副干酪乳杆菌N1115预防结肠炎的应用及相应的婴幼儿奶粉、应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，涉及一种预防结肠炎菌株的应用，具体地说是一种副干酪乳杆菌n1115预防结肠炎的应用；本发明还提供了利用所述副干酪乳杆菌n1115制备的一种婴幼儿奶粉及其应用。

背景技术：

炎症性肠病（ibd）是一组病因不明的慢性、非特异性肠道炎性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，如果患者患有该病，且症状无法得到有效控制，发炎物质会随着血液流到全身，恐将引发虹彩炎、关节炎、结节性红斑等全身性免疫疾病，因此ibd患者罹患大肠癌的机率也较常人高。

而由于ibd患者的初期症状与上班族常见的压力性腹泻相当类似，再加上多数民众对于ibd认识并不足够，因此常常将ibd的初期征兆与其他肠胃疾病混淆，进而造成错过早期发现、早期治疗的黄金时间。该病过去在西方国家多见，而发展中国家发病率相对较低，然而近20年来随着工业化、城市化的进程，中国ibd的发病率呈逐年上升的趋势。

目前，ibd的病因尚不清楚，一般普遍认为遗传、免疫及肠道菌群共同参与了ibd的发生。但由于ibd发生机理不明确，所以现有技术中对于ibd的预防目前还没有明确有效的方法和手段，国内目前一般采用中药或中西医结合治疗的方法，但效果不佳。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题，是提供一种副干酪乳杆菌n1115预防结肠炎的应用，能够早期干预预防结肠炎的发生。本发明的副干酪乳杆菌n1115是从我国内蒙古的传统发酵乳制品中分离出来的，已保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏编号为cgmccno.4691。

本发明还提供了利用副干酪乳杆菌n1115制备的一种婴幼儿奶粉，能够为婴幼儿提有效供预防结肠炎的方法，有效婴幼儿患结肠炎的几率；

本发明也提供了上述的婴幼儿奶粉的一种应用，所述婴幼儿奶粉用于早期干预或预防结肠炎。。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种副干酪乳杆菌n1115预防结肠炎的应用,用于早期干预或预防结肠炎。

本发明还提供了一种婴幼儿奶粉，制成该婴幼儿奶粉的原料以重量份数计包括：生牛乳粉40-45份、脱盐乳清粉28-33份、白砂糖5-8份、无水奶油4-4.5份、大豆油3-4份、乳糖3-4份、浓缩乳清蛋白粉2-4份、低聚半乳糖1.5-2份、低聚果糖1-1.5份、磷脂0.5-1份、dha藻油粉0.1-0.2份、花生四烯酸粉剂0.1-0.3份、氯化胆碱0.05-0.2份、碳酸钙0.1-0.8份、核苷酸0.02-0.06份、复合维生素0.1-0.5份、复合矿物质0.1-0.3份、能预防结肠炎的益生菌粉0.1-1份；其中，能预防结肠炎的益生菌粉中副干酪乳杆菌n1115的含量为0.8×10¹²-1.2×10¹²cfu/kg。

作为限定，所述能预防结肠炎的益生菌粉是将姜黄素10-15重量份、低聚果糖60-70重量份、高脂可可粉10-15重量份，与副干酪乳杆菌n11150.8×10²-1.2×10²cfu/kg混合均匀制得。

本发明也提供节上述的婴幼儿奶粉的一种应用，它用于早期干预或预防结肠炎。

上述婴幼儿奶粉适用于所有0-3岁婴幼儿食用，服用方法：采用35-45℃温水冲服，温水与奶粉重量比为7.5:1~8.5:1，服用量与正常婴幼儿奶粉使用量相同，根据婴幼儿食量酌情增减。

