专利名称：粒细胞菌落刺激因子的突变蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及在含174氨基酸的成熟粒细胞刺激因子G-CSF的50到56位点上在序列50 51 52 53 54 55 56Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile中或在含177氨基酸的成熟G-CSF-的53到59位点上或/和在含174氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156和170位点上或在含177氨基酸的成熟G-CSF的46，82，159或173位点上的至少4个His残基中的一个发生突变的粒细胞刺激因子G-CSF的突变蛋白。
淋巴因子与血细胞的成熟有关。它们刺激骨髓干细胞成熟成为完全分化细胞。G-CSF是由活化的单核白细胞、巨噬细胞及一系列其他细胞系合成的。
已经将G-CSF从人膀胱癌细胞系5637的细胞培养上清液中纯化为同质型(Welte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci 82(1985)，1526).编码天然G-CSF的cDNA序列已从Sunza et al.，Science 232(1986)，61中得知。作为在第二基因内区可变拼接的结果，G-CSF的两个自然发生区与前30个氨基酸代表一个信号肽的204或207个氨基酸同时存在，(Lymphokines，IRL Press，Oxford，Washington D.C.，Editors D.Male and C.Rickwood)，这种天然蛋白质的分子量大约为19.6KD，并有5个能形成分子内或分子间二硫键的半胱氨基残基，结合研究表明，G-CSF与中性粒细胞结合，与红血球、淋巴嗜酸性细胞系以及与巨噬细胞没有观察到或只观察到有微弱的结合，G-CSF受体由一个分子量为150KD的单肽链组成(Nicola，Immunol.Today 8(1987)，134)，每个细胞的受体数通常随细胞的成熟而增加并能达到每个细胞数百个。据推测，淋巴因子受体是由一个结合配体细胞外区、一个疏水运输膜区以及一个细胞内区组成。淋巴因子与其受体的结合能导致环核苷酸的合成，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇酯的水解以及蛋白激酶C的活化和细胞内钙水平的提高。有趣的是这些过程如何影响细胞的代谢，但目前仍很难理解，配体与它的受体结合的进一步的结果是通过一种受体依赖的细胞内吞作用，将受体一配体复合体迁移到细胞内。显然淋巴因子(即G-CSF)也发生这种类型的内化，然而，细胞代谢的结果仍不清楚。
由于G-CSF能够在短时期内，大量提高中性粒细胞的数量，可考虑把G-CSF用于治疗学领域，因此，G-CSF可能用于例如癌化学疗法后，免疫系统的细胞被破坏。另外G-CSF能用于骨髓移植、严重的灼伤、因免疫缺失而引起的机会致病菌的感染以及白血病，为了不同类型的治疗有必要发展高活性和低活性型的G-CSF。本发明的目的是通过点突变的特点特异导入而发展具广谱活性的G-CSF分子。在这一过程中，活性的改变将通过尽可能小的氨基酸序列的改变来达到。
本发明的目的是通过对粒细胞刺激因子(G-CSF)或G-CSF变异体，在有174个氨基酸的成熟G-CSF的Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile序列中的50到56位点上或在有177氨基酸的成熟G-CSF的53到59位点上的一个或几个氨基酸进行诱变处理或/和对174氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156或170位点上或177氨基酸的成熟G-CSF46，82，159或173位点上，4个组氨酸中的至少一个进行诱变处理而达到的。
新氨基酸的意外导入产生了有广谱活性的G-CSF突变蛋白。活性的测定可按照例如Biochem.J.253(1988)213-218;Exp.Hematol.17(1989)116-119;Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)5010完成。
