编码具有果糖基转移酶活性的酶的核酸分子及其应用的制作方法

专利名称：编码具有果糖基转移酶活性的酶的核酸分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码具有果糖基转移酶活性的多肽的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和宿主，也涉及产生果糖基转移酶和在多种宿主生物中或在体外产生菊淀粉型聚果糖的方法。还涉及由所述核酸分子所编码能用以产生菊淀粉型聚果糖的果糖基转移酶。
水溶性、线性聚合物能做多种应用，如用作去污剂、悬浮剂时增加水系统的粘度，或加速沉降和络合，以及结合水。
以糖类为基础的聚合物，象果糖基多糖，由于它们可以生物降解因而是特别有用的起始材料。
除了在工业生产和制造中用作可再生的原材料外，人们对果糖聚合物作为食品添加剂如甜味剂等很感兴趣。对于不同应用，需要不同链长的聚合物。对于食品业，人们优选的是短的或中等链长的聚合物，而对于象生产表面活化剂这样的技术性应用，需要有高聚合度(DP)的聚合物。
已报道过在植物中由源于细菌表达的果糖基转移酶而产生果聚糖或由源于植物所表达的果糖基转移酶而产生中等链长的聚果糖的多种方法。如专利申请PCT/US89/02729介绍了在转基因植物中，特别是在其果实里，生成糖类聚合物，特别是葡聚糖或聚果糖的可能性。为了繁育如此改造的植物，有人建议使用源于微生物，特别是产果聚糖气杆菌(Aerobacten levanicum)，唾液链球菌(Streptococcussalivarius)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶，或来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的葡聚糖蔗糖酶。无论是产生活性酶还是产生果聚糖或葡聚糖或制作转基因植物等都未见报导。
专利申请PCT/EP93/02110介绍了一种制作转基因植物的方法，它表达来自革兰氏阴性菌解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的果聚糖蔗糖酶的lsc基因。该植物产生大分子量、高度支化的果聚糖。
专利申请PCT/NL93/00279介绍了用含有枯草芽孢杆菌sacB基因的嵌合基因转化植物的方法，这种植物产生一种支化果聚糖。在PCT/US89/0279、PCT/EP93/02110和PCT/NL93/00279中所用的细菌果糖基转移酶合成一种β-2,6连接的果糖聚合物一果聚糖，有许多β-2,1分支。但是，由于有许多分支，果聚糖要用于技术加工相当不利，因此它用于技术加工的起始材料与呈β-2,1连接的菊淀粉相比需求很少。目前，在合成菊淀粉时涉及到其基因产物的细菌基因只知道一个，即来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的ftf基因。PCT/NL93/00279介绍了用所述基团转化的植物，它合成大分子量的菊淀粉，但产量低，以致无经济价值。PCT/EP97/02195也介绍了一种用来自变异链球菌的ftf基因制作转基因并生产菊淀粉的植物的方法。象PCT/NL93/00279所介绍的一样，大分子量的菊淀粉产量也较低。虽然如果预先对该基因进行基因工程改造，再在植物中作基因表达是可能的，但从转基因植物中能得到的菊淀粉产率低，以致这种转基因植物无经济价值。此外，PCT/NL/96/00012公开了编码糖类聚合物合成酶的DNA序列以及用其制备转基因植物。该序列源于Helianthustuberosus。根据PCT/NL96/00012，可用所公开的序列改变矮牵牛和马铃薯及Helianthus tuberosus本身的果聚糖。在转基因植物中，上述序列编码的蔗糖依赖性蔗糖果糖基转移酶(SST)或果聚糖果糖基转移酶的表达可产生菊淀粉。但是，其平均聚合度为DP=6到10。这种聚合度的菊淀粉不能认为是长链的。PCT/NL96/00012介绍的方法不能产生大分子量的菊淀粉。
最近，Rehm等人(细菌学杂志(J.Bacteriology)180(1998)，1305-1310)报道通过引入来自臭曲霉(Aspergillus foetidus)的SST基因，在酵母菌中产生寡聚糖。但是，所得到产物的聚合度只有DP=3。
