专利名称：番木瓜蛋白酶精酶纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明为一种纯化番木瓜蛋白酶精酶的工艺。
番木瓜未成熟果实表皮中的乳汁是制造番木瓜蛋白酶的主要原料。当切开果实表皮后，番木瓜乳汁便从刀口流出。收集这些流出的乳汁并蒸发去除其中所含的水份后，得到的干燥物是番木瓜蛋白酶粗酶。番木瓜乳汁中除了含大约18%的水以外，主要是番木瓜蛋白酶，橡胶、果胶和一些脂溶性物质等生物大分子物质，以及生物碱、基异硫氰酸盐，糖类和一些无机盐等生物小分子物质，纯化番木瓜蛋白酶精酶的过程，就是去除各种生物大分子和小分子不纯物，分离纯化番木瓜蛋白酶并最大限度地保持酶活力的工艺过程。
在分离纯化过程中，最困难的是去除不溶性的亲水和亲脂胶体颗粒。这些胶体颗粒体积极小，若用过滤法分离，很容易堵塞过滤介质的通道，因而过滤效率往往很低。若加入像滤棉、纸粕这样的助滤剂并使用加压或真空法进行过滤，由于这些助滤剂的不抗压缩性，因而收效甚微。因为番木瓜蛋白酶属于对一些金属离子十分敏感的硫氢基蛋白酶类型，从而限制了像硅藻土这一类抗压缩性虽较好的矿物助滤剂的使用。七十年代R.Boudart发明的工艺(Belgian Patent NO723，613)是用高速离心已液化的番木瓜乳汁。离心后得到固相脂质漂浮层、液相水层和固相亲水沉淀层。只有液相水层可直接用于以后的酶纯化过程，漂浮层弃去。固相沉淀层是由不溶性亲水胶体组成，这些胶体有极强的持水能力，即使在高速离心的条件下也难以得到含湿量较小的沉淀。为了回收其中所含的酶活性成份，不得不多次交替进行洗涤和高速离心。这一工艺耗能高，分离效率低下。
此外，番木瓜蛋白酶成品的物理指标要求酶粉能在一定量比例的无离子水中完全溶解，所得溶液应是清彻透明的;在酶成品的卫生指标方面应控制所含微生物种类和数量在一允许的范围之内，为此乳汁抽提液必须经过精滤和微孔滤膜除菌过滤操作才能达到上述要求。无论用什么方法得到的乳汁抽提液，由于其中还含有一定数量、分散度极高的胶体，用现有工艺对抽提液直接进行精滤和微孔除菌过滤操作很困难，过滤速率极低。
番木瓜乳汁中含有大量对生物系统有毒害作用的小分子物质，主要是苄基异硫氰酸糖甙钾盐。这种物质占乳汁干重高达7.3%-11.6%。它除了对生物系统有有害作用外，还是番木瓜蛋白酶不愉快刺激性气味产生的根源。前述R.Roudart的工艺生产番木瓜精酶时，是在干燥工序之前通过真空工艺来浓缩乳汁抽提液。该工艺无法去除上述小分子不纯物。
本发明的目的是克服已有技术的缺点，提供一种耗能低，生产效率高的番木瓜蛋白酶精酶纯化工艺。另一个发明目的是进一步提供所得产品性能更好的精酶纯化工艺。
本发明工艺包括下述步骤把榨糖后的蔗渣中的蔗髓粉碎为10-60目，作为植物性材料助滤剂，用过滤、压榨或离心等已有的方法去除液化番木瓜乳汁中不溶性亲水和亲脂胶体颗粒，再对上述乳汁抽提液进行已有的精滤和微孔滤膜除菌过滤操作。所用蔗髓粉最好在使用前将其PH值调到5-7，然后干燥备用。既可以按乳汁重量的1%-15%把蔗髓粉混入番木瓜乳汁后用过滤压榨等方法加工，也可用蔗髓粉预涂层的方法对番木瓜乳汁作离心处理，或者采用其他施用助滤剂的方法，总之助滤剂为蔗髓粉就行。
蔗渣往往作为造纸原料而被利用。但蔗渣中的髓部组织由于吸水率高和高含硅量造成制纸浆时蒸煮和碱液回收操作上的困难，并且严重影响成品纸的质量。因此甘蔗渣必须经过除髓后才可用于造纸。蔗髓主要由薄壁细胞组成。本发明正是利用了组成蔗髓的薄壁细胞所具有的多孔性和因高硅量而致的抗压缩性这两个显著特征。它兼有滤棉，纸泊这类植物性助滤剂的强截留胶体的能力和不造成对活性酶分子的毒害，以及硅藻土这类矿物性助滤材料优良抗压缩性能两方面的优点，但却没的上面曾提到过的这两类助滤材料在分离酶活性材料中不纯胶体的那些致命弱点。表1的实验结果比较了用本发明的方法和R.Boudart方法一次操作的效率和酶活力回收情况。
表1
经过上述操作后得到的是去除绝大部分亲脂和亲水性胶粒的乳汁抽提液。由表1可知，本发明工艺和已有工艺相比，分离效率高，耗能少，酶活力回收率高。
为了进一步提高效率和制品性能，在采用本发明方法，以蔗髓粉为助滤剂去除液化番木瓜乳汁中的胶粒后，还可把所获得抽提液的PH值调至到5.6-7.5并向其中加入氯化钙并把溶液静置，此时可看到一些白色絮凝物沉淀，抽提液粘度显著降低。经这样处理后再进行精滤和微孔滤膜除菌过滤则可大大提高过滤速率。与不加氯化钙的操作工艺相比较，在同样加压过滤的条件下，前者的过滤速率是后者的3-5倍，而对番木瓜蛋白酶的活力没有显影响。加入抽提液中的氯化钙最好为抽提液重量的0.1-0.5%，静置时的温度最好为15-25℃、静置时间为1-4小时。
