专利名称：一种产醇腈酶微生物的筛选方法
技术领域：
本发明涉及产醇腈酶微生物的筛选方法。
醇腈酶(Hydroxynitrile lyases or oxynitrilases，EC 4.1.2.10，EC 4.1.2.11，EC 4.1.2.37，EC 4.1.2.39)是一种催化醇氰化合物(Cyanohydrins)分解和合成的酶，分解的产物或催化合成的底物为氢氰酸和相应的醛或酮，根据酶解反应对底物构型的要求不同，醇腈酶分为R型和S型。该酶促反应具有高度的对映体专一性和较低的底物特异性，合成反应生成的光活性醇氰化合物可转化成邻羟基胺、α-羟基酸、羟基醛、羟基酮和α-氟代羧酸等多种重要的手性中间体或手性药物。分解反应可消除苦杏仁、木薯淀粉等食品或饲料中含氰有毒物质，因此醇腈酶在精细化工、医药、食品、农业和畜牧业等方面具有广泛的应用前景。
自从1908年Rosenthaler利用苦杏仁的混合酶液(emulsin，富含醇腈酶)合成R型扁桃腈以来，从六个科的植物组织分离纯化到十二种醇腈酶，如黑樱桃醇腈酶(PaHNL)、双色高梁醇腈酶(SbHNL)、木薯醇腈酶(MeHNL)和橡胶醇腈酶(HeHNL)等等。但由于植物的生长周期长，受地理、气候条件的影响较大，加工分离的工艺复杂，成本较高，制约了植物醇腈酶的应用。众所周知，微生物生长旺，繁殖快，容易实现工业化生产，无疑是醇腈酶的廉价来源。然而，迄今尚未见到微生物醇腈酶及其筛选方法的相关报道。
本发明的目的是设计一种简便易行的方法，适用于各种可以分离到微生物的样品或保藏的菌株等样品中筛选产醇腈酶的微生物，以获得丰富廉价的酶源。
本发明的特点是利用醇氰化合物及其衍生物作为底物，充当富集、分离培养基的氮源或碳、氮源，通过苦味酸试纸法、巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法检测酶活性，分别进行菌株的初筛、复筛。
本发明的技术方法是用灭菌水将试样配制成悬浮液，接种0.1～0.5毫升悬浮液到装有1～10毫升富集培养基的试管，在20～40℃、150～450转/分钟的摇床上培养。每升富集培养基的成分为葡萄糖0～15克，酵母膏0.1～1克，玉米浆0.1～0.5克，硫酸镁0.1～0.4克，氯化钙0.05～0.3克，磷酸氢二钠1.2～2.5克，微量元素混合液1～3毫升，pH3～7。分装后，在0.1MPa下灭菌30分钟，接种前加入过滤除菌的醇氰化合物或衍生物至0.05～2％。微量元素混合液的组成为(％)硫酸亚铁0.025，氯化锌0.03，硫酸锰0.022，氯化铜0.01，硫酸钴0.003，硼酸0.006。富集培养数天后，取产生混浊的试管液体涂布于分离平板，20～40℃温箱静止培养。分离培养基除另含1～2％的琼脂外，其它成分同富集培养基。挑选单个菌落再接种到富集试管，利用苦味酸试纸法定性检测醇腈酶活性，其中来源于保藏的菌株省掉分离过程，可接种富集管后直接检测酶活。阳性菌株再通过巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法进行复筛。也可以省掉苦味酸试纸法，直接利用这两种方法筛选分离获得的单个菌株和保藏的菌株。
苦味酸试纸法是基于酶解反应生成的挥发性氢氰酸，被碱性苦味酸试纸吸收后，与苦味酸反应生成砖红色物质。
利用紫外法和巴比妥酸-吡啶比色法复筛或直接筛选时，将待筛菌种接种到装有50毫升发酵培养基(其成分与相应的富集培养基相同)的250毫升三角瓶，20～40℃，150～450转/分钟旋转摇床培养24～240小时，发酵液离心分成上清和菌体，后者经0.9％NaCl溶液洗涤1或2次，并悬浮在5～10毫升0.01M磷酸缓冲液中，pH5.5～6.5，4℃下超声波破碎细胞3～10分钟，细胞裂解液在10000-18000转/分钟离心15-30分钟，收集上清，即无细胞粗酶液，它与发酵液的上清用下述方法之一分别检测酶活。
