专利名称：对嗜中性白细胞和嗜曙红细胞的一个共同决定簇区域有特异性的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂交瘤细胞系，其所产生的单克隆抗体与白细胞中的嗜中性白细胞和嗜曙红细胞都能够结合。本发明因而使得在单独一个程序中选择性地从外周血样中排除嗜中性白细胞和嗜曙红细胞成为可能，以此程序采用其它技术可得到关于所余下的白细胞即淋巴细胞，嗜碱性细胞和单核细胞的数目的大量临床数据。此外，选择性排除的嗜中性白细胞和嗜曙红细胞可供进一步分析。
在人的循环系统中外周血液的细胞成份主要包括红细胞和白细胞。白细胞功能及其临床相关性在科学界已引起很大兴趣。白细胞族包括嗜中性白细胞，单核白细胞，嗜曙红细胞，嗜碱性白细胞和淋巴细胞。许多这些细胞类型具有数种功能亚型。
嗜中性白细胞，单核白细胞，嗜曙红细胞和嗜碱性白细胞统称为吞噬细胞，因为它们在人类免疫系统中的基本功能是吞噬或消化细菌和其它微生物。这些细胞产生自人的骨髓。然而，每种吞噬细胞都具有不同的功能，成为相关，但又是各自分离的系统。尽管起源于骨髓，吞噬细胞确实进入外周血液循环。
吞噬细胞体系的一般功能是通过对一种外源物质的免疫应答实现吞噬作用。嗜中性白细胞作为消灭被抗体所包被的细菌的吞噬细胞是非常有效的，但对没有抗体包被的细菌，则不十分有效。嗜中性白细胞的主要功能是通过对病原微生物定位，然后杀死它们来防止病原微生物的入侵。
吞噬细胞体系中嗜曙红细胞发挥作用的方式与嗜中性白细胞相似。在体外检验中，这两种白细胞可响应同一抗原刺激。然而，嗜曙红细胞的应答通常在吞噬作用和杀死细菌方面不如嗜中性白细胞那样有效。最近研究表明，嗜曙红细胞在预防慢性寄生感染中很重要，此时嗜中性白细胞不是十分有效。
嗜中性白细胞是骨髓中的最常见细胞，也是外周血液中最常见的白细胞。每微升正常全血样品平均含有5×103白细胞，其中3.075个嗜中性白细胞，150个嗜曙红细胞，25个嗜碱性白细胞，250个单核白细胞及1，500个淋巴细胞。已经认识到嗜中性白细胞在外周血液中的浓度对其正常浓度的偏离具有临床相关性。因此，嗜中性白细胞浓度增加，有时称为“嗜中性白细胞增多症”，可能是某些疾病或健康状况的标志;而外周血液中嗜中性白细胞浓度的降低，有时称为“嗜中性白细胞减少症”，则会具有另外的临床反应。在嗜曙红细胞的情况下，嗜曙红细胞在血样中的浓度若超过正常浓度，称为“嗜曙红细胞增多症”;若其在血样中浓度低于正常浓度，则称为“嗜曙红细胞减少症”。嗜曙红细胞增多症是与临床状况有关的，如变态反应状况，药物超敏反应和类白血病疾病。例如嗜曙红细胞减少症，有时是与正在进行的发炎反应有关的。
业已得到能对嗜中性白细胞特异的多种单克隆抗体。Reinherzetal，LeukocyteTypingⅡVolume3，HumanMycloidanceHematopoieticCells，Springer-Verlag，N.Y.1986;Girardetetal，AmericanJournalCancer，Vol.32，pp.177-183(1983);Bernsteinetal，theJournalofImmunology，Vol.128，N.2，pp876-881，(February)，1982;Skubitzetal.Blood，Vol61，N.1，pp.19-26，(January)，1983;Majdicetal，Blood，Vol.58，N.6，pp.1127-1133(December)，1981。公布在这些出版物中的单克隆抗体对于成熟和未成熟嗜中性白细胞表现出结合特异性，但尚未见到显示与嗜中性白细胞和嗜曙红细胞的唯一决定基区域的结合。
简言之，此处将叙述一种能产生相对于特定的表面蛋白质抗原的单克隆抗体的细胞系，此抗原表达在循环于人外周血液中的嗜中性白细胞和嗜曙红细胞上。已认识到此特异的单克隆抗体用于检测的其它附加优点。该单克隆抗体表现出对其它白细胞或其它的人外周血液细胞无反应性。该单克隆抗体是由一种杂交瘤细胞系产生的，其中一种融合参与者是从用人的粒细胞免疫的细胞得到的。
本发明所述单克隆抗体被命名为KC-48。它是由采用Kohler和Milstein所述的标准程序(Nature，256，495-497(1975))，将用人的粒细胞免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合而得的杂交瘤细胞得到的。