由于采用了上述的技术方案,本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

（1）早期服用本发明的副干酪乳杆菌n1115能够有效预防患有ibd，进而防止人体患有结肠炎等疾病；

（2）本发明的婴幼儿奶粉配方科学，能够为哺乳期的婴幼儿提供有效的营养，同时添加了副干酪乳杆菌n1115，能够有效预防结肠炎，保证婴幼儿的身体健康。

综上所述，本发明的副干酪乳杆菌n1115能够有效预防结肠炎；而本发明利用副干酪乳杆菌n1115制备的婴幼儿奶粉不仅能够有效预防结肠炎，同时配方合理，营养丰富。

本发明适用于所有婴幼儿。

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

附图说明

图1a为本发明实施例1中未利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且未进行dss诱导的肠管结构图；

图1b为本发明实施例1中利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且未进行dss诱导的肠管结构图；

图1c为本发明实施例1中未利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且进行了dss诱导的肠管结构图；

图1d为本发明实施例1中利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且进行了dss诱导的肠管结构图；

图2为本发明实施例1中四组小鼠肠组织的肠组织炎性评分图；

图3a为本发明实施例1中未利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且进行了dss诱导的结肠细胞凋亡图；

图3b为本发明实施例1中利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且进行了dss诱导的结肠细胞凋亡图；

图3c为本发明实施例1中未利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且未进行dss诱导的结肠细胞凋亡图；

图3d为本发明实施例1中利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，且未进行dss诱导的结肠细胞凋亡图;

图4为本发明实施例1中试验的四组小鼠的tnf表达图；

图5为本发明实施例1中试验的四组小鼠的kc表达图。

具体实施方式

实施例1副干酪乳杆菌n1115预防结肠炎的应用

本实施例以新出生的c57bl/6小鼠为试验对象进行试验，所用小鼠为美国范德堡大学提供的雌性和雄性小鼠各12只，体重为1.5g，包括以下步骤：

步骤一、干预：将新出生的24只c57bl/6小鼠随机分为两组每组雌性雄性各6只，一组为副干酪乳杆菌n1115干预组，一组为对照组。其中副干酪乳杆菌n1115干预组的小鼠从出生后第1天开始至出生后第7天，每天灌胃副干酪乳杆菌n1115菌数10⁷cfu（20μl水中含菌数10⁷cfu）；小鼠从出生后第8天至第14天，每天灌胃副干酪乳杆菌n1115菌数10⁸cfu（20μl水中含菌数10⁸cfu）。而对照组小鼠，每天灌胃相同量的纯净水。小鼠出生第15天开始，副干酪乳杆菌n1115干预组停止利用副干酪乳杆菌n1115干预，对照组不变，之后两组小鼠以相同灌胃纯净水的方式喂养至6周龄，然后进入步骤二进行dss干预研究。

步骤二、结肠炎模型建立

将步骤一中所有6周龄的成年小鼠均分为4组，其中进行了副干酪乳杆菌n1115干预和没有进行副干酪乳杆菌n1115干预的小鼠均随机分为两组，然后进行dss干预试验研究。试验时，进行了副干酪乳杆菌n1115干预的两组小鼠中的一组进行dss干预，另一组不进行dss干预。同样未进行副干酪乳杆菌n1115干预的两组小鼠中的一组进行dss干预，另一组不进行dss干预。即通过上述的试验，将小鼠分为了四组，分别为：无副干酪乳杆菌n1115干预+无dss干预；无副干酪乳杆菌n1115干预+进行dss干预；进行了副干酪乳杆菌n1115+无dss干预；进行了副干酪乳杆菌n1115干预+进行dss干预。

上述过程中采用dss进行干预造模的过程为：6周龄小鼠，采用dss（3%，分子量36-50kda）干预4天，诱导肠损伤和急性结肠炎；而无dss干预的6周龄小鼠则采用无菌水作为对照。dss干预完成后，将所有小鼠处死，检测炎症损伤、上皮细胞凋亡、促炎细胞因子等指标。