DE19708774.4涉及使用具有果糖基聚合酶活性的酶来生产1-蔗果三糖和nystose，在转基因植物中可产生三糖和四糖。产量高并在马铃薯细胞内与蔗糖量相当。但未讲到有较长链菊淀粉的产生。
在许多文献中还讨论了用真菌来合成聚果糖，如Barthomeuf和Pourrat(生物技术通讯(Biotechnology Letters)17(1995),911-916)介绍了皱褶青霉(Penicillium rugulosum)具有果糖基转移酶活性的酶制品，它有多种酶特性，因此，表示它不是一种纯果糖基转移酶。果糖基转移酶基因的DNA序列还不知道。Cairns等人(新植物学家(New phytologist)129(1995),299-308)介绍了一种在Monographella nivalis培养液中，由蔗糖暂时合成三糖、四糖和五糖。起作用的酶活性看来主要是水解性的，因为随着此酶对底物消耗的增加，聚果糖又被降解。由于不知道DNA序列，就无法依靠与呋喃果糖苷酶(转化酶)的同源性作参照来判断是存在本意的果糖基转移酶或是转化酶。
已显示真菌聚多曲霉(Aspergillus sysdowi)IAM2544能产生菊淀粉型聚果糖。如Harada等人(Nishinari和Doi(编)，FoodHydrocolloidsStructures,Properties and Functions,Plenum,New York(1994),77-82)介绍了用聚多曲霉分生孢子来合成菊淀粉。在25升20％蔗糖溶液中培养1259分生孢子，通过HPLC(高压液相)纯化产生的产品。但是，这种方法不能用于大规模生产菊淀粉。Maramatsu等人(Agric.Biol.Chem.52(1988),1303-1304)介绍了用相同真菌株(聚多曲霉IAM2544)的菌丝生产果寡糖的方法，聚合度是3到13。这一方法涉及的酶是非纯化的或只部分纯化的。相应基因的氨基酸序列或DNA序列还不知道，也没有给出或仅不完全地给出纯化这种蛋白蛋的方法。
因此，本发明要解决的问题是提供能用于产生菊淀粉型聚果糖的遗传工程化生物的核酸分子和方法。这个问题通过提供在权利要求中定义的实施方案得以解决。
本发明涉及编码果糖基转移酶的核酸分子，其选自下组(a)编码含有SEQ ID NO.2中所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；
(b)含有SEQ ID NO.1中所示编码区核苷酸序列的核酸分子或相应的核糖核苷酸序列；(c)同(a)或(b)中所示核酸分子的互补链杂交的核酸分子；(d)核苷酸序列因遗传密码简并而不同于(c)中所示核酸分子序列的核酸分子；以及与其互补的核酸分子。
在Seq ID No.1中描述的序列编码来自聚多曲霉的蔗糖依赖性果聚糖果糖基转移酶，它能导致在植物细胞中合成菊淀粉型长链聚果糖。令人惊奇地发现，利用上述序列在宿主生物，特别是在转基因植物、细菌或真菌中有可能产生高产量长链菊淀粉型聚果糖。
在本发明范围内，详细描述了从聚多曲霉中纯化这种酶的方法。把酶纯化到同质性以便能测定其氨基酸序列。根据得到的氨基酸序列信息，决定用以PCR反应的引物，借助这些引物扩增基因片段，这些片段用以筛选cDNA文库。把几个与PCR产物序列同源的cDNA分子分离出来并加以比较，得到的绝大多数cDNA分子都有相同大小的插入片段。在酵母菌或马铃薯中，这些DNA序列有功能性表达证实了这些cDNA分子的完整性。
在实施例中介绍了酶的纯化、PCR引物设计、cDNA分子的鉴定以及异源性表达。Seq ID No.1和2分别描述了分离出来的DNA序列和由它推测出来的氨基酸序列。本发明中的DNA序列是第一个编码真菌蔗糖-依赖性果聚糖果糖基转移酶的。该DNA序列和它所编码的蛋白质序列很不同于编码已知的果糖基转移酶的DNA序列。例如，它和来自Aspergillus naeslundii levj菌的果糖基转移酶的一致性，在蛋白质和DNA水平上分别只有22.6％和39％，而和来自黑曲霉(Aspergillusniger)的转化酶(invertase)基因在蛋白质和DNA水平上的一致性分别是64和60.6，由所述基因所编码的蛋白质有完全不同的酶活性。这表示这种核酸分子和由其编码的果糖基转移酶都是至今所没有公开过的。
