本发明属于生物食品营养技术领域，具体涉及一种富硒猴头菇粉及其生产方法与其作为硒营养强化剂的用途。
背景技术：
硒是一种重要微量元素，与人体免疫力以及癌症等50多种疾病有密切关系。我国72％地区缺硒，缺硒人群达到8亿之多。人们也越来越认识到硒元素的重要性。专家预测补硒有望取代补钙成为第一大微量元素市场。现今，国人补硒方式主要通过保健品，覆盖人群极少。在食品中添加硒营养强化剂是普及补硒的必然方向和趋势。
目前《食品营养强化剂使用标准》中规定，允许添加到食品中的硒营养强化剂有7种：亚硒酸钠、硒酸钠、硒蛋白、硒化卡拉胶、甲基硒代半胱氨酸、富硒酵母、富硒食用菌。前两种是无机硒，毒性大，吸收差，在一些国家已经被禁用；3-5种是属于提取或合成产品，杂质多有机硒比率不高；第6种富硒酵母属于微生物转化硒，但需要将有机硒与无机硒分离，且仅被允许在含乳饮料中添加；富硒食用菌是最为天然、有机硒含量最高的优质硒，允许添加范围广，而其中富硒猴头菇作为我国传统名贵食用菌，被接受程度高，市场前景广阔。
专利zl201010190735.7公开了一种富硒猴头菌菇胶囊，其所得产品中硒含量为114.05±8.09mg/kg；而国标《食品营养强化剂-富硒食用菌粉》(gb1903.33-2016)中规定富硒食用菌营养强化剂总硒含量需达到180-400mg/kg，有机硒占总硒质量百分比≥98％；专利zl201010190735.7中产品远未达硒含量标准且未测定有机硒比率，不能作为硒营养强化剂。同时该专利所使用猴头菇菌种出菇时间约为3个月，出菇时间长。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种总硒含量及有机硒占比均达标且猴头菇菌种出菇周期短的富硒猴头菇粉及其生产方法与其作为硒营养强化剂的用途。
本发明的一种富硒猴头菇粉的生产方法，包括下述步骤：
1)液体菌种培养：将猴头试管菌种接种于摇瓶培养基中，摇瓶培养基成分：葡萄糖2-4％、淀粉1-3％、酵母粉1-2％、酵母浸出粉1-2％、磷酸二氢钾0.1-0.2％、硫酸镁0.1-0.2％、其余为水、ph值5-6，于培养温度26-28℃、转速160-200转/分钟下摇瓶培养5-7天；然后于发酵罐中26-28℃、装液量65-75％、通气量1:0.4-0.6v/v·min下再培养2-4天，该发酵罐培养基成分同摇瓶培养基成分；
2)菌液匀质：将步骤1)培养后的菌液在转速2000-2500转/分钟的匀质机作用下维持0.5-1.5分钟；
3)固体发酵培养：固体栽培料基础配方为：棉籽壳80-83％、麦麸15-18％、尿素1-2％、过磷酸钙1-2％，柠檬酸调节ph值5-6；向固体栽培料基础配方中加入亚硒酸钠，形成固体栽培料，再加入水，形成固体栽培培养基，然后将步骤2)所得菌液接种到固体栽培培养基中，于温度24-27℃、湿度70％-90％培养18-25天后通风出菇，出菇温度16-21℃，出菇湿度90％-95％，出菇周期4-6天；
4)富硒猴头菇粉的制备：将步骤(3)得到的富硒猴头菇干燥、粉碎，得到富硒猴头菇粉。
上述所述步骤3)中，固体栽培料中加水量为固体栽培料重量的1-2倍，菌液接种量2％-8％。
优选的，本发明的富硒猴头菇粉的生产方法，可包括下述步骤：
1)液体菌种培养：将猴头试管菌种接种于摇瓶培养基中，摇瓶培养基成分：葡萄糖3％、淀粉2％、酵母粉1％、酵母浸出粉1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％、其余为水，ph值5.5，于培养温度27℃、转速180转/分钟下摇瓶培养5-7天；然后于发酵罐中27℃、装液量70％、通气量1:0.5v/v·min下再培养2-4天，该发酵罐培养基成分同摇瓶培养基成分；