为了有效地去除番木瓜乳汁中对生物系统有毒害作用的小分物质，还可对经精滤和微孔滤膜除菌过滤后的抽提液再用各向异性的超滤膜系统进行恒滤操作。这样能有效地去除小分子不纯物质，接着使用超滤膜系统浓缩已去除小分子不纯化物的番木瓜蛋白酶抽提液，最后通过喷雾干燥或冷冻干燥得到番木瓜蛋白酶干粉。
和现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于加工效率高、耗能低、产品纯度高，酶的活性回收率高。用本发明方法制得的番木瓜蛋白酶精酶以鲜乳汁重量为基础的精酶得率为8%，平均活力是1，100TU/毫克，最高活力可达到1，600TU/毫克。制得的精酶为白色、完全可溶而无异味的粉状物。这些指标都优于用已知工艺得到的制品。
实施例取自甘蔗糖厂的蔗渣经干燥后，先通过5目筛得到主要是蔗髓的部分，再将其粉碎，取20-40目筛分得到干髓粉。用去离子水浸泡并洗涤，沥干水分，用0.1-0.5M的HCl液浸泡4小时，浸泡液量相当于蔗髓粉2倍体积，然后压干。继续以无离子水洗涤蔗髓粉至PH值为5.2-6.5，干燥后备用。
取按上述方法制备的干蔗髓粉144克入7200毫升经液化后的番木瓜鲜乳汁中，充分混合后放置半小时，装入-250目尼龙网袋进行压榨。得到第一次榨出清液6，552毫升。以1，440毫升的去离子水浸泡第一次榨渣并再行压榨得1，382毫升的第二次榨出清液。向第二次榨渣中加入720毫升去离水浸泡并进行第三次压榨得到第三次榨出清液734毫升。合并三次乳汁抽提液。以起初鲜乳汗的蛋白酶总活力为基础的三次合并抽提液的回收率是98.2%。
向8，668毫升的合并抽提液中加入无水氯化钙13克，充分搅拌并溶解，在室温下放置2小时后以双层新华滤纸减压抽滤，得到清彻透明的精滤液8，536毫升。在无菌操作条件下以0.45微米孔径的微孔滤膜过滤除菌，得无菌抽提液8，297毫升。以分子量截留值为20，000道尔顿的中空纤维进行恒滤和超滤浓缩。恒滤操作时加入2，880毫升去离子水。最后得到2，520毫升浓缩液。冷冻干燥后得番木瓜蛋白酶精酶粉539.2克，活力为1，430TU/毫克。
权利要求
1.番木瓜蛋白酶精酶纯化工艺，包括在用助滤剂的条件下分离番木瓜乳汁中的胶体颗粒，以及随后进行精滤和微孔滤膜除菌操作，其特征在于把榨糖后的蔗渣中的蔗髓粉碎为10-60目作为植物性材料助滤剂，用过滤、压榨或离心等已有的方法去除液化番木瓜汁中的不溶性亲水和亲脂胶体颗粒，再对上述乳汁抽提液进行已有的精滤和微孔滤操作。
2.如权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于先把所说的蔗髓粉PH值调至5-7，然后干燥备用。
3.如权利要求2所述的纯化工艺，其特征在于既可以按乳汁重量的1-15%把蔗髓粉混入番木瓜乳汁后用过滤、压榨等方法加工，也可用蔗髓粉预涂层的方法对番木瓜乳汁做离心处理。
4.如权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于先把去除所说胶体颗粒后的抽提液调至PH值5.6-7.5，向其中加入氯化钙并把溶液静置后，再进行所说的精滤和微孔滤操作。
5.如权利要求4所述的纯化工艺，其特征在于加入抽提液中的氯化钙为抽提液重量的0.1-0.5%。
6.如权利要求5所说的纯化工艺，其特征在于溶液的静置温度为15-25℃，静置时间为1-4小时。
7.如权利要求4所述的纯化工艺，其特征在于对经精滤和微孔膜膜除菌过滤后的抽提液再用各向异性的超滤膜系统进行恒滤操作，接着使用超滤膜系统浓缩已去除小分子不纯物的番木瓜蛋白酶抽提液。
全文摘要
本发明为纯化番木瓜蛋白酶精酶的工艺。特征之一为利用组成蔗髓的薄壁细胞的多孔性和抗压缩性，以蔗髓粉为去除番木瓜乳汁中胶体颗粒的助滤剂；特征之二为向去除胶体颗粒后的抽提液中加入氯化钙并静置，待产生絮凝物沉淀、抽提液粘度降低后再进行精滤和微孔滤膜除菌过滤；特征之三为对上述抽提液用各向异性的超滤膜系统进行恒滤和浓缩。本发明工艺加工效率高，耗能低，产品纯度高，酶的活性回收率高，性能指标优于用已知工艺得到的制品。
文档编号C12M1/12GK1088614SQ9211528
公开日1994年6月29日 申请日期1992年12月24日 优先权日1992年12月24日
发明者季本仁, 冯唯成, 王 华 申请人:中国科学院昆明植物研究所