专利名称：结晶白细胞介素-4的制作方法
细胞产生的白细胞介素-4(IL-4)最初被描述为一种能辅助刺激活化B细胞增殖的鼠型因子(Howard等，J.Exp.Med.155∶914，1982)。随后证实，鼠型IL-4能够对B细胞(Paul等，Ann.Rev.Immunol.5∶429，1987;Noelle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81∶6149，1984;Roehm等，J.Exp.Med.160∶679，1984;Vitetta等，J.Exp.Med.162∶1726，1985;Coffman等，J.Immunol.136∶4538，1986;Coffman等，J.Immunol.136∶949，1986)及包括T细胞(Mosmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83∶5654，1986;Fernandez-Botran等，J.Exp.Med。164∶580，1986;Hu-Li等，J.Exp.Med.165∶157，1987;Grabstein等，J.Immunol.139∶1148，1987;Zlotnick等，Proc.Natl.Acad.Sci。USA 84∶3856，1987)、造血母细胞(Rennick等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84∶6889，1987;Peschel等，Blood 70∶254，1987)和肥大细胞(Mosmann，同上)在内的其它细胞类型产生多种生物学效应。
根据鼠型IL-4的同源性，已克隆出了编码人白细胞介素-4(huIL-4)的cDNA(Yokota等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83∶5894，1986)，并在哺乳动物宿主(Le等，J.Biol.Chem.263∶10817，1988;Sonoda等，J.Biotechnology 9∶61，1988;Takebe等，Mol.Cell Biol.8∶466，1988)和细菌宿主(Van Kimmenade等，Eur.J.Biochem.173∶109，1988)中进行了表达。和鼠型IL-4一样，重组huIL-4(rhuIL-4)也是一种对多种细胞类型有作用的多效性淋巴细胞活素。例如，rhuII-4能够诱导活化T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖(Spits等，J.Immunol.139∶1142，1987;DeFrance等，J.Immunol.139∶1135，1987)，增强Ⅱ类主要组织相容性抗原和B细胞上IgE的低亲和性受体的表达(Rousset等，J.Immunol.140∶2625，1988;DeFrance等，J.Exp.Med.165∶1459，1987)，诱导IgE和其它免疫球蛋白的产生(Pene等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 85∶6880，1988)。rhuIL-4能够抑制B细胞来源的慢性淋巴细胞性白血病细胞的IL-2依赖性增殖，这提示它可临床应用于B细胞肿瘤(Karray等，J.Exp.Med.168∶85，1988)。
毫克量纯化rhuIL-4的可得性促进了有关该蛋白质的结构和结构-功能关系研究的开展。本发明涉及结晶rhuIL-4产生条件的发现。本发明进一步涉及结晶rhuIL-4本身。该晶体适于进行X射线衍射研究，并可应用于rhuIL-4的纯化和配制。
本发明就其最宽的方面而言，涉及结晶形式的白细胞介素-4。
本发明进一步涉及结晶形式的人白细胞介素-4。
本发明进一步涉及结晶形式的、用重组DNA技术产生的人白细胞介素-4。
本发明进一步涉及可能是糖基化的或非糖基化的、结晶形式的白细胞介素-4。
本发明进一步涉及一种产生白细胞介素-4晶体的方法，该方法包括，从含有硫酸盐或柠檬酸盐的pH5-7缓冲水溶液中结晶出白细胞介素-4。
本发明的结晶白细胞介素-4可用于X射线晶体学分析，还可用于制备用于治疗对白细胞介素-4治疗敏感的任何医学症状的药物组合物。