2)菌液匀质：将步骤1)培养后的菌液在转速2200-2300转/分钟的匀质机作用下维持1分钟；
3)固体发酵培养：固体栽培料基础配方为：棉籽壳82％、麦麸16％、尿素1％、过磷酸钙1％，柠檬酸调节ph值5.5；向固体栽培料基础配方中加入亚硒酸钠使亚硒酸钠含量为240mg/kg-920mg/kg，形成固体栽培料，再加入水，形成固体栽培培养基，然后将步骤2)所得菌液接种到固体栽培培养基中，于温度25℃、湿度80％-85％培养20天后通风出菇，出菇温度18-20℃，出菇湿度90％-92％，出菇周期5天；
4)富硒猴头菇粉的制备：将步骤(3)得到的富硒猴头菇干燥、粉碎，得到富硒猴头菇粉。
上述所述步骤3)中，固体栽培料中加水量为固体栽培料重量的1-1.5倍，菌液接种量4％-6％。
本发明的富硒猴头菇粉，是上述所述生产方法制备得到。
本发明所述的富硒猴头菇粉可作为硒营养强化剂应用。
其应用可以是将富硒猴头菇粉添加到调制乳粉、大米及其制品、小麦粉及其制品、杂粮粉及其制品、面包、饼干或含乳饮料食品中以补充食品中硒元素，或者将富硒猴头菇粉作为其他营养强化剂(如：硒蛋白)的生产原料。
本发明涉及的培养基、栽培料配方中物料用量百分比如无特别说明均为重量百分比。本发明所用猴头菌为现有技术中已知菌种，可从商业途径获得，其一般为斜面试管菌种，其可购自食用菌厂或研究所，如可购自合肥立新菌种厂、舒城县金大地菌种厂、安徽省微生物防治重点实验室等。
本发明通过液体菌种培养、菌液匀质、固体发酵培养、干燥粉碎四步生产得到富硒猴头菇粉，生产工序简单，其中菌液匀质采用匀质机并在特定高转速(转速2000-2500转/分钟)下维持短时间，这样即可在不破坏菌的细胞结构的情况下实现对菌球的充分打碎，菌球打碎后接种发菌点多，可使富硒猴头菇出菇时间由2-3个月降至20天左右；匀质机转速过高时间过长会对菌的细胞结构造成破坏，而转速过低则不利于菌球的充分打碎。同时，发明人实验中发现，采用常用的破碎菌球的方式如在摇瓶发酵过程中添加玻璃珠，但该法用在猴头菌摇瓶培养中却不能破碎菌球；又如在发酵罐发酵过程中采用电机搅拌，但该法用在猴头发酵罐培养中却不能实现破碎菌球。
发明人还发现，在对猴头菇进行栽培时，一般猴头菇栽培料中通常都会采用石膏粉以调节酸碱度，而本发明栽培料配方中以柠檬酸取代传统猴头菇配方中的石膏粉，从而避免了石膏粉中硫原子对硒与蛋白质结合的影响，更有利于硒的吸收。
本发明在固体栽培料中添加亚硒酸钠240mg/kg-920mg/kg，使生产所得富硒猴头菇粉的硒含量范围达到国标《食品营养强化剂-富硒食用菌粉》(gb1903.33-2016)所规定的180mg/kg-400mg/kg；且有机硒比率大于99.5％；本发明方法生产的富硒猴头菇粉中硒易被吸收，可显著提高小鼠谷胱甘肽过氧化物酶活性。硒是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，该酶是血硒含量重要标志物。
本发明中菌种配合其液体菌种生产工艺，出菇时间缩短至20天左右；本发明所得产品硒含量高，可用于含乳饮料、大米及其制品、小麦粉及其制品、杂粮粉及其制品、面包、饼干等常规食品中作为营养强化剂，更扩展了其应用广度，通过硒营养强化剂的使用有效实现了国民补硒的普及。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1
本发明富硒猴头菇粉的生产方法，包括下述步骤：