在本发明的内容里，果糖基转移酶应理解为能催化(断裂)果糖单位之间β-2,1-糖苷键和/或β-2,6-糖苷键连接的蛋白质。要转移的果糖残基源于蔗糖。
本发明的蔗糖依赖性果聚糖果糖基转移酶的催化反应可描述如下n(G-F)→G-Fn+(n-1)G在这个图式中，G是葡萄糖、F是果糖，G-F是蔗糖。即酶是将来自蔗糖的果糖残基转移到多聚果聚糖上，后者从蔗糖分子开始，由β-2,1-糖苷键形成，这时也可能出现β-2,6糖苷键。
由本发明的核酸分子编码的具有果糖基转移酶活性的多肽，可导致合成多聚果糖，特别在植物细胞里可合成菊淀粉型多聚果糖(以下均称为菊淀粉)。
在本发明的内容里，多聚果糖应理解为聚合度DP≥4，优选DP≥6，特别优选DP≥8的多聚果聚糖。“菊淀粉型多聚果糖”或“菊淀粉”指长链果聚糖聚合物，其分子主要是β-2,1-糖苷键连接的，任选地也有β-2,6分支。“长链”一词意味着聚合度大于20，优选大于50，更优选大于100，最优选大于200。果糖基聚合物可能带有一个末端葡萄糖残基，它是通过葡萄糖上的C-1羟基基团和果糖残基的C-2羟基基团连接的。在这种情况下，果糖聚合物中就含有一个分子的蔗糖。
为在体外用此酶来合成多聚果聚糖时，能得到一个寡聚物(DP=4到10)。
由本发明的核酸分子所编码的酶，由于其催化反应可能与已知的果糖基转移酶有很大不同，如，已知的植物SST催化以下反应G-F+G-F→G-F-F+G但是植物的果聚糖依赖性果聚糖果糖基转移酶催化以下反应G-Fn+G-Fm→F-Fn+1+G-Fn-1这是完全可逆反应。
由枯草芽孢杆菌sacB基因编码的细菌果糖基转移酶也催化如下类型的反应nG-F→G-Fn+(n-1)G
但是，这些酶都产生果聚糖，即带有β-2,1分支的β-2,6-糖苷键连接的多聚果聚糖。
而由变异链球菌ftf基因所编码的蛋白质(FTF)可诱导合成分子量为几百万道尔顿的菊淀粉。但是，ftf基因或所编码的蛋白质没有表现出与SEQ ID No.1中描述的核酸分子有明显同源性(仅为37.3％)或与SEQ ID No.2中描述的氨基酸序列有明显的同源性(仅为22.6％)。
在本发明的内容里，“杂交”一词意味着在常规杂交条件下，优选象Sambrook等人介绍的严紧条件下进行杂交(见“分子克隆实验手册”，纽约，冷泉港，第二版，1989(Molecular cloning,A LaboratoryManual,2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Press.ColdSpring Harbor.NY.))。严紧杂交条件的一个例子是在含有50％甲酰胺，5×SSC,5×Deahardt’s溶液，40mM磷酸钠(pH6.8),0.5％(wt/vol.)BSA(牛血清白蛋白)，1％(wt/vol.)SDS,0.1mg/ml鲱鱼精子DNA中，于42℃进行杂交，随后用0.5×SSC/0.5％SDS溶液在60℃下洗杂交滤膜。
非严紧常规杂交条件的一个例子是上述提到的条件，只是50％甲酰胺改为30％并随后在56℃下用2×SSC/0.5％SDS洗滤膜。例如可以从基因组或cDNA文库中分离出与本发明的分子杂交的核酸分子，cDNA文库优选是从真菌制备的。用本发明的分子或其片段或其反向互补片段，例如通过标准方法杂交，可以鉴定出或分离出这种核酸分子(如见Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndedition(1989)Cold Spring Habor Laboratory Press.ColdSpring Harbor,NY)。核酸分子可用作杂交探针，它表现出与SEQ IDNo.1中描述的核苷酸序列完全相同或基本相同，或与其部分片段是完全相同或基本相同。用作杂交探针的片段也可以是人工合成的片段，可通过常规合成技术得到，而且其序列与本发明的核酸分子序列基本是一致的。
与本发明的核酸分子杂交的分子也包括上述已介绍的编码本发明蛋白质之核酸分子的片段、衍生物及等位基因变体。“片段”应理解为是那种长度足以能编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的核酸分子部分。本发明中“衍生物”一词是指这些分子的序列在一个或几个位点上与上述核酸分子不同但与其表现出高度同源性。同源性是指序列一致性至少有40％，特别是至少有60％，优选至少有80％，甚至更优选有大于90％。由这些核酸分子所编码的蛋白质优选与SEQ ID No.2中列出的氨基酸序列至少有60％的一致性，优选至少70％，特别是至少80％，特别优选至少90％，最优选至少95％的一致性。上述核酸分子的衍生化可通过例如缺失、置换、插入和/或重组来获得。本发明的核酸分子可以是真菌来源序列的其他衍生物。可能要对序列衍生化以利于其在某些宿主细胞中表达。
