一种治疗骨质疏松鳗骨多肽的制备方法与流程

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种治疗骨质疏松鳗骨多肽的制备方法。

背景技术：

目前,我国居民的钙量只达到我国营养学会推荐供给量标准(rda)的一半，有些地区儿童只达到20％～50％，因此佝偻病仍较常见。在农村，多数人的钙摄入量为400mg/天，低于rda要求，城市居民也达不到800mg/天，孕妇和哺乳妇女摄取钙亦不足。

随着近年来沿海地区烤鳗加工业的发展，产生大量的下脚料鳗鱼骨，其比例占活鳗的7％以上。鳗鱼骨除小部分用作饲料外，大多数废弃，造成资源浪费和环境污染。我国居民普遍存在补钙不足的情况，通过开发鳗骨多肽产品可以解决鳗鱼产业的加工副产物综合使用，进而促进我省海洋生物产业的发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种治疗骨质疏松鳗骨多肽的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种治疗骨质疏松鳗骨多肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将干鳗鱼骨用碱溶液浸泡，然后去除鱼肉，并对鱼骨冲洗，烘干，最后将烘干的鳗鱼干粉碎；将粉碎的鳗鱼干加入到水中，然后加入胰酶，保持一定温度和时间，之后高温灭酶，降温冷却，将冷却后的料液过筛，撇去上层泡沫浮油；

2)将步骤1)的料液离心分离得到上层离心液，将离心液进行陶瓷膜过滤，得到第一次透过液；将第一次透过液进行卷式膜1w分子量过滤，得到第二次透过液；将第二次透过液进行卷式膜200分子量过滤，得到200到10000的分子量浓缩液；

3)将200到10000的分子量浓缩液做喷雾干燥，得到的干粉即为鳗骨多肽。

在步骤1)中，干鳗鱼骨用碱溶液浸泡的方法如下：首先将干鳗鱼骨以浓度为0.1％～1％的naoh溶液进行浸泡24h～48h，然后更换新的0.1％～1％naoh溶液继续浸泡12～24h，最后加热到70～90℃，再次浸泡12～24h。

在步骤1)中，所述鱼骨冲洗至ph为7～8；所述鳗鱼干粉碎方法如下：先用粗碎机粉碎，再用万能粉碎机粉碎至10～100目。

在步骤1)中，加入胰酶后，所述保持一定温度和时间为：40℃～50℃恒温8～16h。

在步骤1)中，所述料液过筛为先过粗筛，再过80～200目细筛。

在步骤2)中，陶瓷膜过滤的参数为：孔径0.1～0.5μm，进膜压力0.1～0.5mpa，过滤速度500～800l/h。

在步骤2)中，卷式膜1w分子量过滤的参数为：进膜压力0.1～0.5mpa，过滤速度为100～500l/h。

在步骤2)中，卷式膜200分子量过滤的参数为：进膜压力0.1～0.5mpa，过滤速度为1～5m²/h。

在步骤3)中，所述喷雾干燥的参数为：进风口温度100～200℃，出风口温度100～200℃，流速1～10l/h。

所述200到10000的分子量浓缩液的电导率为1～10ms/cm。

相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：

相比较现有的补钙产品，本发明鳗骨多肽是通过与钙螯合，可以有效地促进钙的吸收，并通过成骨细胞将钙质沉淀到人体的骨质中，多肽产品容易被人体吸收和降解，相比较小分子药物(如依替膦酸二钠)对人体负作用小，是具有市场前景的补钙产品。同时开发鳗骨材料，可以充分地利用沿海各地鳗鱼加工厂的下脚料，提高鳗鱼加工厂的利润，对鳗鱼产业的创新升级有重要的作用。

附图说明

图1为鳗骨多肽增强骨质疏松模型斑马鱼脊椎骨荧光强度作用对比图(框线为分析部位脊椎骨)；

图2为鳗骨多肽对骨质疏松模型斑马鱼脊椎骨荧光强度图(与模型对照组比较，*p<0.05，***p≤0.001)；

图3为鳗骨多肽对骨质疏松模型斑马鱼脊椎骨骨密度增强功效图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。