1)液体菌种培养：将半支猴头菌斜面试管菌种(购自安徽省微生物防治重点实验室，菌株编号rcef6411)接种于摇瓶培养基中，摇瓶培养基成分：葡萄糖3％、淀粉2％、酵母粉1％、酵母浸出粉1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％、其余为水、ph值5.5，于培养温度27℃、转速180转/分钟下摇瓶培养6天，然后于发酵罐中27℃、装液量70％(v/v)、通气量1:0.5v/v·min下再培养3天，培养基成分同摇瓶培养基成分；
2)菌液匀质：将步骤1)培养后的菌液在转速2200转/分钟的匀质机作用下维持1分钟；
3)固体发酵培养：固体栽培料基础配方为：棉籽壳82％、麦麸16％、尿素1％、过磷酸钙1％，柠檬酸调节ph值5.5；向固体栽培料基础配方中加入亚硒酸钠使亚硒酸钠含量为240mg/kg-920mg/kg，形成固体栽培料，再加入1.3倍量水，形成固体栽培培养基，然后将步骤2)所得菌液接种到固体栽培培养基中，接种量5％，于温度25℃、湿度80％培养20天后通风出菇，出菇温度19℃，出菇湿度90％，长出猴头菇为正常猴头状菇型，菌丝长度1厘米左右采摘，出菇周期5天；
4)富硒猴头菇粉的制备：将步骤(3)得到的富硒猴头菇干燥、粉碎，得到富硒猴头菇粉。最终所得产品中总硒含量为180.6～396.4mg/kg，有机硒比率为99.6％～99.8％。
表1
对比例1
将半支猴头菌斜面试管菌种(购自合肥立新菌种厂)接种于摇瓶培养基中，培养基成分为pda培养基；于培养温度27℃、转速180转/分钟下摇瓶培养6天，然后于发酵罐中27℃、装液量70％(v/v)、通气量1:0.5v/v·min下再培养3天，培养基成分同摇瓶培养基成分；使用常用猴头菇栽培料木屑42％、棉籽皮42％、麦麸14％、石膏粉1％、蔗糖1％，向固体栽培料基础配方中加入亚硒酸钠使亚硒酸钠含量为240mg/kg-920mg/kg，形成固体栽培料，再加入1.3倍量水，形成固体栽培培养基，然后将液体发酵菌液接种到固体栽培培养基中，接种量5％，于温度25℃、湿度80％培养20天后通风出菇，出菇温度19℃，出菇湿度90％，生产所得富硒猴头菇粉硒含量范围134.23mg/kg(栽培料中亚硒酸钠添加量240mg/kg)-212.24mg/kg(栽培料中亚硒酸钠添加量400mg/kg)；但当固体栽培料中添加亚硒酸钠量大于400mg/kg时，长出猴头菇为畸形菇(珊瑚菇，并泛红)，出菇周期在45-60天。
对比例2
将半支猴头菌斜面试管菌种(购自舒城县金大地菌种厂)接种于摇瓶培养基中，培养基成分：葡萄糖2％、麸皮5％、蛋白胨2％、酵母粉1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％、其余为水、ph值5.5；于培养温度27℃、转速180转/分钟下摇瓶培养6天，然后于发酵罐中27℃、装液量70％(v/v)、通气量1:0.5v/v·min下再培养3天，培养基成分同摇瓶培养基成分；使用常用猴头菇栽培料：玉米芯86％、麦麸11％、石膏粉2％、磷肥1％，向固体栽培料基础配方中加入亚硒酸钠使亚硒酸钠含量为240mg/kg-920mg/kg，形成固体栽培料，再加入1.3倍量水，形成固体栽培培养基，然后将液体发酵菌液接种到固体栽培培养基中，接种量5％，于温度25℃、湿度80％培养20天后通风出菇，出菇温度19℃，出菇湿度90％，生产所得富硒猴头菇粉硒含量范围120.81mg/kg(栽培料中亚硒酸钠添加量240mg/kg)-243.42mg/kg(栽培料中亚硒酸钠添加量450mg/kg)；但当固体栽培料中添加亚硒酸钠量大于450mg/kg时，长出猴头菇为畸形菇(珊瑚菇，并泛红)或不出菇，出菇周期在50-70天。
