含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法，属于饲料添加剂
技术领域：
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背景技术：
：随着规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，水产养殖病害频繁发生使用广谱抗生素控制病害的发生，不仅使细菌耐药性增加，更破坏和干扰养殖环境的正常微生物菌群，导致微生物的生态失调，而且会使水产品中残留有抗生素，对人类健康产生危害。严重阻碍了水产养殖业的健康与可持续发展。近年来人们开始尝试在养殖生产中使用有益微生物调节水质。以改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力，抑制病原微生物，从而减少疾病的发生。凝结芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，两端钝圆，单个、成对少数呈短链状。最适ph为6.6～7.0，最适生长温度为37～45℃。能分解糖类产生乳酸，是同型乳酸发酵菌。是经美国fda批准的一种“普遍认为安全”的杆菌类乳酸菌。又称乳酸芽孢杆菌。该菌可以产生芽孢，具有较强的抗逆性。凝结芽孢杆菌经90℃处理10min、100℃处理5min不会失活。在室温干燥情况下可以保存3～5年，菌量保持稳定。凝结芽孢杆菌在ph为1.4的条件下处理2h，菌量无明显下降。虽然以凝结芽孢杆菌为主的饲料添加剂应用不少，但是总体来说还是研发应用脱节，产品质量稳定性差、生产工艺落后，产品一致性较差。目前以芽孢杆菌为主的添加剂主要以芽孢量作为衡量产品质量的唯一标准，但若芽孢不能及时萌发，则使用效果不佳。一般芽孢杆菌的最适温度在37℃左右，发酵温度一般设定为菌种的最适生长温度。水产养殖环境水温一般不会超过30℃，对于一些冷水鱼、海参等养殖动物，养殖水温要求低于20℃，很多芽孢杆菌在20℃以下不会萌发，直接泼洒芽孢菌粉根本不会起作用。而且水产养殖环境多变，根据养殖阶段、养殖季节、降水量变化等因素会造成养殖池塘盐度变化，不能耐受盐度变化的菌种往往适应性不强，使用效果不稳定。近年来，人们主要以枯草芽孢杆菌作为模式菌株对芽孢的萌发机理进行研究。有学者发现l-丙氨酸是促进枯草芽孢杆菌萌发的必要营养剂，但也有学者经研究发现l-丙氨酸并不能促进凝结芽孢杆菌的萌发。由此可见不同芽孢菌种间的芽孢萌发特性不同。以枯草芽孢杆菌萌发剂(agfk)作为凝结芽孢杆菌的萌发剂，4个小时萌发率仅为65％，萌发率低，萌发速度慢。中国专利文献cn105441358a(申请号201510951097.9)公开了一种用于水产养殖场现场发酵的地衣芽孢杆菌制剂及其应用，制备该地衣芽孢杆菌制剂的原料为：地衣芽孢杆菌菌粉，硫酸粘杆菌素，纳他霉素，肌苷，玉米粉，玉米浆粉，氯化钠，丝氨酸，果糖，红糖。利用地衣芽孢杆菌制剂中的纳他霉素与硫酸粘杆菌素抑制发酵过程中的病原真菌，酵母菌等真菌，与大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌的生长，利用肌苷，果糖，丝氨酸等芽孢萌发剂快速促进地衣芽孢的萌发，提高芽孢萌发率。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法。该饲料添加剂中的凝结芽孢杆菌在水中可以快速萌发，大大提高了凝结芽孢杆菌的萌发率。本发明技术方案如下：一种含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂，组份如下，均为重量份:凝结芽孢杆菌菌粉60～75份，葡萄糖1～5份，海藻糖0.2～4份，玉米浆干粉0.5～8份；所述的凝结芽孢杆菌菌粉中孢子含量不低于100亿cfu/克。根据本发明优选的，所述凝结芽孢杆菌菌粉由如下重量份的原料混合、干燥制得：凝结芽孢杆菌发酵液60～75份、麦芽糊精15～20份、玉米蛋白2～6份、阿拉伯胶1～5份。根据本发明优选的，组份如下，均为重量份:凝结芽孢杆菌菌粉70份，葡萄糖1.5份，海藻糖0.8份，玉米浆干粉1.7份；根据本发明优选的，所述凝结芽孢杆菌够自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号为cgmcc1.2009。上述含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：(1)对凝结芽孢杆菌进行活化培养，制得活化菌株，然后经种子培养、发酵培养，制得凝结芽孢杆菌发酵液；(2)将步骤(1)制得的凝结芽孢杆菌发酵液经干燥，制得凝结芽孢杆菌菌粉；(3)按比例将凝结芽孢杆菌菌粉与葡萄糖、海藻糖、玉米浆干粉、混合均匀，制得含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂。根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养为：35～38℃条件下lb固体培养基培养44～52h。所述lb固体培养基为本领域常用培养基，组份如下:蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l，ph6.5～7.0。