猪细菌性腹泻的效果。但目前尚未见报道干酪乳杆菌、屎肠球菌和地衣芽胞杆菌的复合发酵工艺。

不同益生菌的发酵条件不同，通过益生菌协同发酵能够显著提高发酵产物的菌数和抗菌肽含量。干酪乳杆菌和屎肠球菌在发酵时具有共生作用，均为兼性厌氧，产酸，产生良好风味物质，但发酵时生长速度较慢。地衣芽胞杆菌生长速度较快，对低ph值有一定耐受，需氧，微产酸。通过在液态培养基中补充麦芽汁和番茄汁等微生物生长因子，进行干酪乳杆菌和屎肠球菌的共生培养和地衣芽胞杆菌的后续培养，使得在发酵终点时三种菌均达到对数生长期顶点并保持最佳的菌体活性。

板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶、金银花等抗炎中药也广泛用于仔猪细菌性腹泻的防治。中草药在制备过程存在高温破坏活性成分的问题。通过将这些中草药作为发酵底物进行发酵，可以提高其中活性成分的有效释放，降解不良风味物质，增加适口性。抗炎中药、活菌和抗菌肽的共同使用，既清除消化道内的有害微生物和调节肠道微生物菌群平衡，又能提高机体免疫反应和抗炎能力，是目前畜牧业在仔猪细菌性腹泻的防治领域中的重要研究方向之一。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决目前没有一种将多种产抗菌肽的益生菌与天然抗炎中药相结合防治仔猪细菌性腹泻的问题，而提供一种防治仔猪细菌性腹泻的中药益生菌发酵代谢产物的制备方法。

本发明的一种防治仔猪细菌性腹泻的中药益生菌发酵代谢产物的制备方法，它是按照以下步骤进行的：

一、发酵培养基的制备：将豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花粉碎至150目颗粒，按豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花质量比为2～2.5：5～6：0.4～0.5：0.4～0.5：0.4～0.5：0.35～0.4：0.25～0.3的比例混合获得发酵培养基干粉；

二、发酵培养基的升温灭菌：将发酵培养基干粉加水配制成质量百分浓度为10％～15％的发酵培养基；在发酵罐中原位灭菌，80～90℃恒温3.5～4h灭菌；

三、多菌协同液态发酵：将浓度为10⁹个/ml干酪乳杆菌和浓度为10⁹个/ml屎肠球菌一起接种至发酵培养基，接种量均为5％，同时添加麦芽汁和番茄汁；在培养温度37℃，培养基起始ph值为6.8～7.0的条件下培养，培养12h后接种地衣芽胞杆菌进行发酵培养，接种量为5％，培养温度37℃，培养时间12h，得发酵液；

四、固态二次发酵：将步骤三得到的发酵液按质量比为6.5～7：3～3.5的比例接种发酵培养基干粉中进行发酵，发酵培养温度为30～37℃，密闭培养，培养48～72h；

五、对步骤四培养的产物在干燥温度为45～55℃条件下进行干燥，即得到中药益生菌发酵代谢产物。

本实验室筛选鉴定发现乳酸菌中干酪乳杆菌能分泌抗菌肽，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用。

本发明包含以下有益效果：

本发明的产品活菌总数达到3×10¹⁰cfu/g，体外试验表明对大肠杆菌和沙门氏杆菌具有显著抑制作用，仔猪饲喂表明产品对仔猪细菌性腹泻治愈率达到87.6％。产品直接成本为0.7-1万元/每吨，市场售价为5-10万元/每吨。

附图说明

图1为实施例1发酵后发酵液中不同益生菌菌数的变化图；其中，a为干酪乳杆菌，b为屎肠球菌；c为地衣芽孢杆菌；

图2为实施例1固态发酵后干粉中不同益生菌菌数的变化图；其中，a为干酪乳杆菌，b为屎肠球菌；c为地衣芽孢杆菌；

图3为实施例1添加中药成分发酵后对仔猪细菌性腹泻治愈率的影响图；其中，a为中药益生菌代谢产物图，b为益生菌代谢产物图，c为中药饲喂图，d为益生菌代谢产物+中药图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种防治仔猪细菌性腹泻的中药益生菌发酵代谢产物的制备方法，它是按照以下步骤进行的：