按照本发明，术语G-CSF或G-CSF变异体包括所有有或没有前导序列的G-CSF的自然产生的变异体以及通过DNA重组技术修饰从它衍生出的G-CSF蛋白质。特别是除G-CSF部分外还含有多聚肽序列的融合蛋白质。在这种意义上，G-CSF突变蛋白优选的是在位置-1上带有N末端Met残基，以适合在原核细胞中表达。另外优选的是一个重组体，即能按照PCT/EP91/00 192生产的甲硫氨酸一游离的G-CSF变异体。术语“诱变处理”是指使有关的氨基酸缺失或最好是被其他氨基取代。
在这种意义上，G-CSF突变蛋白优选的是在其中序列Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile的7个氨基酸中的一个被其他氨基酸取代。不过也可取代多于一个特别是两个氨基酸。
一个G-CSF突变蛋白特别优选的是在有174个氨基酸的成熟G-CSF的53位上的Ser残基，或有177个氨基酸的成熟G-CSF的56位上的Ser残基被基他19种氨基酸中的一种，特别是被Thr取代。
另外，优选的是在具有174个氨基酸的成熟G-CSF的54位上或具有177个氨基酸的成熟G-CSF的57位上的Leu残基，被19种其他氨基酸中的一种，特别是被Thr取代，通过这种方法，可以获得有G-CSF活性的广泛变异的G-CSF突变蛋白。
另外，G-CSF突变蛋白优选的是在具有174个氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156，或170位点上或有177个氨基酸的成熟G-CSF的46，82，159或173位点上的4个His残基中的一个被其他氨基酸特别是Gln取代。
本发明也提供了编码了本发明G-CSF突变蛋白的一个重组DNA，本发明还提供了含有本发明的重组DNA至少一个拷贝的重组载体，在这方面，重组载体优选的是适合于在原核细胞中基因表达的重组载体。这种类型的载体是本领域专业人员熟知的。
另外本发明提供了一个用本发明的一个重组DNA或/和本发明的重组载体转化的细胞，这种细胞优选的是原核细胞，特别是E.Coli细胞。
本发明也提供了一个用于生产本发明的重组DNA的方法，在该方法中一个编码了G-CSF或G-CSF变异体的DNA系列被位点特异地诱变，用于位点特异诱变的分子生物学方法是本领域技术人员熟知的，诱变最好是通过在作为模板的单链DNA上使用作为诱变引物的合成寡核苷酸完成，普通方法例如被描述在Amersham No.1523“Oligonu-cleotide-directed in vitro mutagenesis system”;Mechods in Enzymology(Academic Press，Inc.Vol.154，Part E，367-382(1987);Analytical Biochemistry 179(1989)309-311。
另外，本发明提供了一个用于生产本发明的G-CSF突变蛋白的方法，其中，一个细胞被用本发明的重组DNA或/和本发明的重组载体转化，被转化后的细胞在合适的培养基中培养并从细胞或培养基中分离该蛋白质，常用的从真核或原核细胞分离重组蛋白质的分子生物学方法是本领域专业人员熟知的，不需详细说明。
最后，本发明还提供了一种基于以本发明的G-CSF突变蛋白药物制剂为活性物质的药物制剂，如果需要，还含有常用的药用载体，填充剂和辅助物质，这样的药物制剂特别适于本申请上述提到的治疗领域，并进一步适于刺激中性粒细胞形成的治疗过程。
下列的实施例打算说明本发明，但并不限制它的范围。
实施例1.载体mg1-G-CSF-Bg的产生通过一个平整末端，把含有Shine Delgarno序列的来自载体pKK177-3 G-CSF-Bg(DSM 5867)的554bp长的EcoRⅠ/BamHⅠ片段、ATG密码子以及编码G-CSF基因的序列克隆连接到载体pPZ07-mg1 1ac(WO88/09373，Figure 10)的NcoⅠ切割位点。在用绿豆核酸酶(Pharmacia)培育之前预先消化在NcoⅠ消化后定位于突出的单链上的LacZ基因的ATG起始密码。所得的载体即为mg1-G-CSF-Bg。