紫外法是根据苯甲醛在249nm波长处有一特征吸收峰而设计的。具体步骤见实施例1(5)。一个酶单位定义为在25℃，pH5.4，每分钟释放出1μmol苯甲醛所需的酶量。
巴比妥酸—吡啶比色法HCN先被氧化成CN+，CN+与吡啶反应生成戊烯二醛，后者经Konig反应形成蓝紫色化合物。具体操作步骤和试剂的配制见实施例2(5)。酶单位定义为在25℃，pH5.4，每分钟释放出1μmol氢氰酸所需的酶量。
实施例1(1)将无菌水配制的1～2％土样悬浮液、保藏菌株悬浮液、植物表皮组织的浸洗液，分别接种0.2毫升到装有10毫升富集培养基，在30℃、210转/分钟的摇床上培养。每升富集培养基的成分为葡萄糖5克，酵母膏0.5克，玉米浆0.2克，硫酸镁0.25克，氯化钙0.1克，磷酸氢二钠1.36克，微量元素混合液2毫升，用氢氧化钠和盐酸水溶液调pH至4，分装后，在0.1MPa下灭菌30分钟，接种前加入过滤除菌的扁桃腈至0.1～0.3％。微量元素混合液的组成为(％)硫酸亚铁0.025，氯化锌0.03，硫酸锰0.022，氯化铜0.01，硫酸钴0.003，硼酸0.006。
(2)富集培养5天后，取产生混浊的试管液体涂布于分离平板，30℃温箱静止培养。挑选单个菌落再接种到富集试管，并在与富集相同的条件下发酵培养。平板分离培养基除另含1～2％的琼脂外，其它成分同富集培养基。其中来源于保藏的菌株省掉分离过程，可接种富集管后直接检测酶活。
(3)苦味酸试纸法初筛酶活性的步骤如下将每个样品每毫升含15毫克湿重菌体的5毫升悬浮液置入带盖子的试管(菌体经生理盐水洗涤两次后，用0.1M柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液配制成悬浮液，pH4.0)，依次加入0.005毫升DL-扁桃腈，混匀后迅速用大小适当的苦味酸试纸片覆盖管口，拧紧管盖，30℃保温48小时观察结果。同时设制三个阴性对照管和三个阳性对照管，前者每支由5毫升0.1M柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液(pH4)、0.005毫升扁桃腈组成，后者除含2个单位醇腈酶外，其它成分同阴性对照。阳性对照出现明显的砖红色，阴性为黄色。所用的苦味酸试纸片是分别通过滤纸在饱和苦味酸溶液中浸染、晾干，滴加0.5M碳酸钠溶液至滤纸湿透，再晾干而获得。
(4)复筛时，将经初筛获得的阳性菌或保藏菌接种到装有50毫升发酵培养基(其成分与相应的富集培养基相同)的250毫升三角瓶，28℃，220转/分钟旋转摇床培养72小时，发酵液离心分成上清和菌体，后者经0.9％NaCl溶液洗涤1或2次，并悬浮在10毫升0.01M磷酸缓冲液中，pH6.2，4℃下超声波破碎细胞10分钟，细胞裂解液在12000转/分钟离心15分钟，收集上清，即无细胞粗酶液，它与发酵液的上清用紫外法分别检测酶活。
(5)紫外法的反应体系包括3.8毫升0.1M磷酸缓冲液(pH5.4)、0.2毫升无细胞粗酶液或发酵上清液，0.2毫升0.0042M DL-扁桃腈溶液(0.01M柠檬酸水溶液配制)。当加入底物后，立即用光径1cm，5毫升的石英比色杯在25℃于249nm波长处连续测定其吸光度随时间的变化ΔAt，并减去空白对照ΔAc，获得的ΔAsymbol 162\f″Symbol″\s 12用于下述酶活力单位的计算。酶活力计算公式酶活力(单位/毫升)＝symbol 68\f″Symbol″\s12ΔAsymbol 162\f″Symbol″\s 12譜t矗/(13.2譼譜e)，Vt＝反应液的总体积，Ve＝酶液的体积，n＝酶液稀释倍数，t＝检测时间的长度(分钟)，13.2为苯甲醛的克分子消光系数。