为说明本发明的实施，在大肠杆菌中表达了成熟形式的huIL-4。同样可以采用其它IL-4及其它形式的rhuIL-4。用常规色谱法(Le等，同上)从细胞上清液中纯化出rhuIL-4。在24孔组织培养皿(Multiwell，Becton Dickenson & Co，Lincoln Park，NJ)中进行悬滴蒸气扩散实验。使含有20毫克/毫升huIL-4、15-20%饱和的硫酸铵、40mM磷酸钠(pH6.0-7.0)的液滴(6μl)，从扣在24孔组织培养皿上的硅化盖玻片上悬下。使这些液滴在12或22℃下与1毫升30-40%饱和的硫酸铵、40mM磷酸钠(pH6.0-7.0)平衡。在预先设定在12°或22℃的REVCO环境实验室中进行控温保温。
用分光光度法在278nm测定rhuIL-4在各种缓冲液中的浓度，所采用的消光系数为0.57/cm/mg/ml。按Laemmli的方法(Nature 227∶680，1970)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在Rainin C4柱(4.6×250nm;Dynamax，300埃)上进行反相HPLC，用乙腈在0.1%三氟乙酸中的线性梯度展开。如前人所述用人外周血淋巴细胞进行T细胞增殖活性的测定(Yokota等，同上)。为进行X射线研究，将大四方晶体装在玻璃毛细管中，利用从Rigaku RU-300旋转阳极发出的CuKα辐射，在22℃下用回摆相机拍照。在Nicolet X-100A特定范围放射线检测器上利用相同的辐射源取得一套完整的原始数据。
如前面所指出的，为了举例说明，本发明所述的结晶人白细胞介素-4为得自大肠杆菌的重组人白细胞介素-4。该蛋白质的一级结构为5 10 15 20 25 301HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVT31DIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHE61KDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNL91WGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIM121REKYSKCSS用硫酸铵作沉淀剂已使rhuIL-4结晶出针状和大四方状晶体。在含有34%硫酸铵的40mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中，于12℃下保温21天后，可达到最佳的结晶效果。在pH值在5.0-7.0范围，硫酸铵浓度在30-40%饱和范围时，在磷酸钠中也观察到四方晶体。
进行结晶时的pH范围为5-7，优选5.5-6.5，最优选的是约pH6.0。温度可在约5-25℃的范围，优选12-22℃，最优选的是约12℃。平衡态时蛋白质的浓度应为约5-60mg/ml，优选30-50mg/ml，最优选的是约40mg/ml。
在12℃-22℃下保温的时间可在2-20天之间变化。预计这里所述的结晶方法也可用于结晶得自其它宿主细胞(如培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和其它细胞)的rhuIL-4或得自天然来源(如人外周血淋巴细胞或者构成性地产生huIL-4的人细胞系)的huIL-4·预计该方法还将适用于得自其它物种的同源白细胞介素-4蛋白。
已在室温下(22-25℃)从悬滴中分离出了结晶rhuIL-4，并在55%硫酸铵、40mM磷酸钠缓冲液(pH6.6)中进行了彻底洗涤。重新溶解于含0.15M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中后，晶体呈现出与未结晶过的对照rhuIL-4样品相同的T细胞增殖活性(2.0×107单位/毫克)。进行SDS-PAGE时，重新溶解的rhuIL-4晶体的电泳迁移率与对照样品相同。同样，重新溶解后晶体的反相HPLC洗脱图形与对照样品的洗脱图形很难区分。没有由于在22℃下长时间保温而造成蛋白质的明显降解。更为重要的是，经过结晶过程后再重新溶解于生理缓冲液中，并未使rhuIL-4的T细胞增殖活性失活。
