本发明涉及一种生产葡萄酵素的工艺，属于微生物发酵技术领域。
背景技术：
酵素，传统的说法是“酶”，按照2016年10月1日实施的中国生物发酵产业协会团体标准t/cbfia08001-2016《酵素产品分类导则》，酵素又是“以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品”，生物活性成分包括多糖类、寡糖类、蛋白质及多肽、氨基酸类、维生素类等。根据选用食材的不同，按照食用酵素生产规范，所得食用酵素包含一种或多种独特的保健功效，包括：调整免疫应答、降血压、整肠、消除便秘、减肥、抗过敏等。因此酵素作为一种独特保健品，有着巨大的养生前景。
在众多酵素产品中，水果酵素一直占有非常大的比重，水果酵素是以一种或多种水果为原料，把糖，蜂蜜，水等按一定比例混合之后密封放置，经发酵形成的风味饮品。水果酵素中不仅含有大量的维生素、酶、矿物质，并且还含有大量的次级代谢产物。根据国家统计局公布的数据，2016年我国水果产量为28319万吨，其中苹果、柑橘、葡萄、香蕉以及梨占据了产量的前5位。对于这些水果的利用，除了直接食用外，还将其加工成饮料，酒，罐头等各种制品，以及通过冷藏的方法，提高水果的保存时间。但是上述方法对场地和设备有一定的要求，不便于对农产品的就地加工，因此我国每年都存在大量水果的变质浪费问题。如果将一部分水果采取合适的方法，加工成水果酵素，不但可以极大缓解水果的库存压力，还能增加产品的附加值。
当前环境下，葡萄酒越来越受到众人的喜爱和追捧，根据我国最新的葡萄酒标准gb15037-2006，葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，酒精度不低于7.0％的酒精饮品。葡萄酒历史源远流长，生产及酿造工艺都非常成熟，主要是以酿酒葡萄为原料，以酵母菌为主要菌种，利用微生物糖酵解等生化途径，将葡萄中以葡萄糖为主的糖类，转化成乙醇的过程。目前用于酿酒的葡萄，主要有赤霞珠(cabernetsauvignon)，品利珠(cabernetfranc)等酿酒葡萄，而市场上比较常见的鲜食葡萄，比如巨峰，夏黑等，由于果皮薄，含糖量低，不能作为酿酒的主要原料。但是，目前国内的鲜食葡萄无论是种植面积还是总产量，都要高于酿酒葡萄，而且鲜食葡萄成熟后，保质期较短，极易腐烂变质，将鲜食葡萄用于葡萄酵素的生产，是解决该问题的途径之一。
中国专利文献cn105919101a(申请号201610339302.0)公开了一种刺葡萄酵素饮品及其酿造工艺，所使用的原料为刺葡萄，发酵时间188～240天，菌种为葡萄自带菌种中筛选的多种发酵菌，酒精含量为1～6％。中国专利文献cn105286006a(申请号201510577382.9)公开了一种纯葡萄精华酵素及其生产方法，其原料包括新鲜葡萄、脱脂葡萄皮渣粉、葡萄酒、果葡糖浆、白砂糖、低聚木糖、l-阿拉伯糖、糖醇和适量益生菌，发酵时间90天以上。目前多数葡萄酵素采用自然发酵法，这种方法发酵周期长、发酵条件无法精确控制，容易造成有害微生物和有害代谢产物含量超标；或者利用液体深层发酵技术，通过添加符合食品安全要求的微生物(比如乳酸菌等)来生产葡萄酵素，由于整个发酵环节处于可控状态，避免上述自然发酵工艺的诸多缺点，但也会面临酵素产品酒精含量超标的问题，根据2017年6月1日实施的中国生物发酵产业协会团体标准t/cbfia08003-2017，食用酵素的乙醇应当不高于0.5％。
本发明针对以上问题，利用现有的葡萄酒生产设备，以鲜食葡萄和酿酒葡萄为原料，根据葡萄含糖量多的特点，通过优化发酵过程，开发葡萄酵素生产新工艺。而且与传统的酵素生产工艺相比，发酵过程可调控，无需额外添加糖，并且能够进行工业化大生产。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种生产葡萄酵素的工艺。