(6)利用该法筛选到产R型或S型醇腈酶的微生物，包含有细菌、放线菌、酵母和真菌菌株。实施例2(1)将灭菌水配制的1～2％土样悬浮液、保藏菌株悬浮液、植物组织表皮的浸洗液，分别接种0.2毫升到装有10毫升富集培养基，在30℃、210转/分钟的摇床上培养。每升富集培养基的成分为葡萄糖8克，酵母膏0.5克，玉米浆0.2克，硫酸镁0.20克，氯化钙0.1克，磷酸氢二钠1.45克，微量元素混合液2毫升，用氢氧化钠和盐酸水溶液调pH至5，分装后，在0.1MPa下灭菌30分钟，接种前加入过滤除菌的丙酮醇氰至0.3％，培养过程中，每间隔二天每管补加丙酮醇氰40微升。微量元素混合液的组成同实施例1(1)。
(2)同实施例一(2)。
(3)同实施例一(3)，底物改为丙酮醇氰，10微升用量。
(4)复筛时，将经初筛获得的阳性菌或保藏菌接种到装有50毫升发酵培养基(其成分与相应的富集培养基相同)的250毫升三角瓶，28℃，220转/分钟旋转摇床培养48～120小时，发酵液离心分成上清和菌体，后者经0.9％NaCl溶液洗涤1或2次，并悬浮在10毫升0.01M磷酸缓冲液中，pH5.8，4℃下超声波破碎细胞10分钟，细胞裂解液在12000转/分钟离心15分钟，收集上清，即无细胞粗酶液，它与发酵液的上清用下述(5)巴比妥酸—吡啶比色法分别检测酶活。也可以省掉苦味酸试纸法，直接利用比色法检测分离获得的单个菌株和来自保藏的菌株。
(5)巴比妥酸—吡啶比色法将0.4毫升发酵上清液或0.4毫升无细胞粗酶液和4.6毫升0.1M柠檬酸～磷酸氢二钠缓冲液(pH5.4)混合，加入0.2毫升10％丙酮醇氰(0.01M柠檬酸配制)后25℃保温，并分别在不同时间取反应液0.02毫升，加入装有5.0毫升N-氯琥珀酰胺水溶液的试管终止酶反应，随即加入1.0毫升显色剂，15分钟后，580nm波长处读取吸光度，同时设置空白对照管和标准管。所用试剂的配制N-氯琥珀酰胺水溶液0.125克N-氯琥珀酰胺、1.25克琥珀酰胺用蒸馏水定容至500毫升；显色剂巴比妥酸7.5克溶于75毫升吡啶，用蒸馏水稀释到250毫升；标准溶液由氰化钾配制成1.5symbol 109\f″Symbol″\s 12μmol/ml的水溶液。酶活力计算公式为酶活力(单位/毫升)＝(symbol 68\f″Symbol″\s 12ΔA测定管-symbol 68\f″Symbol″\s 12ΔA空白管)譜t×1.5矗/(A标准管譜e譼)，Vt＝反应液的总体积，Ve＝酶液的体积，n＝酶液稀释倍数，t＝检测时间的长度(分钟)。
(6)同实施例一(6)实施例3(1)将灭菌水配制的1～2％土样悬浮液、保藏菌株悬浮液、植物组织表皮的浸洗液，分别接种0.4毫升到装有10毫升富集培养基，在30℃、210转/分钟的摇床上培养。每升富集培养基的成分为酵母膏0.3克，玉米浆0.2克，硫酸镁0.25克，氯化钙0.1克，磷酸氢二钠1.36克，微量元素混合液2毫升，用氢氧化钠和盐酸水溶液调pH至4，分装后，在0.1MPa下灭菌30分钟，接种前加入过滤除菌的D-扁桃苷(amygdalin)0.5％(W/V)。微量元素混合液的组成同实施例1(1)。
(2)同实施例1(2)。
(3)同实施例1(3)。
(4)同实施例1(4)。
(5)同实施例1(5)。