对比例3(固体栽培料中仍采用传统的石膏粉)
步骤3)中，固体栽培料基础配方为：棉籽壳82％、麦麸15％、尿素1％、过磷酸钙1％，石膏粉1％，ph值5.5，其他工艺同实施例1，最终所得猴头菇产品中总硒含量为167.4～323.6mg/kg，有机硒比率为99.2％～99.7％。石膏粉中硫原子可能影响了猴头菇对硒的吸收。
应用例
检测指标谷胱甘肽过氧化物酶是硒进入机体后参与构成的重要化合物，所以也是人体吸收硒的重要指标。
1材料与方法
4～5周龄昆明种小白鼠，体重18～22g，由安徽医科大学提供。选择60只20g左右健康的昆明种小白鼠，随机分为6组；1组为对照组，饲喂低硒基础日粮；2组为亚硒酸钠组，在低硒基础日粮基础上每日灌胃一定量的亚硒酸钠(硒含量相当于第5组中每日灌胃干粉的硒含量)；3组为普通猴头菇组，在低硒基础日粮基础上每日灌胃一定量的市售普通猴头菇干粉(相当于第5组中每日灌胃干粉量)；4～6组为低、中、高富硒猴头菇粉组，每日灌胃给药相当于人推荐剂量10倍、30倍、100倍(成人每日每天0.05克)。30日后断髓处死小鼠。市售普通猴头菇干粉购自上海百信生物科技有限公司；富硒猴头菇粉为本发明产品，硒含量255.4mg/kg，有机硒比率99.7％。
经小白鼠眼底放血，采集血样，用事先准备好的肝素钠抗凝(50u/ml全血)，经3500rpm，离心10min，分离血浆，4℃冷藏保存，待测。
试验过程中小白鼠均自由采食、饮水，笼养，房间内通风良好，饲养室温度控制在20±3℃，相对湿度为30％～73％。每天观察记录小白鼠的生长发育情况及其它异常情况。
1.1基础日粮
原料组成：小麦51％，大豆粕15％，蛋清粉8％，植物油3％，小麦麸13％，纤维素3％，碳酸钙2.5％，磷酸二氢钠1.5％，赖氨酸1％，七水硫酸镁1％，微量元素添加剂(不含硒化合物)0.5％，维生素0.5％，总计100％。所述百分比为重量比。
营养成分：粗蛋白21.488％，粗脂肪4.642％，粗纤维5.288％，粗灰分2.572％，钙1.111％，磷0.717％，钙：磷1.548，赖氨酸1.364％，蛋氨酸+胱氨酸0.483％，镁0.258％，钾0.686％，钠0.686％，铁(添加量)120.434mg/kg，锰(添加量)76.437mg/kg，铜(添加量)10.09mg/kg，锌(添加量)35.718mg/kg，碘(添加量)0.535mg/kg，硒(基础日粮计算值)0.012mg/kg。
1.2检测指标与方法
gsh-px活性的检测：gsh-px的活性以催化gsh的反应速度表示。具体步骤按照试剂盒(购自南京建成生物有限公司)说明进行。
1.3结果
不同水平富硒猴头菇粉对小鼠gxh-px活性的影响
表2富硒猴头菇粉对小鼠肝脏及血浆谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响
由表2可以看出，4、5、6组血浆及肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活力均极显著高于1、2、3组(p<0.01)，2、3组血浆及肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活力也极显著高于1组(p<0.01)。可见富硒猴头菇粉处理组小鼠血浆及肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活力较对照有较大提高，亚硒酸钠及普通猴头菇干粉处理组也有一定提高，但效果不如富硒猴头菇粉处理组。且随着富硒猴头菇粉灌胃量的提高谷胱甘肽过氧化物酶活力提高。