本发明技术方案如下：
一种生产葡萄酵素的工艺，包括步骤如下：
a、对葡萄进行筛选、除梗、破碎；
b、初步发酵
将步骤a破碎后的葡萄浆泵入发酵罐，添加0.5～1.5g/l的酒石酸调节ph≤3.7，并添加果胶酶，添加量为15～25mg/l；将重量份45～55的菊粉、重量份35～45的乳糖、重量份10～30的纳他霉素混合均匀，配制成发酵调节剂，以0.1～0.2％的比例加入到的葡萄浆中，混合均匀，在20～30℃厌氧条件下发酵5～7d；
c、二次发酵
接种菌种进行种子培养，培养至菌种浓度为1.0～9.0×108cfu/ml，将该菌液以体积分数8～15％的比例加入到步骤b的初步发酵醪液中，在20～30℃厌氧条件下，二次发酵28～35d；
d、发酵结束后的过滤、灌装及低温保存。
步骤a所述的葡萄为酿酒葡萄或/和鲜食葡萄。
步骤a所述的葡萄破碎，其特征在于，避免将葡萄籽打碎。
根据本发明优选的，步骤b中将重量份50的菊粉、重量份40的乳糖、重量份15的纳他霉素混合均匀，配制成发酵调节剂。
步骤b所述的发酵调节剂的添加比例为质量体积比，单位是g/l。
步骤c所述的菌种为植物乳酸杆菌hx1，2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno.m2017522。
步骤d中所述的过滤时发酵液的ph值、总糖、总酸、乙醇、波美度指标稳定。
一株植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)hx1，2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno.m2017522。
有益效果
本发明以酿酒葡萄或/和鲜食葡萄为原料，优化发酵工艺，生产非酒精葡萄发酵饮料—葡萄酵素。通过添加发酵调节剂，抑制不利于酵素生产的霉菌、酵母菌等相关菌种的繁殖，促进有利于酵素生产的乳酸菌等相关菌种的生长；通过添加植物乳酸杆菌hx1，加速酵素发酵速度，减少葡萄酵素生产周期，同时还有利于人体肠道健康。通过本发明中的工艺生产的葡萄酵素产品，发酵过程和发酵产物均符合食品生产以及卫生安全的相关规定，可为提高葡萄，尤其是鲜食葡萄的综合利用，开辟新的途径。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地说明本发明的内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护权利要求范围不限于所提供的案例。
材料与设备
葡萄：市场销售的各种鲜食葡萄(比如玫瑰香，巨峰等)以及酿酒葡萄(比如赤霞珠)
酒石酸：l-酒石酸，法国louis
果胶酶：ex酿酒果胶酶，法国lallemand
菊粉：比利时beneooraftis.a
乳糖：珠海市泛海生物技术有限公司
纳他霉素：浙江新银象生物工程有限公司
发酵罐：500l葡萄酒不锈钢厌氧中试发酵罐
植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)hx1，2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno.m2017522。
实施例1
利用葡萄酒生产设备生产葡萄酵素
(1)葡萄筛选、除梗、破碎，破碎时避免将葡萄籽打碎，然后将400l葡萄浆泵入发酵罐；
(2)调酸：取葡萄汁测定ph值，视情况添加酒石酸调酸：若ph≤3.7不需要调酸，若ph>3.7添加1g/l的酒石酸调酸；
(3)添加果胶酶：添加量为20mg/l，共8g；
(4)添加发酵调节剂：将菊粉、乳糖、纳他霉素按重量份50、40、15进行混合，配置成发酵调节剂，并以质量体积分数0.1％(g/l)的比例加入到的葡萄浆中，混合均匀；