根据本发明优选的，所述步骤(1)中的种子培养为：35～38℃、通气比为1:1.2、转速150～220rpm/min条件下，种子培养基培养16～24h。根据本发明进一步优选的，所述种子培养基组份如下，均为质量百分比：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.003％，水余量，ph6.5～7.0。根据本发明优选的，所述步骤(1)中的发酵培养为：35～38℃、通气比为1:1.2、转速150～220rpm/min条件下，发酵培养基培养32～40h；接种量为发酵培养基体积的3～6％。根据本发明进一步优选的，所述发酵培养基组份如下，均为质量百分比：麸皮2％，豆粕2％，玉米浆1％，磷酸氢二钾0.02％，磷酸二氢钾0.01％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.003％，碳酸钙0.5％，水余量，ph6.5～7.0。根据本发明优选的，所述步骤(2)干燥步骤前，还包括将凝结芽孢杆菌发酵液60～75重量份与麦芽糊精15～20重量份、玉米蛋白2～6重量份、阿拉伯胶1～5重量份混合均匀的步骤。根据本发明优选的，所述步骤(2)中干燥为喷雾干燥，喷雾塔入口温度为170℃，出口温度为85℃。根据本发明优选的，所述步骤(2)中干燥后还包括制粒、过筛的步骤。根据本发明优选的，所述步骤(3)中混合后还包括粉碎、过80目筛的步骤。上述含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂在提高水产养殖饲料吸收过程中的应用。根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：将含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂与水产养殖水按重量比1:(20～50)混合，30～60min后，然后加入饲料中，溶液与饲料重量的比例为1:100，混合均匀，施喂即可。根据本发明优选的，所述的水产养殖为海水养殖。有益效果本发明首次将海藻糖应用于凝结芽孢杆菌的孢子萌发剂中，解决了凝结芽孢杆菌孢子在低温、高盐度环境下萌发速度和萌发率低的问题，经检测，芽孢萌发率可达到92％，显著高于现有产品，解决了凝结芽孢杆菌饲料添加剂因芽孢萌发慢、萌发率低造成施用后产品效果差的问题。附图说明图1是实验例1的萌发率-时间曲线图；具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。生物材料来源凝结芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号为cgmcc1.2009。培养基lb固体培养基，组份如下:蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl5g/l、琼脂1.5g/l；种子培养基，组份如下，均为重量百分比：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.003％，余量水，ph6.5-7.0。发酵培养基，组份如下，均为重量百分比：麸皮2％，豆粕2％，玉米浆1％，磷酸氢二钾0.02％，磷酸二氢钾0.01％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.003％，碳酸钙0.5％，余量水，ph6.5-7.0。上述培养基的灭菌条件均为：0.10-0.15mpa，115℃，灭菌30min。人工海水组分如下，均为质量百分比：nacl2.8％，kcl0.08％，mgcl2·6h2o0.5％，cacl2·h2o0.12％，余量水。agfk普通市售产品，也可按质量比天门冬氨酸：葡萄糖：果糖：氯化钾＝2:1:1:1的比例配制。实施例1一种含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂，组份如下，均为重量份:凝结芽孢杆菌菌粉70份，葡萄糖1.5份，海藻糖0.8份，玉米浆干粉1.7份；所述的凝结芽孢杆菌菌粉中芽孢总量为120亿cfu/克。上述含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：(1)对凝结芽孢杆菌在37℃条件下lb固体培养基培养48h，制得活化菌株，然后在37℃、通气比1:1.2、转速200rpm/min条件下，种子培养基培养18h；然后按发酵培养基体积的6％接种，经37℃、通气量比为1:1.2、转速200rpm/min条件下，发酵培养基培养36h，制得凝结芽孢杆菌发酵液；(2)将步骤(1)制得的凝结芽孢杆菌发酵液75重量份与麦芽糊精15份、玉米蛋白6份、阿拉伯胶4份混合均匀，然后经喷雾干燥干燥，喷雾塔的入口温度为170℃，出口温度为85℃，经制粒、过筛，制得凝结芽孢杆菌菌粉；(3)按比例将凝结芽孢杆菌菌粉与葡萄糖、海藻糖、玉米浆干粉混合均匀，粉碎、过80目筛，制得含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂。经检测，活芽孢含量≥100亿cfu/g。实施例2一种含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂，组份如下，均为重量份:凝结芽孢杆菌菌粉65份，葡萄糖5份，海藻糖4份，玉米浆干粉8份；所述的凝结芽孢杆菌菌粉中芽孢总量为120亿cfu/克。