所用的人的粒细胞是专门制备的。用静脉穿刺采集人血，并用Ficoll-Hypaque梯度密度沉淀法从粒细胞和红血细胞中分离单核细胞，然后用常规方法将红血细胞和粒细胞分离。收集粒细胞，用低渗缓冲液将残余红细胞溶胞。将粒细胞悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以备免疫。
腹腔注射1×106个人的粒细胞至雄性BALB/C小鼠3次，每次间隔为2周。第3次注射10天后，再用5×106个粒细胞进行第4次注射。第4次注射3天后，杀鼠取脾，用常规技术收集脾细胞，得到单一的细胞悬浮液。
然后进行融合以形成杂交瘤。用在无血清培养基中以2个脾细胞对1个SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞的比例混合冲洗脾细胞，将这些细胞离心至球状，悬浮于40%聚乙二醇(分子量1500)溶液中，8分钟，37℃。然后除去聚乙二醇，细胞用HAT培养基稀释，并分散于微滴板中。
2周后仔细筛选培养物，以鉴别能与表达在嗜中性白细胞上的抗原反应，但不与嗜碱性白细胞，单核白细胞，淋巴细胞，血小板或红细胞反应的单克隆抗体，用细胞旋转(cytospin)制剂筛选除去那些不显示所需要的能在紫外荧光显微镜检术范围内检测到的特异性抗体。进一步用流动血细胞计数法检测该培养物，可成功地鉴别那些结合于只表达在粒细胞表面的抗原上的抗体，并能成功地鉴别不显示这种特异结合能力的其它抗体。最后，由于单克隆抗体强烈而明显选择性地结合到嗜中性白细胞上而得到鉴定，可用于进一步定性。该单克隆抗体用乌赫特朗尼氏凝胶双向扩散实验鉴定，其产生小鼠IgM免疫球蛋白。
本发明所例举的单克隆抗体被命名为KC-48，尽管与此抗体有关的实验数据也认定该单克隆抗体为CX-7H12-4。粒细胞表面抗原用乳过氧化物酶碘化作用标记。碘化后将该细胞溶解于Non Idet P-40溶胞缓冲液中，回收无颗粒上清液，用纯化的抗体或同型对照物免疫沉淀细胞蛋白质。结合于兔抗鼠IgM上的蛋白质A用来沉淀所得到的抗原-抗体复合物。然后将样品于5～15% SDS-PAGE凝胶上进行电泳，于X-射线胶片上检测放射性标记的蛋白质。KC-48抗体沉淀以下在还原条件下制备的来自125I标记的粒细胞膜上的三种蛋白质，分子量分别为170，000，135，000和99，000道尔顿。最黑的带是99，000道尔顿的那条带。
用流动血细胞计数法分析血细胞数目测出KC-48对嗜中性白细胞和嗜曙红细胞都有特异性。在一个实验中，证实该单克隆抗体与粒细胞具有很强的反应性，在Florida州Hialeah Coulter公司生产的Epics 流动血细胞计数器上显示平均通道为146。在流动血细胞计数器上只有10%阳性细胞比通道146明亮。通过选择控制相对细胞大小来分析血细胞数目，发现KC-48抗体不与血小板，红细胞，淋巴细胞或单核细胞结合。对单核细胞的选择控制，偶尔给出少量单核细胞/KC-48结合的数据，然而可证明这是由于流动血细胞计数器不能完全用光扫描方法从单核细胞区域将粒细胞排除的缘故。
还进行过确定KC-48抗体的其它特异性结合特征的实验。这些实验确定KC-48也将结合于具有嗜中性细胞特征的骨髓白血病细胞系上，该细胞系称为HL-60。见Girardetetal，Int.J.Cancer，32，177，1983，见上。该抗原的表达非常强，KC-48抗体对上述细胞的凝集作用极为明显。
实验表明，Raji(B细胞白血病)，Nalm-1(表面无标志细胞白血病)，K-562(红细胞白血病)，HEL(红细胞白血病)和HSB-2(T细胞白血病)不表达能被KC-48单克隆抗体识别的抗原。
用KC-48单克隆抗体进一步进行活性检测，方法是用流动血细胞计数器将被KC-48抗体染色为阳性的细胞分出。这些细胞在正向角光散射仪上选择控制，根据它们的相对荧光强度分类，这些实验证实KC-48单克隆抗体对嗜中性白细胞和嗜曙红细胞都有特异性，并且KC-48不与表达于淋巴细胞、单核白细胞及嗜碱性白细胞上的抗原相结合。
采用被KC-48单克隆抗体包被的磁珠进行检测，以确定有多少细胞会被这种抗体包被体排除。最初，对这种微珠进行滴定，以确定对嗜中性白细胞有最佳去除作用，而不去除其它吞噬细胞，如单核白细胞的最佳微珠体积。这种滴定还用于进一步的测定。
表1用单克隆抗体磁珠复合物排除外周血样成份分类计数对照KC-48淋巴细胞 24.8(5.0)a79.4(5.7)单核白细胞7.4(2.5)18.0(5.5)嗜中性白细胞63.7(5.7)0.0(0.0)嗜曙红细胞3.3(1.2)0.0(0.0)嗜碱性白细胞0.7(0.6)2.0(1.7)注a＝平均(标准偏差)，每分类500细胞。