(6)控制温度为28℃，厌氧条件下，自然发酵7d，每隔2-3d，利用果浆泵，从发酵罐底部抽出部分发酵液，再从发酵罐上部泵入，循环量为发酵液总量的一半，记为一次打循环；
(7)添加植物乳酸杆菌hx1：将植物乳酸杆菌hx1进行种子培养，培养至菌种浓度为3.6×108cfu/ml，将该菌液以体积分数10％的比例加入到步骤(6)的初步发酵醪液中；
(8)控制温度为28℃，继续厌氧发酵，每3-5d打循环一次；
(9)发酵过程中，控温并定期监测波美度，以及测定发酵液的ph值、总糖、总酸、乙醇；
(10)发酵30d后，进行常规过滤、装瓶、包装，10℃低温保存。
实施例2
酵素相关指标的检测
(1)ph值：按gb/t10468规定的方法测定；
(1)总糖：参考进出口行业标准sn/t4260《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》的方法测定；
(2)总酸：参考国标gb/t12456《食品中总酸的测定》的方法测定；
(3)乙醇：参考国标gb5009.225-2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的方法测定。
对比例1
如实施例1所述的利用葡萄酒生产设备生产葡萄酵素方法，不同之处在于，步骤(4)中不添加发酵调节剂。
将实施1和对比例1的方法进行对比发现，采取对比例1方法，发酵出的产物含有乙醇，浓度达到4％以上，造成乙醇产生的原因主要是在葡萄原料中存在的野生酵母，在发酵初期由于周围环境含糖较高，其数量迅速增长，同时酵母菌会不断利用环境中的糖类，发酵成乙醇。根据酵素的质量标准要求，酵素产品的乙醇含量应该低于0.5％，所以对比例1的方法不能用于生产葡萄酵素。
对比例2
如实施例1所述的利用葡萄酒生产设备生产葡萄酵素方法，不同之处在于，步骤(4)将菊粉、乳糖、纳他霉素按重量份30、20、5进行混合，配置成发酵调节剂，并以质量体积分数0.1％(g/l)的比例加入到的葡萄浆中。
将实施1和对比例2的方法进行对比发现，采取对比例2方法，即步骤(4)将菊粉、乳糖、纳他霉素按重量份30、20、5进行混合，配置成发酵调节剂，经7d发酵后，发现发酵液中的出现了丝状真菌，说明该重量份混合的发酵调节剂并不能完全抑制丝状真菌的生长。
对比例3
如实施例1所述的利用葡萄酒生产设备生产葡萄酵素方法，不同之处在于，步骤(4)将菊粉、乳糖、纳他霉素按重量份65、55、35进行混合，配置成发酵调节剂，并以质量体积分数0.1％(g/l)的比例加入到的葡萄浆中。
将实施例1和对比例3的方法进行对比发现，采取对比例3方法，即步骤(4)将菊粉、乳糖、纳他霉素按重量份65、55、35进行混合，配置成发酵调节剂，达到了和实施1中相同的效果，即能抑制酵母菌，丝状真菌的生长，但是由于纳他霉素的使用量超过了国标gb2760-2011规定的用量(<0.3g/kg)，而且菊粉、乳糖的量的增加，也造成了成本的增加。
对比例4
如实施例1所述的利用葡萄酒生产设备生产葡萄酵素方法，不同之处在于，步骤(7)中不添加植物乳酸杆菌hx1，而是添加了保加利亚乳酸杆菌。
将实施例1和对比例4的方法进行对比发现，采取对比例4方法，即添加保加利亚乳酸杆菌后，与实施例1中添加的植物乳酸杆菌hx1相比，在相同条件下经30d发酵后，其发酵产物如下表：
上表中的各项数据可见，经过同样30d发酵后，两种菌都对以葡萄汁中的糖类为主要碳源进行了发酵，由于是厌氧发酵，产物中的有机酸以乳酸为主，通过对比发现，对比例4中保加利亚乳杆菌利用了葡萄中的大部分糖类，既有还原糖，也有非还原糖，发酵后产生了大量有机酸，因此产品的口感以酸为主；而实施1中的植物乳酸杆菌hx1是主要利用以葡萄糖为代表的还原糖，而对于蔗糖等非还原性糖其利用效率较低，因此经过长时间发酵后，产物中保留了大部分非还原糖，比如蔗糖，因此产品的口感酸中带甜。从口感分析，植物乳酸杆菌hx1更适于酵素的生产。