三、评价指标：

结肠组织损伤及损伤评分：将所有试验小鼠的结肠组织切片通过苏木精-伊红染色后应用光学显微镜检测。然后，将来自同一小鼠的整个结肠组织的样本，参照文献评分系统，对肠道损伤进行评估。

结肠组织细胞凋亡检测：应用apoptagtminsituoligoligation（原位寡核苷酸连接，isol）试剂盒，按照指导方法，应用t4dna连接酶对样品进行处理，切片在微分干涉（dic）显微镜下观察。

细胞因子基因表达检测：将每个检测样本的结肠组织打碎成匀浆，利用rna分离试剂盒分离样品中总rna，用无rna酶的dna酶去除dna干扰；然后，应用大容量cdna反转录试剂盒和7300rt-pcr系统进行反转录；结果应用sequencedetectionsystem软件分析。

副干酪乳杆菌n1115早期干预对后期进行dss干预小鼠上皮损伤的影响

图1a为non-lpn1115/water的小鼠肠组织图、图1b为lpn1115treatment/water的小鼠肠组织图，即图1a与图1b所示的均是未进行dss干预的正常肠组织，通过图1a、图1b的正常组织学显示，小鼠结肠上皮细胞排列完整，结构清晰，固有层有少量淋巴细胞，杯状细胞丰富，腺管结构正常，其上皮细胞的炎性损伤评分如图2所示为0。

图1c为non-lpn1115/dss的小鼠肠组织图，即未利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，而直接采用dss诱导，则图1c中出现了严重的结肠损伤和急性结肠炎症状，伴随大面积溃疡，隐窝破坏，以及严重的炎性，因此，图1c的上皮细胞的炎性损伤评分如图2所示为9.63±0.83（*p＜0.01），该结果提示dss诱导的结肠模型成功。

然而，早期利用副干酪乳杆菌n1115干预的小鼠，再进行dss诱导后，如图1d所示，上皮细胞的损伤显著降低，其上皮细胞的炎性损伤评分如图2所示为6.11±0.83（p＜0.05），该结果提示，副干酪乳杆菌n1115的早期干预显著降低了dss对肠道上皮细胞的损伤，具有预防结肠炎的作用。

副干酪乳杆菌n1115早期干预对乳鼠成年后肠上皮细胞凋亡的影响

肠道完整性破坏是dss诱导肠道损伤和结肠炎的重要特征之一，本实施例通过apoptaq，isol检测试剂盒，对副干酪乳杆菌n1115早期干预对肠道上皮细胞凋亡的影响进行评价，结果如图3a至图3d显示。其中图3a的non-lpn1115/dss表示未利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预而直接dss诱导肠小鼠肠炎，结肠上皮细胞应用apoptaq，isol试剂可检测到较强的红色的荧光信号，说明dss导致了小鼠肠道完整性破坏，细胞凋亡明显。对照组图3c的non-lpn1115/water与图3dlpn1115treatment/water分别为未对小鼠进行dss诱导，因此荧光信号较弱，说明凋亡细胞较少，肠道完整性较好。

然而，图3b中lpn1115treatment/dss表示利用副干酪乳杆菌n1115对小鼠进行早期干预，在dss诱导后，与阳性对照组相比，荧光信号明显减少，其结肠细胞凋亡明显减弱。该结果进一步说明，副干酪乳杆菌n1115早期干预对肠道上皮细胞的凋亡具有保护作用，具有一定的预防结肠炎，减弱上皮细胞凋亡的作用。

副干酪乳杆菌n1115干预对乳鼠成年后的tnf和kc表达的影响

促炎细胞因子（如tnf和kc）产生增多，这是dss诱导的结肠炎的一个特征。而本实施例中所有肿瘤坏死因子tnf（mm00443259）和kc（mm00433859）的引物，购自appliedbiosystems公司。所有样品中靶基因mrna的定量以3-磷酸甘油醛脱氢酶（gapdh）mrna的相对丰度作为参照标准，所有cdna样本为一式3份进行分析。