首先用特定范围放射线检测器以2.7
的分辨率取得X-射线衍射数据。回摆框覆盖0.25，测量10分钟。用XENGEN处理程序进行强度数据的指标化和积分(Howard等，J.Appl.Crystal-logr.20∶383，1987)。数据在四方晶系中指标化，其中a＝92.1(2)，b＝92.1(7)，c＝46.5(1)
。空间群为P4212或P42212。
对白细胞介素-4进行后续的X射线回摆照相证实了该空间群和晶胞参数。这些四方晶对X射线稳定，在室温下至少衍射5天，衍射分辨率至少为2.7
。
大规模的结晶可以用相当于蒸气扩散的方法，即透析法和超滤法来进行。一旦建立了最佳实验条件，便可以用由悬滴实验得到的晶种来加速大规模结晶。虽然优选使用硫酸铵作沉淀剂，但也可用其它常用的硫酸盐和柠檬酸盐来代替，如硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁;柠檬酸钠，以及其它柠檬酸盐(McPherson，《蛋白质晶体的制备和分析》，1982，John Wiley & Sons，New York，New York)。可以在临床制备过程中引入大规模结晶rhuIL-4的操作作为最终的纯化步骤和/或浓缩步骤。由于这些晶体与在含防腐剂溶液中贮存的rhuIL-4相比具有固有的稳定性，以结晶形式长期贮存大批的rhuIL-4药物也是很理想的。
由上述方法制备的晶体对药物剂型的制备也构成一种特别有利的形式。例如，这些晶体可用作rhuIL-4体内缓释制剂的基础。据认为，可以先形成金属(例如锌或铁)与huIL-4的配合物，然后再结晶。这些配合物的晶体也可用于含有适当药用添加剂的缓释蛋白制剂中。类似的缓释蛋白制剂的例子有锌-胰岛素结晶配合物(《Remington药物学》，1985，Gennaro，A.R.编，Mack Publishing Co.，Fasten，Pennsylvania，974-976页)和锌-胰岛素-鱼精蛋白结晶配合物(《制药大全》，1989，Sj tig，M.编，820-821页)。
含有本发明结晶白细胞介素-4的缓释药物组合物可如下制备将这种白细胞介素-4与如上所述的金属和/或蛋白配位剂混合。
权利要求
1.结晶形式的白细胞介素-4。
2.权利要求1的白细胞介素-4，它是人白细胞介素-4。
3.权利要求1或2的白细胞介素-4，它是由重组DNA技术产生的。
4.权利要求1-3中任一项的白细胞介素-4，它是非糖基化的。
5.权利要求1-3中任一项的白细胞介素-4，它是糖基化的。
6.权利要求2的白细胞介素-4，它是在大肠杆菌中产生的。
7.产生白细胞介素-4晶体的方法，该方法包括，在含有硫酸盐或柠檬酸盐的pH5-7缓冲水溶液中，将白细胞介素-4保温足以形成白细胞介素-4晶体的一段时间。
8.权利要求7的方法，其中缓冲溶液含有硫酸铵，pH6.0。
9.一种药物组合物，它包含如权利要求1-6中任一项所述的结晶形式的白细胞介素-4，该白细胞介素-4已与一种金属和/或蛋白配位剂配合。
10.一种制备如权利要求9所述的药物组合物的方法，该方法包括，使结晶形式的白细胞介素-4与一种金属和/或蛋白配位剂混合。
11.如权利要求1-6中任一项所述的结晶形式的白细胞介素-4在制备一种药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗对白细胞介素-4治疗敏感的医学症状。
12.如权利要求1-6中任一项所述的结晶形式的白细胞介素-4在治疗对白细胞介素-4治疗敏感的医学症状中的应用。
13.一种对具有对白细胞介素-4治疗敏感的医学症状的个体进行治疗的方法，该方法包括，给该个体服用有效量的、如权利要求1-6中任一项所述的结晶形式的白细胞介素-4。
全文摘要
叙述了一种从含有硫酸盐或柠檬酸盐的溶液中结晶重组人白细胞介素-4(rhuIL-4)的方法。该结晶形式适于进行X射线衍射，并在包括纯化、配制和制造在内的许多药学方法中具有广泛的应用。
文档编号C12N15/09GK1057268SQ9110394
公开日1991年12月25日 申请日期1991年6月13日 优先权日1990年6月15日
发明者杰拉尔德·S·哈蒙德, 洪·V·李, T·L·纳加布胡山, 保罗·赖歇特, 保罗·P·特罗塔 申请人:先灵公司