实施例2在Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile序列中氨基酸Leu(X)的诱变诱变处理是在M13模板上根据已知技术(Amersham No.1523“Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis-system)完成的。
经切割位点BstⅪ/AatⅡ，分离251bp长的G-CSF cDNA片段，突出的单链用绿豆核酸酶(Pharmacia)消化掉并将该片段克隆到用EcoRⅠ/SmaⅠ切割的M13mp19载体上(EcoRⅠ的突出的单链填平后用于平整末端克隆)。制备单链DNA后，寡核苷酸与这个单链DNA杂化并使用Klenow多聚酶连接酶和4种三磷酸核苷酸(GTP，CTP，TTP，ATP)按5′→3′寡核苷酸的方向使之延长。现在已是双链的DNA被转化到携带F′附加体的E.coli细胞，以便使通过菌丝状的M13噬菌体的感染成为可能(例JM101，可从Stratagene中获得，LaJolla，California)。检出单独斑点，并获得其中的诱变后的M13噬菌体以用于单链DNA的制备，按已知技术完成DNA定序(如按照Sanger的二脱氧方法)并以这种方法检测形成所需要的突变的确切的取代。制备双链DNA后将G-CSF的突变AvaⅠ片段分离并克隆在表达型载型mgl-G-CSF-Bg中(用AvaⅠ切割)。
为了重建完整的G-CSF基因，DNA随后用HindⅢ切割，突出末端用Klenow多聚酶补平然后用AvaⅠ部分消化，使得在G-CSF基因(约130bp)上5'的AvaⅠ位点不被切割。这个DNA与来自初始的载体mgl-G-CSF-Bg的AvaⅠ/BamHⅠ的约240bp的G-CSF片段连接(BamHⅠ位点用Klenow多聚酶补平)。
转化到E.coli TM83中后，按在W088/09373中描述的方法完成G-CSF的表达。
使用的cDNA有一个编码175氨基酸G-CSF的序列(没有一个单序列，但在-1位有一个Met残基)因此优选的突变是在G-CSF氨基酸序列的54位的Leu上(在此，N-末端的Met残基不算在内)。
编码子该50到56氨基酸的编码G-CSF的cDNA的序列，(与有174氨基酸G-CSF相关)读作Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile5'-CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC-3'相关的互补相反链突变后读作
5'-GAT GCC CAG AGA GTG TCC GAG-3'下列19种寡核苷酸相当于相反链，被用于点直接突变。
野生型5'→3 GAT GCC CAG AGA GTG TCC GAG 3'MET1. 5' GAT GCC CAT AGA GTG TCC GAG 3'Phe2. 5' GAT GCC GAA AGA GTG TCC GAG 3'Gln3. 5' GAT GCC CTG AGA GTG TCC GAG 3'Glu4. 5' GAT GCC CTC AGA GTG TCC GAG 3'Asp5. 5' GAT GCC GTC AGA GTG TCC GAG 3'Cys6. 5' GAT GCC GCA AGA GTG TCC GAG 3'Ala7. 5' GAT GCC GGC AGA GTG TCC GAG 3'Gly8. 5' GAT GCC AGG AGA GTG TCC GAG 3'His9. 5' GAT GCC GTG AGA GTG TCC GAG 3'Ile10. 5' GAT GCC GAT AGA GTG TCC GAG 3'
Lys115' GAT GCC CTT AGA GTG TCC GAG 3'Tyr125' GAT GCC ATA AGA GTG TCC GAG 3'Asn135' GAT GCC GTT AGA GTG TCC GAG 3'Pro145' GAT GCC GGG AGA GTG TCC GAG 3'Arg155' GAT GCC GCG AGA GTG TCC GAG 3'Ser165' GAT GCC GGA AGA GTG TCC GAG 3'Thr175' GAT GCC GGT AGA GTG TCC GAG 3'Val185' GAT GCC GAC AGA GTG TCC GAG 3'Trp195' GAT GCC CCA AGA GTG TCC GAG 3'实施例3具有改进了活性的G-CSF的产生通过174氨基酸G-CSF53位上的丝氨酸被苏氨酸取代后产生的G-CSF比野生型有更好的酶活性(在Gly-His-Ser-Leu-Gly序列中的丝氨酸)下面的双链寡核苷酸用于诱变。