上述含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：(1)对凝结芽孢杆菌在37℃条件下lb固体培养基培养48h，制得活化菌株，然后在35～38℃、转速150～220rpm/min条件下，种子培养基培养16～24h；然后按发酵培养基体积的6％接种，经35～38℃、通气量比为1:1.2、转速150～220rpm/min条件下，发酵培养基培养32～40h，制得凝结芽孢杆菌发酵液；(2)将步骤(1)制得的凝结芽孢杆菌发酵液经喷雾干燥，喷雾塔入口温度为170℃，出口温度为85℃，经制粒、过筛，制得凝结芽孢杆菌菌粉；(3)按比例将凝结芽孢杆菌菌粉与葡萄糖、海藻糖、玉米浆干粉混合均匀，粉碎、过80目筛，制得含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂。对比例1如实施例1所述的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂，不同之处在于，只含有凝结芽孢杆菌菌粉。对比例2如实施例1所述的含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂，不同之处在于，将海藻糖替换为等量的果糖。对比例3如实施例1所述的含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂，不同之处在于，将葡萄糖、海藻糖、玉米浆干粉替换为等质量的agfk。实验例1将对比例1～3和实施例1中所述添加剂按重量比1:100加入到人工海水中，混合均匀，置于10℃环境下，每隔30min检测凝结芽孢杆菌萌发率，分别记为空白组、对照组1、对照组2和实验例(海水)；将实施例1中所述添加剂按重量比1:100加入到纯水中，混合均匀，置于10℃环境下，每隔30min检测凝结芽孢杆菌萌发率，记为实施例(纯水)。芽孢检测方法：利用血球计数板法。萌发率＝萌发芽孢数/总菌数经检测各实验组的数据如图1所述：通过图1可以看出，实验例(海水)在120min萌发率达到最大值，其萌发率和萌发速度远远高于空白组、对比例1和对比例2。将对比例1和实验例(海水)对比，可以看出，添加海藻糖能够促进凝结芽孢杆菌杆菌在模拟海水养殖条件下的快速萌发，并能够提高凝结芽孢杆菌的萌发率。而添加agfk萌发剂的对比例3其萌发率和萌发速度远小于实验例(海水)，证明agfk在低温、高盐度的环境中，并不能明显的促进凝结芽孢杆菌萌发；通过对比例2和实验例(海水)对比的数据可以看出，将果糖替换为海藻糖，也无法实现在模拟海水养殖条件下凝结芽孢杆菌杆菌的快速萌发，萌发率也显著低于实验例(海水)。将实验例在海水和纯水中以相同条件进行萌发，发现实验例(纯水)中凝结芽孢杆菌的萌发速度和萌发率明显低于在实验例(海水)，证明本发明的萌发剂适用于低温海水中的凝结芽孢杆菌萌发。实验例2地址：青岛贝宝海洋科技有限公司琅琊养殖基地；海水盐度28～31‰，温度26～28℃。实验组：分别采用实施例1、对比例2-3所述的饲料添加剂与水产养殖水按重量比1:30混合，120min后，然后加入饲料中，溶液与饲料重量的比例为1:100，混合均匀，进行投喂。同时采用未施用饲料添加剂的作为空白组。每组实验设3个平行，池子大小为4.2×5.4×1.2m，每池投放20000尾虾苗，喂养时间为3个月。酶活力指标：每个池子随机选取10头虾，检测超氧化物歧化酶(sod)和总一氧化氮合酶(tnos)的含量(由上海通蔚实验有限公司检测)。经检测，各实验组的相关检测结果如表2所示：表2总重(g)成活率(％)sod(pg/ml)tnos(μmol/l)空白组158277.88±7360.8149.00±2.6535.46±2.825.57±0.65实施例1243180.68±16651.8780.45±2.0847.65±3.327.47±0.58对比例2201343.35±13424.4170.12±4.3442.32±4.356.55±0.42对比例3195779.83±10232.3864.67±3.0641.91±2.436.24±0.28从表中数据可知：使用本发明含萌发剂凝结芽孢杆菌实验组凡纳滨对虾的总重为243180.68g，比空白组高出84902.8g，比对比例2高出41837.33g，比对比例3高出47400.85g。使用本发明含萌发剂凝结芽孢杆菌实验组凡纳滨对虾的成活率为80.45％，比空白组高出31.45％，比对比例2高出10.33％，比对比例3高出15.78％。使用本发明含萌发剂凝结芽孢杆菌实验组凡纳滨对虾的sod含量为47.65pg/ml，比空白组高出12.19pg/ml，比对比例2高出5.33pg/ml，比对比例3高出5.74pg/ml。使用本发明含萌发剂凝结芽孢杆菌实验组凡纳滨对虾的tnos的含量为7.47μmol/l，比空白组高出1.9μmol/l，比对比例2高出0.92μmol/l，比对比例3高出1.23μmol/l。各项指标实验组均高于空白组和对比例2、3，证明海藻糖能促进凝结芽孢杆菌在低温、高盐度环境中快速萌发，添加本发明含萌发剂凝结芽孢杆菌菌粉不仅提高了凡纳滨对虾的重量和成活率，同时也增强了凡纳滨对虾的免疫力。当前第1页12