一、本实施例中，鳗骨多肽的制备方法如下：

1、收集干鳗鱼骨100kg，以浓度为0.1％naoh溶液浸泡24小时，然后更换新的0.1％naoh溶液继续浸泡过夜，最后加热到80℃，再次浸泡12h。

2、浸泡鳗鱼骨搅拌揉搓冲水，去除大部分鱼肉，鱼骨冲洗至中性后用ph试纸对比为7～8。

3、沥去水份，90℃烘干(15h)分两批次，干燥之后基本没有气味。

4、粉碎：鳗鱼骨先用粗碎机粉碎，再用万能粉碎机粉碎至10目。

5、将45kg干鱼骨，加入450l纯水，搅拌后用ph试纸对比为7～8，将水温控制在45℃加胰酶450g，恒温8h，之后灭酶，自然降温冷却。

6、待温度低于60℃，放料液，过粗筛，再过80目细筛，撇去上层泡沫浮油，料液无异味。

7、管式离心：转速14000r/min，蠕动泵140r/min，130l/h流量，连续离心完成，鳗鱼骨渣称重55kg(取样测固含量约65.7％)，离心液土黄色，无明显颗粒物。

8、陶瓷膜过滤：孔径0.3μm，进膜压力0.25mpa，过滤速度为650l/h，过滤接近完成时加水两次，每次加水60l，最后浓缩液为46kg，透过液470l颜色明亮棕黄色。

9、卷式膜1w分子量：进膜压力0.2mpa，过滤速度为350l/h，浓缩液9kg，透过液颜色明亮呈棕色。

10、卷式膜200分子量：进膜压力0.4mpa，过滤速度为2.6㎡/h，浓缩液加水3次，每次50l，检测电导为浓缩液4.02ms/cm，透过液161.9μs/cm，获得浓缩液为70l，加水30l顶出，混合一共浓缩液为100l，颜色深棕色。

11、取100l200到10000的分子量浓缩液做喷雾干燥，进风口温度145℃，出风口温度112℃，流速4l/h，得出干粉即为鳗骨多肽。

二、检测方法

1、mtc测定

随机选取210尾3dpf野生型ab品系斑马鱼于50ml烧杯中，每杯(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予鳗骨多肽125、250、500、1000和2000μg/ml浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为20ml。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予泼尼松建立斑马鱼骨质疏松模型。鳗骨多肽处理期间，每天统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除。28℃处理4天后，确定鳗骨多肽对骨质疏松模型斑马鱼的mtc。

2、骨质疏松治疗功效评价

随机选取180尾3dpf野生型ab品系斑马鱼于50ml烧杯中，每杯(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予鳗骨多肽500、1000和2000μg/ml浓度，阳性对照组依替膦酸二钠300μg/ml浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为20ml。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予泼尼松建立斑马鱼骨质疏松模型。28℃处理4天后，用钙黄绿素进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，使用nis-elementsd3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼脊椎骨荧光强度(s)，以该指标的统计学分析结果评价鳗骨多肽对骨质疏松模型斑马鱼的骨密度增加功效。统计学处理结果采用mean±se表示。骨密度增加功效计算公式如下：

用spss软件进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。

三、检测结果

1、mtc测定

在本实验条件下，鳗骨多肽对骨质疏松模型斑马鱼的mtc为2000μg/ml。详见表1鳗骨多肽骨质疏松治疗功效评价浓度摸索实验结果(n＝30)。

表1

2、骨质疏松治疗功效

表2

与模型对照组比较，*p<0.05，***p≤0.001

在本实验条件下，鳗骨多肽具有明显的骨质疏松治疗功效。详见表2鳗骨多肽对骨质疏松模型斑马鱼治疗功效评价实验结果(n＝10)以及图1～3。从图1～2可以看出，相比较模型组的斑马鱼，饲喂鳗骨多肽的骨质疏松模型斑马鱼的脊椎骨的荧光强度显著增强，从图3可以看出饲喂2000ug/ml的鳗骨多肽可以增加骨质疏松模型斑马鱼骨密度44％。

相比较现有的补钙产品，本发明鳗骨多肽重点是通过与钙螯合，可以有效的促进钙的吸收，并通过成骨细胞将钙质沉淀到人体的骨质中，多肽产品容易被人体吸收和降解，相比较小分子药物(如依替膦酸二钠)对人体负作用小，是具有市场前景的补钙产品。同时开发鳗骨材料，可以充分地利用沿海各地鳗鱼加工厂的下脚料，提高鳗鱼加工厂的利润，对鳗鱼产业的创新升级有重要的作用。