n＝9
分别进行的实验结果列于表1。该表结果表明KC-48抗体包被的磁珠将从外周血液细胞群体中将嗜中性白细胞和嗜曙红细胞分离出来，而并不显著地排除或结合其它白细胞。不表达KC-48抗原的细胞富集在分离后的样品中，富集倍数约3倍。
能产生KC-48单克隆抗体的一种杂交细胞系样品于1987年11月6日贮存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852)，登录号A.T.C.C.N.HB9584。
由于其对人的嗜中性白细胞和嗜曙红细胞的显著特异性，KC-48单克隆抗体是独特的。该抗体对其它人外周血液细胞不表达特异性。由于该抗体对嗜中性白细胞具有很强特异性，并能识别由嗜曙红细胞表达的该抗原，所以用任何方法如免疫荧光法和免疫化学法检测粒细胞将非常容易。该单克隆抗体在用流动血细胞计数技术对正常全血和白血病患者血样中的嗜中性白细胞和嗜曙红细胞的检测和计数工作中将是十分有用的。该单克隆抗体看来还有结合某些白血病细胞的用途。KC-48抗原在嗜中性白细胞和嗜曙红细胞上的强烈表达使得该抗体可用于有效地从人外周血样中分离嗜中性白细胞和嗜曙红细胞，从而使富集了淋巴细胞的样品能被其它方法更为精确地计数。淋巴细胞，嗜碱性细胞和单核白细胞的这种富集对于嗜碱性细胞的富集显得尤其重要，嗜碱性细胞包括全血样中一种非常小的难于检测的细胞成份。如此将嗜中性细胞和嗜曙红细胞排除，剩余嗜碱性细胞样品的富集，使之从在全血样中无法检测变为占总细胞的2.1%。
事实上所有以前报道过的能与嗜中性白细胞反应的单克隆抗体也不显示与嗜曙红细胞的反应性。因此，KC-48单克隆抗体是独特的。
权利要求
1.一种用杂交瘤技术产生的细胞系，其能生产一种特异地结合于嗜中性白细胞和嗜曙红细胞的KC-48抗原上的单克隆抗体。
2.权利要求1所述细胞系，其中所述产生抗体的细胞是从用人的粒细胞免疫的小鼠得到的。
3.权利要求1所述细胞系，其中所述产生抗体的细胞是用人的粒细胞免疫的小鼠脾细胞。
4.权利要求1所述细胞系，其中所述单克隆抗体的另一特征为对人的其它外周血液细胞显示无反应性。
5.一种用杂交瘤技术得到的细胞系，具有贮存在ATCC的样品HB9584的基本特征，即产生抗嗜中性白细胞和嗜曙红细胞上的KC-48抗原的抗体。
6.一种单克隆抗体，其特异性结合于嗜中性白细胞和嗜曙红细胞表面的一种抗原上，称之为KC-48，该KC-48单克隆抗体的进一步特征为，不与下列细胞结合A.人急性白血病细胞B.人其它外周血液细胞且不显著地与骨髓中粒细胞前体结合。
7.权利要求6所述单克隆抗体，其是用杂交瘤技术得到的，其中小鼠脾细胞是用人的粒细胞免疫的。
8.权利要求6所述单克隆抗体，其是由具有ATCC贮存号为HB9584样品的基本特征之细胞系产生的。
9.权利要求1所述细胞系，其中所述KC-48抗原的进一步特征为对抗原进行电泳方法测定，并将抗原的移动与已知分子量的已知蛋白质相比较，测得分子量为170，000，135，000和99，000道尔顿。
10.权利要求9所述细胞系，其中所述方法用于该抗原，采用在还原条件下制备的放射性同位素标记的粒细胞膜。
11.权利要求10所述细胞系，其中99，000道尔顿的带是三条确定的带中最黑的一条。
12.权利要求6所述单克隆抗体，其中所述KC-48抗原的进一步特征为，用电泳方法测得分子量分别为170，000，135，000和99，000道尔顿，此结果是在将抗原移动与已知分子量的已知蛋白质比较后得到的。
13.权利要求12所述单克隆抗体，其中所述方法用于该抗原，采用在还原条件下制备的放射性同位素标记的粒细胞膜。
14.权利要求13所述单克隆抗体，其中99，000道尔顿的带是所确定的三条带中最黑的一条带。
全文摘要
一种杂交细胞系，其能产生对人类嗜中性白细胞和嗜曙红细胞非常特异的单克隆抗体，并对淋巴细胞，嗜碱性白细胞和单核细胞不显示特异性。此外，其与急性白血病细胞无反应性。在杂交瘤融合中，小鼠脾细胞是经人类粒细胞免疫的。该单克隆抗体还可用于对正常外周血液中，并有可能用于急性白血病患者血液中嗜中性白细胞的计数和分离。
文档编号C12N5/10GK1030610SQ8810399
公开日1989年1月25日 申请日期1988年6月29日 优先权日1987年6月30日
发明者肯耐斯·H·科特里特, 大卫·E·赫夫海恩兹, 加里·P·托得特 申请人:科特公司