His Thr Leu Gly Ile5' CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC ACC CTG GGC ATC CCC3' C CTC GAC CAC GAC GAG CCT GTG TGG GAC CCG TAG GGGTGG GCT CCC CTG AGC 3'ACC CGA GGG GAC 5'为了克隆化，把来自载体pKK177-3G-CSF-Bg(DSM5867)的G-CSF cDNA片段(约300bp，EcoRⅠ/EcoRV)连接到载体pUC19(Yannish-Perron et al.，(1985，Gene33，103)的EcoRⅠ/SmaⅠ切割位点。
用AvaⅠ/SacⅠ切割这个DNA并与如上描述的引物对按常规技术直接相连。现在可以从这个结构中分离出突变的BstⅨ/SacⅠ片段并克隆到载体pKK177-3 G-CSF-Bg(DSM5867)(用BstⅪ/SacⅠ切割)中，表达克隆的最后构建按与例1类似的方法完成，活性的测定按例5中描述的完成。
实施例4由于非活性中心的氨基酸的变异，G-CSF的酶性质的改变与已知的丝氨酸酯酶类似，据推测活性中心的丝氨酸与组氨的相互配合以促使酶活性的形成。在G-CSF序列中存在4个组氨酸，也就是在43，79，156和170位点上(编号是根据没有信号肽的含174个氨基酸序列得到的)。在此诱变中，52位上(或177个氨基酸的55位点上)的组氨酸残基不考虑在内，在此方法中，His(CCA CTA)被Gln(CAG)取代，相反链序列上相应编码Gln的密码是CTG。
按照如在例1中描述的方法将G-CSF片段次克隆到M13mp19中。
下列相当于相反链的寡核苷酸，用于诱变1.5′GCT CCT GGG CTG GCA CAG C 3′组氨酸43成为谷氨酸43。
2.5′GAA AAG GCC GCT CTG GAG TTG GCT C 3′组氨酸79成为谷氨酸79。
3.5′GCT CTG CAG CTG GCC TAG CAA CC 3′组氨酸156成为谷氨酸156。
4.5 GGG CTG CGC AAG CTG GCG TAG AAC G 3′组氨酸170成为谷氨酸170分析方法和在表达型载体中的再克隆以类似于例1中的方式完成。
实施例5G-CSF活性的测定参照Biochem J.252(1988)213-218.Exp.Hematol 17(1989)116-119.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)5010中的描述，用对G-CSF完全依赖的鼠白血病系NSF-60作G-CSF的活性测定，为了保持细胞的该因子依赖性，用于保持培养的培养基(RPMI medium，Boehringer Mannheim GmbH，Order No.2099445含10%的胎小牛血清)一直保持含1000u/ml G-CSF。
被G-CSF刺激的NSF60细胞的增殖，通过胸苷-3H的掺入在这个实验中直接测量，实验如下完成将处于指数生长期的NSF60细胞(细胞浓度最大为1×105cell/ml)转移到微滴盘(1×104cell/well)并用提高的G-CSF浓度进行培养。在每个孔中的最大剂量相当于在保持培养中的浓度(1000V/ml，比活性1×108U/mg蛋白)，以10倍为一级稀释。
24小时培养后加入胸苷一3H(0.1uci/well)。然后，进一步培养16小时。
为了评价该实验，将微滴板上的细胞冷冻以溶解它们。把细胞的溶解产物吸到一个玻璃纤维过滤器上，漂洗，干燥并用闪烁计数器测量。胸苷-3H的掺入量与G-CSF刺激的NSF60细胞的增殖成比例。