(6)利用该法筛选到产R型醇腈酶的细菌、放线菌、酵母和真菌菌株。实施例4(1)将灭菌水配制的1～2％土样悬浮液、保藏菌株悬浮液、植物组织表皮的浸洗液，分别接种0.4毫升到装有10毫升富集培养基，在30℃、210转/分钟的摇床上培养。每升富集培养基的成分为酵母膏0.3克，玉米浆0.2克，硫酸镁0.25克，氯化钙0.1克，磷酸氢二钠1.36克，微量元素混合液2毫升，用氢氧化钠和盐酸水溶液调pH至5.5，分装后，在0.1MPa下灭菌30分钟，接种前加入过滤除菌的百脉根苷(lotaustralin)0.6％(W/V)。微量元素混合液的组成同实施例1(1)。
(2)同实施例2(2)。
(3)同实施例2(3)。
(4)同实施例2(4)。
(5)同实施例2(5)。
(6)利用该法筛选到产S型醇腈酶的细菌、放线菌、酵母和真菌菌株。
权利要求
1.一种筛选产醇腈酶微生物的新方法，其特征在于利用醇氰化合物作为唯一氮源或碳、氮源的培养基，对样品进行富集分离，获得的单株，用苦味酸试剂进行产醇腈酶菌株的筛选。再通过巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法检测酶活性，获得产醇腈酶菌株。
2.根据权利要求1，其特征在于本法适用于各种可分离到微生物的样品如果园、农田、菜田及有野生植物生长的山丘；化学物质和食品、果品加工工厂污染的土壤和水；植物组织，以及现存或保藏的微生物菌种，进行产醇腈酶微生物的筛选。
3.根据权利要求1所述的方法，富集、分离培养基的特征在于以醛或酮合成的醇氰化合物作为培养基的氮源或碳、氮源，每升培养基的组成为葡萄糖0～20克，最适量0～10克，酵母膏0.1～1克，最适量0.1～0.5克，硫酸镁0.1～0.4克，氯化钙0.05～0.3克，磷酸氢二钠1.2～2.5克，微量元素混合液1～3毫升，琼脂0～20克，pH3～7，最适pH3～5，接种前加入过滤除菌的醇氰化合物或其衍生物，浓度为0.05～1％(W/V)，最适浓度0.1～0.5％(W/V)。微量元素混合液的组成含Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Co2+、BO32-。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用苦味酸试剂，，可以用苦味酸试纸法检测平板分离获得或保藏的经过液体富集培养基培养的纯株微生物，获得初筛结果。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于应用巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法的方法检测酶活性；初筛获得的产酶菌株再通过巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法进行定量复筛；也可以直接利用这两种方法对分离获得的单个菌株和保藏的菌株进行筛选。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于此方法适用于产醇腈酶的细菌、放线菌、酵母和真菌的筛选。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于从微生物菌株中可以筛选到R型醇腈酶和S型醇腈酶。
全文摘要
本发明涉及从土壤、环境污染物、植物组织及保藏的微生物等样品中筛选产醇腈酶微生物的全新方法,利用该法筛选到多种产醇腈酶微生物的菌株。
文档编号C12N9/00GK1258743SQ9812659
公开日2000年7月5日 申请日期1998年12月31日 优先权日1998年12月31日
发明者孙万儒, 程树华 申请人:中国科学院微生物研究所