一、发酵培养基的制备：将豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花粉碎至150目颗粒，按豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花质量比为2～2.5：5～6：0.4～0.5：0.4～0.5：0.4～0.5：0.35～0.4：0.25～0.3的比例混合获得发酵培养基干粉；

二、发酵培养基的升温灭菌：将发酵培养基干粉加水配制成质量百分浓度为10％～15％的发酵培养基；在发酵罐中原位灭菌，80～90℃恒温3.5～4h灭菌；

三、多菌协同液态发酵：将浓度为10⁹个/ml干酪乳杆菌和浓度为10⁹个/ml屎肠球菌一起接种至发酵培养基，接种量均为5％，同时添加麦芽汁和番茄汁；在培养温度37℃，培养基起始ph值为6.8～7.0的条件下培养，培养12h后接种地衣芽胞杆菌进行发酵培养，接种量为5％，培养温度37℃，培养时间12h，得发酵液；

四、固态二次发酵：将步骤三得到的发酵液按质量比为6.5～7：3～3.5的比例接种发酵培养基干粉中进行发酵，发酵培养温度为30～37℃，密闭培养，培养48～72h；

五、对步骤四培养的产物在干燥温度为45～55℃条件下进行干燥，即得到中药益生菌发酵代谢产物。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中发酵培养基干粉中的豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花质量比为2：6：0.5：0.5：0.4：0.35：0.25。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中发酵培养基干粉中的豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花质量比为2：5：0.4：0.4：0.4：0.35：0.25。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中发酵培养基干粉中的豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花质量比为2：5.5：0.45：0.45：0.45：0.4：0.3。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：将发酵培养基干粉加水配制成质量百分浓度为10％～12％的发酵培养基。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：在发酵罐中原位灭菌，80℃恒温4h灭菌。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：按麦芽汁与发酵培养基的总体积0.3～0.4％的量添加质量百分含量为10％的麦芽汁，按番茄汁与发酵培养基的总体积0.2-0.3％的量添加番茄汁。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：干酪乳杆菌和屎肠球菌为共培养，12h后再接种地衣芽胞杆菌发酵培养12h。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：将步骤三得到的发酵液按质量比为7：3的比例接种发酵培养基干粉中进行发酵。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：将步骤三得到的发酵液按质量比为6.5：3的比例接种发酵培养基干粉中进行发酵。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中发酵培养温度为30～37℃，密闭培养，培养48h。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：对步骤四培养的产物在干燥温度为45～50℃条件下进行干燥。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

一种防治仔猪细菌性腹泻的中药益生菌发酵代谢产物的制备方法，它是按照以下步骤进行的：

一、发酵培养基的制备。将豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶、金银花粉碎为150目颗粒，按豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花质量比2：6：0.5：0.5：0.4：0.35：0.25混合获得发酵培养基干粉。

二、发酵培养基的升温灭菌。发酵培养基混合于水，质量百分浓度为10％-15％。在发酵罐中原位升温灭菌，80℃恒温4h灭菌。

三、多菌协同液态发酵。将浓度为10⁹个/ml干酪乳杆菌和浓度为10⁹个/ml屎肠球菌一起接种至发酵培养基，接种量分别为5％，发酵培养基中同时添加0.3％的麦芽汁和0.2％番茄汁，培养温度37℃，培养基起始ph值为6.8-7.0。培养12h后继续接种地衣芽胞杆菌发酵培养，接种量为5％，培养温度37℃，培养12h。

四、固态二次发酵。将上述最终发酵液按比例接种发酵培养基干粉进行发酵，液态菌液和固态干粉比例为质量比7：3，培养温度37℃，密闭培养，培养48h。五、低温干燥，干燥温度45-55℃，即得到中药益生菌发酵代谢产物。

本实施例所述干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)购自台湾亚芯生物科技有限公司，屎肠球菌(enterococcusfaecium)购自台湾亚芯生物科技有限公司，地衣芽胞杆菌(bacilluslincheniformis)购自浙江京新药业股份有限公司。

