专利名称：无抗原性高效抗肿瘤药物-l-门冬酰胺酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生化药物的制备方法。
来源于大肠杆菌的L-门冬酰胺酶可以水解肿瘤细胞所必须的营养源之一-L-门冬酰胺，从而抑制肿瘤细胞的生长。国内外临床资料表明，该酶是治疗淋巴性白血病和恶性淋巴肿瘤的有效良药。目前美国，西德，日本等国均已有商品出售，我国天津生化制药厂也于1973年投入生产。
但该酶是来源于大肠杆菌的异体蛋白存在酶疗法中常见的二个难以解决的问题。即该酶在人体内半衰期短，很快从血液循环中排除和非经口投药后刺激人体免疫系统产生对人体有害的免疫反应甚至存在诱发致死性过敏反应的危险。为了解决后一抗原性问题，自1975年以来曾用化学修饰法(如采用亚硝酸(1)，琥珀酸酐(2)，三硝基苯磺酸(3)等修饰剂)对该酶抗原性变化做了大量的研究。结果表明，这些小分子修饰剂对解决抗原性几乎是不可能的。1977年后开始用水溶性大分子如多聚DL-丙氨酸(4)，右旋糖酐(5)，白蛋白(6)单甲氧基聚乙二醇(7)等修饰该酶，发现单甲氧基聚乙二醇是较理想的解除抗原性的修饰剂。遗憾的是当抗原性完全解除时，该酶活力仅剩0.02%，1984年日本Inada等人改进了单甲氧基聚乙二醇的活化方法获得的修饰酶，当抗原性完全解除时，酶活力可保持11%(8)，这是当前解决该酶抗原性的最好结果。但是我们认为这种结果用于生产和临床还不够理想，酶活力的严重损失不仅会提高生产该酶的成本而且也将影响临床效果。
为了在延长该酶体内、外半衰期和完全解除抗原性的同时，尽可能高地保持酶活性，有利于该酶的生产和临床应用。我们改进了修饰方法，采取用底物L-门冬酰胺保护酶活性部位等措施。
L-门冬酰胺酶是分子量约13.4万，4个相同亚基组成的蛋白质，能水解L-门冬酰胺为L-门冬氨酸和氨。由于该酶可以“剥夺”某些肿瘤生长的营养源之一-L-门冬酰胺，从而抑制肿瘤细胞的生长。
来源于大肠杆菌和其他微生物的L-门冬酰胺酶对人来讲是异体蛋白，连续投用时会刺激人体免疫系统，产生大量抗体，引起有害的免疫过敏反应，不能继续投药，影响医疗效果，严重时可发生生命危险。其原因是该酶分子表面存在7-8个抗原决定部位，每个部位由2-3个氨基酸残基所组成，这些部位被人体视为“异已”而被识别，排斥，产生免疫过敏反应。
本发明是该酶活性部位在其底物L-门冬酰胺的保护下酶分子中自由氨基用PEG2即式
(这里，R是分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇)
部分地置换，得到酶活力保持30～40%，抗原性完全解除的修饰L-门冬酰胺酶的制法。
按下式制PEG2及修饰酶
该酶在1～30摩尔数比的底物L-门冬酰胺保护下，在PH＝10.0，0.1M硼酸钠-氢氧化钠缓冲液中，37℃保温30分钟后加入相当于该酶氨基摩尔数6-7倍的PEG2，37℃振荡1小时即得修饰酶，式
该酶活力测定用奈斯勒法和酶偶联法。氨基修饰率的测定用三硝基苯磺酸法。抗原性的测定是用该酶免疫兔血清，根据抗原抗体相互反应的双扩散法和沉淀曲线法。
根据实施例的方法制造了本发明的修饰酶，其酶活性及和抗体结合能的测定结果如下
本发明的修饰酶不仅在较好地保持酶活力(保持30～40%)的同时抗原性完全解除，而且它在体内、外的半衰期分别延长了13.5和17倍;抗胰蛋白酶水解能力增强;对底物L-门冬酰胺，特别是谷氨酰胺的亲和性明显提高，对L-门冬酰胺天然酶Km值为4×10-5M，修饰酶Km值为2.9×10-5M;对谷氨酰胺天然酶Km值为7.4×10-2M，修饰酶Km值为7.35×10-3M。
实施例如下(1)取20g单甲氧基聚乙二醇(分子量5000)加入365mg三聚氯氰，6.5g5A分子筛，10g天水碳酸钠于100ml重蒸的无水苯中，80℃回流44小时(在搅拌下)后，过滤(G2)，石油醚沉淀，过滤，用丙酮∶苯二1∶1的混合液溶解，沉淀反复几次最后得PEG2修饰剂。
(2)20mg L-门冬酰胺酶溶于5mlPH＝10的0.1M硼酸钠-氢氧化钠缓冲液中，加入0.04M L-门冬酰胺80ml，37℃保温30分钟，然后加入PEG2789mg，37℃振荡1小时。随后加入100mlPH7.0的0.1M磷酸缓冲液(予冷)，超滤(yM30)，冻干。
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权利要求
1.一种无抗原性，高效抗肿瘤药物--L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征在于该方法采用了底物L-门冬酰胺对酶的活性部位进行保护。
2.按照权力要求1所述的制备方法，其特征在于该底物与酶的摩尔数比为1～30∶1，最佳比为20∶1。
3.按照权力要求1所述的制备方法，其特征在于底物与酶在PH10，0.1M，硼酸钠-氢氧化钠缓冲液中，37℃，保温30分钟后，再加入修饰剂。
全文摘要
本发明采用底物L-门冬酰胺保护酶活性部位的方法，用单甲氧基聚乙二醇修饰抗肿瘤药物L-门冬酰胺酶，得到抗原性完全解除，酶活力仍可保持30～40％的高效抗肿瘤药物修饰L-门冬酰胺酶。该酶具有比天然酶体内、外半衰期长，抗胰酶水解能力强的优点。
文档编号C12N9/82GK1031563SQ87105819
公开日1989年3月8日 申请日期1987年8月25日 优先权日1987年8月25日
发明者程玉华, 曹淑华, 赵秋宇, 王树歧, 田洁 申请人:吉林大学