副干酪乳杆菌n1115早期干预对dss诱导的结肠炎模型中炎性细胞因子的影响，见图4与图5，从图4与图5中可知，与对照组（即未进行dss诱导的小鼠）相比，经过dss诱导的肠炎组小鼠的tnf和kc的mrna水平显著增加（*p＜0.01，*p＜0.01）。而将两组经过dss诱导的肠炎组相比，dss诱导的利用副干酪乳杆菌n1115早期干预组相较dss诱导的未利用副干酪乳杆菌n1115早期干预组相比，利用副干酪乳杆菌n1115早期干预组小鼠的tnf和kc的mrna水平则显著降低（#p＜0.05，#p＜0.05）。该结果提示，早期的副干酪乳杆菌n1115干预对肠道结肠炎具有预防作用。

实施例2-7利用副干酪乳杆菌n1115制备的婴幼儿奶粉

实施例2-7分别为一种利用副干酪乳杆菌n1115制备的婴幼儿奶粉。它们的原料配比见下表1：

表1实施例2-7的原料配比

将各原料组分均匀混合即得相应实施例的婴幼儿奶粉。上表中的能预防结肠炎的益生菌粉分别由姜黄素、低聚果糖、高脂可可粉与副干酪乳杆菌混合均匀制成，它们的原料配比见下表2：

表2实施例2-7中益生菌粉原料配比

实施例8实施例2-7所提供婴幼儿奶粉的应用

实施例2-7所提供的每一种婴幼儿奶粉，均以新出生的c57bl/6小鼠为试验对象进行干预试验，所用小鼠为美国范德堡大学提供的雌性和雄性小鼠各12只，体重为1.5g，包括：

步骤一、干预：将新出生的24只c57bl/6小鼠随机均分为两组，一组为婴幼儿奶粉干预组，一组为对照组。其中干预组的小鼠从出生后第1天开始至出生后第7天，每天灌胃婴幼儿奶粉（灌胃量以所含副干酪乳杆菌n1115菌数为10⁷cfu计算）；小鼠从出生后第8天至第14天，每天灌胃婴幼儿奶粉（灌胃量以所含副干酪乳杆菌n1115菌数为10⁸cfu计算）。而对照组小鼠，每天灌胃相同量的纯净水。小鼠出生第15天开始，干预组停止干预，对照组不变，之后两组小鼠以相同灌胃纯净水的方式喂养至6周龄，然后进入步骤二进行dss干预研究。

步骤二、结肠炎模型建立

将步骤一中所有6周龄的成年小鼠均分为4组，其中进行了婴幼儿奶粉干预和没有进行婴幼儿奶粉干预的小鼠均随机分为两组，然后进行dss干预试验研究。试验时，进行了干预的两组小鼠中的一组进行dss干预，另一组不进行dss干预。同样未进行干预的两组小鼠中的一组进行dss干预，另一组不进行dss干预。通过上述的试验，将小鼠分为了四组，分别为：无婴幼儿奶粉干预+无dss干预；无婴幼儿奶粉干预+进行dss干预；进行了婴幼儿奶粉干预+无dss干预；进行了婴幼儿奶粉干预+进行dss干预。

上述过程中采用dss进行干预造模的过程为：6周龄小鼠，采用dss（3%，分子量36-50kda）干预4天，诱导肠损伤和急性结肠炎；而无dss干预的6周龄小鼠则采用无菌水作为对照。dss干预完成后，将所有小鼠处死，检测炎症损伤、上皮细胞凋亡、促炎细胞因子等指标。

三、评价指标：

结肠组织损伤及损伤评分：将所有试验小鼠的结肠组织切片通过苏木精-伊红染色后应用光学显微镜检测。然后，将来自同一小鼠的整个结肠组织的样本，参照文献评分系统，对肠道损伤进行评估。