本实施例的产品活菌总数达到3×10¹⁰cfu/g，体外试验表明对大肠杆菌和沙门氏杆菌具有显著抑制作用，仔猪饲喂表明产品对仔猪细菌性腹泻治愈率达到87.6％。产品直接成本为0.7-1万元/每吨，市场售价为5-10万元/每吨。

步骤一中玉米粉可由占发酵培养基质量比60％减为50％，同时补充10％的麦麸。

步骤五中低温干燥条件可以为露天自然晾干。

本实施例中发酵后发酵液中不同益生菌菌数的变化如图1所示，由图1可知，干酪乳杆菌、屎肠球菌和地衣芽胞杆菌菌属分别达到4.576×10⁹cfu/ml、6.493×10⁹cfu/ml和3.371×10⁹cfu/ml。

本实施例中固态发酵后干粉中不同益生菌菌数的变化如图2所示，固态发酵后干粉中不同益生菌菌数的变化，干酪乳杆菌、屎肠球菌和地衣芽胞杆菌菌属分别达到1.752×10¹⁰cfu/g、3.276×10¹⁰cfu/g和1.827×10¹⁰cfu/g。

本实施例添加中药成分发酵后对仔猪细菌性腹泻治愈率的影响如图3所示。本实施例中药益生菌发酵代谢产物对仔猪细菌性腹泻治愈率达到87.6％，而不添加中药的益生菌发酵代谢产物治愈率为68.1％，单纯添加中药喂饲治愈率仅为14.4％，不添加中药的益生菌发酵代谢产物结合中药喂饲治愈率为81.3％。

实施例2

一种防治仔猪细菌性腹泻的中药益生菌发酵代谢产物的制备方法，它是按照以下步骤进行的：

一、发酵培养基的制备。将豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶、金银花粉碎为150目颗粒，按豆粕、玉米粉、板蓝根、蒲公英、黄连、大青叶和金银花质量比2：5：0.4：0.4：0.4：0.35：0.25混合获得发酵培养基干粉。

二、发酵培养基的升温灭菌。发酵培养基混合于水，质量百分浓度为10％～15％。在发酵罐中原位升温灭菌，80℃恒温4h灭菌。

三、多菌协同液态发酵。将浓度为10⁹个/ml干酪乳杆菌和浓度为10⁹个/ml屎肠球菌一起接种至发酵培养基，接种量分别为5％，发酵培养基中同时添加0.3％的麦芽汁和0.2％番茄汁，培养温度37℃，培养基起始ph值为6.8-7.0。培养12h后继续接种地衣芽胞杆菌发酵培养，接种量为5％，培养温度37℃，培养12h。

四、固态二次发酵。将上述最终发酵液按比例接种发酵培养基干粉进行发酵，液态菌液和固态干粉比例为质量比7：3，培养温度37℃，密闭培养，培养48h。五、低温干燥，干燥温度45-55℃，即得到中药益生菌发酵代谢产物。

本实施例所述干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)购自台湾亚芯生物科技有限公司，屎肠球菌(enterococcusfaecium)购自台湾亚芯生物科技有限公司，地衣芽胞杆菌(bacilluslincheniformis)购自浙江京新药业股份有限公司。

本实施例的产品活菌总数达到3×10¹⁰cfu/g，体外试验表明对大肠杆菌和沙门氏杆菌具有显著抑制作用，仔猪饲喂表明产品对仔猪细菌性腹泻治愈率达到87.6％。产品直接成本为0.7-1万元/每吨，市场售价为5-10万元/每吨。

步骤一中玉米粉可由占发酵培养基质量比60％减为50％，同时补充10％的麦麸。

步骤五中低温干燥条件可以为露天自然晾干。

本实施例中发酵后发酵液中不同益生菌菌数的变化如图1所示，由图1可知，干酪乳杆菌、屎肠球菌和地衣芽胞杆菌菌属分别达到4.576×10⁹cfu/ml、6.493×10⁹cfu/ml和3.371×10⁹cfu/ml。

本实施例中固态发酵后干粉中不同益生菌菌数的变化如图2所示，固态发酵后干粉中不同益生菌菌数的变化，干酪乳杆菌、屎肠球菌和地衣芽胞杆菌菌属分别达到1.752×10¹⁰cfu/g、3.276×10¹⁰cfu/g和1.827×10¹⁰cfu/g。