实施例6取代G-CSF活性中心的氨基酸对其活性的影响在G-CSF54位上氨基酸的修饰可以通过54位上苏氨酸对亮氨酸的取代而产生(在序列Gly-His-Ser-Leu-Gly中的Leu)，与此相应的方法描述在实施例3中，即在适当的位点上，使用一个合适的含编码苏氨酸的核苷酸三联体密码(例如ACC)的双链寡核苷酸，在这个联结位点上，174氨基酸形式的G-CSF的54位点相当于177氨基酸形式的57位点。
在NSF60细胞实验中(见实施例5)，在54位点上为Thr的174氨基酸的突变体的活性与174氨基酸的G-CSF野生型相比是减弱的。另外，这个G-CSF突变体的活性与在53位有一个苏氨酸取代丝氨酸的G-CSF突变体相比是减弱的(见实施例3)。
权利要求
1.粒细胞刺激因子(G-CSF)或G-CSF变异体，其中，有174氨基酸的成熟G-CSF的50到56位上的序列
中或有177氨基酸的成熟G-CSF的53到59位上的序列的一个或几个氨基酸或/和有174个氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156或170位点上或在有177个氨基酸的成熟G-CSF的46，82，159或173位点上的4个组氨酸残基中至少一个被诱变。
2.权利要求1所要求的G-CSF突变蛋白，其中，它在-1位含一个N-末端Met残基。
3.权利要求1或2所要求的G-CSF突变蛋白，其中序列Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile中的一个氨基酸被另外一个氨基酸取代。
4.权利要求1到3之一所要求的G-CSF突变蛋白，其中，有174个氨基酸的成熟G-CSF的53位或有177个氨基酸的成熟G-CSF的56位上的Ser残基被别的氨基酸取代。
5.权利要求4所要求的G-CSF突变蛋白，其中，其他的氨基酸是Thr。
6.权利要求1到3之一所要求的G-CSF突白蛋白，其中，在有174氨基酸的成熟G-CSF的54位上或在有177氨基酸的57位上的Leu残基被别的氨基酸取代。
7.权利要求6所要求的G-CSF突变蛋白，其中其他氨基酸是Thr。
8.权利要求1或2中所要求的G-CSF突变蛋白，其中，在有174氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156或170位上或在有177氨基酸的成熟G-CSF的46，82，159或173位上的4个组氨酸残基中的一个被别的氨基酸取代。
9.权利要求8所要求的G-CSF突变蛋白，其中别的氨基酸是Gln。
10.重组DNA，其中，它编码了权利要求1到9中所要求的任一个G-CSF突变蛋白。
11.重组载体，其中它含有至少一个如权利要求10中所要求的重组DNA的拷贝。
12.权利要求11中所要求的重组载体，其中它适于在原核细胞中的基因表达。
13.细胞，其中它用如权利要求10中所要求的重组DNA或/和如权利要求11或12中所要求的重组载体转化。
14.权利要求13中所要求的细胞，其中它是原核细胞。
15.权利要求10所要求的重组DNA的生产方法，其中编码G-CSF或G-CSF变异体的DNA序列是被点特异诱变的。
16.权利要求15中所要求的方法，其中合成的寡核苷酸被用作诱变引物。
17.生产权利要求1到9中所要求的任一种具有G-CSF活性的蛋白质的方法，其中将一种细胞用一种权利要求10中所要求的重组DNA或权利要求11或12中所要求的重组载体转化，该转化细胞在合适的培养基中培养并将蛋白质从细胞或培养基中分离。
18.药物的制备方法，特征在于以权利要求1至9中所要求的任意一种或几种G-CSF作为活性物质，如果需要，加入常用的药用载体，填充剂和辅助物质。
19.将权利要求1到9之一中所要求的一种G-CSF突变蛋白用于免疫治疗。
全文摘要
一种粒细胞刺激因子(G-CSF)或一种不同于天然G-CSF的G-CSF变异体，其中在有174氨基酸的成熟G-CSF的50至56位的序列或有177氨基酸成熟G-CSF的53至59位上序列中的一个或几个氨基酸或/和在有174氨基酸的43；79；156或170位上或有177氨基酸的46；83；159或173位上的4个组氨酸残基中的至少一个被诱变。它适于免疫治疗。
文档编号C12N1/21GK1057862SQ91103929
公开日1992年1月15日 申请日期1991年5月8日 优先权日1990年5月8日
发明者冈瑟·舒马赫, 卡罗拉·多尼 申请人:伯伦格·曼海姆有限公司