结肠组织细胞凋亡检测：应用apoptagtminsituoligoligation（原位寡核苷酸连接，isol）试剂盒，按照指导方法，应用t4dna连接酶对样品进行处理，切片在微分干涉（dic）显微镜下观察。

细胞因子基因表达检测：将每个检测样本的结肠组织打碎成匀浆，利用rna分离试剂盒分离样品中总rna，用无rna酶的dna酶去除dna干扰；然后，应用大容量cdna反转录试剂盒和7300rt-pcr系统进行反转录；结果应用sequencedetectionsystem软件分析。

婴幼儿奶粉早期干预对后期进行dss干预小鼠上皮损伤的影响

通过正常组织学显示，小鼠结肠上皮细胞排列完整，结构清晰，固有层有少量淋巴细胞，杯状细胞丰富，腺管结构正常，其上皮细胞的炎性损伤评分为0。

结果表明：未利用婴幼儿奶粉对小鼠进行早期干预而直接采用dss诱导，则出现了严重的结肠损伤和急性结肠炎症状，伴随大面积溃疡，隐窝破坏，以及严重的炎性，上皮细胞的炎性损伤评分为9.63±0.831（*p＜0.01），该结果提示dss诱导的结肠模型成功。

然而，早期利用婴幼儿奶粉干预的小鼠，再进行dss诱导后，上皮细胞的损伤显著降低，其上皮细胞的炎性损伤评分为6.12±0.83（p＜0.05）。该结果提示，婴幼儿奶粉的早期干预显著降低了dss对肠道上皮细胞的损伤，具有一定的预防结肠炎的作用。

婴幼儿奶粉早期干预对乳鼠成年后肠上皮细胞凋亡的影响

肠道完整性破坏是dss诱导肠道损伤和结肠炎的重要特征之一，本实施例通过apoptaq，isol检测试剂盒，对婴幼儿奶粉早期干预对肠道上皮细胞凋亡的影响进行评价，结果表示未利用婴幼儿奶粉对小鼠进行早期干预而直接dss诱导肠小鼠肠炎，结肠上皮细胞应用apoptaq，isol试剂可检测到较强的红色的荧光信号，说明dss导致了小鼠肠道完整性破坏，细胞凋亡明显。未进行dss诱导的小鼠，荧光信号较弱，说明凋亡细胞较少，肠道完整性较好。

然而，利用婴幼儿奶粉对小鼠进行早期干预，在dss诱导后，与阳性对照组相比，荧光信号明显减少，其结肠细胞凋亡明显减弱。该结果进一步说明，婴幼儿奶粉早期干预对肠道上皮细胞的凋亡具有保护作用，具有一定的预防结肠炎，减弱上皮细胞凋亡的作用。

婴幼儿奶粉干预对乳鼠成年后的tnf和kc表达的影响

促炎细胞因子（如tnf和kc）产生增多，这是dss诱导的结肠炎的一个特征。而本实施例中所有肿瘤坏死因子tnf（mm00443259）和kc（mm00433859）的引物，购自appliedbiosystems公司。所有样品中靶基因mrna的定量以3-磷酸甘油醛脱氢酶（gapdh）mrna的相对丰度作为参照标准，所有cdna样本为一式3份进行分析。

婴幼儿奶粉早期干预对dss诱导的结肠炎模型中炎性细胞因子的影响，与对照组（即未进行dss诱导的小鼠）相比，经过dss诱导的肠炎组小鼠的tnf和kc的mrna水平显著增加（*p＜0.01，*p＜0.01）。而将两组经过dss诱导的肠炎组相比，dss诱导的利用婴幼儿奶粉早期干预组相较dss诱导的未利用婴幼儿奶粉早期干预组相比，利用婴幼儿奶粉早期干预组小鼠的tnf和kc的mrna水平则显著降低（#p＜0.05，#p＜0.05）。该结果提示，早期的婴幼儿奶粉干预对肠道结肠炎具有预防作用。