同上述分子同源并代表所述分子衍生物的核酸分子是这些分子的规则变异体，其体现发挥相同生物学功能的改变。这些变异体可以是自然发生的，如从其他菌种或生物体来的，也可以是通过突变作用来的。突变作用可以是自然发生的或是由特异诱变引入的。而且，它们也可以是合成产生的序列。等位基因变体既可以是自然发生的，也可以是通过合成或通过DNA重组技术产生的。
由本发明的核酸分子的各种变体所编码的蛋白质具有某些共同的特性，诸如酶活性、分子量、免疫学反应或构象或物理特性如在凝胶电泳中的电泳迁移率、层析行为、沉降系数、溶解度、光谱学特征、稳定性、最适pH或温度。
在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子编码具有真菌果糖基转移酶，特别优选来自曲霉属，最优选来自聚多曲霉的果糖基转移酶特性的多肽。
本发明的核酸分子可以是DNA或RNA分子，DNA分子的例子有基因组DNA或cDNA分子。本发明核酸分子可以从天然来源如从真菌，特别从曲霉属，优选从聚多曲霉分离到或根据已知的方法合成。通过分子生物学常规技术把各种突变引进本发明的核酸分子中也是可能的(见Sambrook等Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)。这种插入可导致合成潜在改变生物学特性的蛋白质。一种方法就是造成缺失突变体，其中核酸分子是通过编码DNA序列的5＇末端或3＇末端被渐进缺失造成的，这导致合成相应截短了的蛋白质。另一种方法是特异性产生酶，因加有信号肽序列，它被定位在各种部位。为了将本发明的蛋白质定位在胞液中，SEQ IDNo.2中表示的序列上不必加入信号序列。
另一方面，在一些位置上也可以造成点突变，如能影响酶活性或调节酶活性的氨基酸序列的改变。例如，用这种方法，可以得到K■值改变了的突变体，或不再受变构调节机制的调节或细胞内常发生的共价修饰影响的突变体。
而且，也可以得到底物或产物特异性改变的突变体。此外，还可以得到温度-活性特征改变的突变体。
对于在原核细胞中进行遗传操作，可把本发明的核酸分子或其片段整合到允许通过DNA序列重组造成突变或序列改变的质粒上。利用标准方法(Sambrook等Molecular Cloning A Laboratory Manual,2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbar,NY)可以进行碱基交换或加上天然或合成的序列。为了连接DNA片段，可把适配子或接头连到片段上。而且，可使用能能提供适宜的内切酶位点或去掉不必要的DNA或内切酶位点的操作方法。在体外诱变时，无论是插入、缺失或是置换，可能都是有用的。也可使用“引物修补”，内切酶切割或连接。对于分析，常利用序列分析、内切酶图谱分析或进一步作生化-分子生物学分析。
此外，本发明还涉及含有本发明核酸分子的载体，优选的是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其他遗传工程通用的载体。
优选本发明的核酸分子是可操作连到本发明的带有调控元件的载体上，所述元件允许可翻译的RNA在原核和/或真核细胞中进行转录和合成(蛋白)。
例如，本发明的载体含有以下元件
1．一个保证下游编码区在宿主生物细胞中转录的启动子和任选的增强子元件。
2．一个同启动子融和的编码区，它至少含有一个多肽翻译的开放读码框架。本发明中，编码区就是本发明的核酸分子。
3．与编码区融和的任选附加序列，例如为基因在某种宿主生物中成功表达所需要的转录终止信号或影响基因产物的亚细胞定位的信号序列或诱导蛋白质分泌的信号序列。
这样的载体可能含有附加基因，诸如允许在适宜的宿主细胞中和适宜的条件下对其进行筛选的标志基因。
本发明核酸分子的表达包括其转录成可翻译的mRNA。允许核酸分子在原核和真核细胞中表达的调控元件都是本领域技术人员所清楚的。例如，适于本发明核酸分子在原核细胞中表达的可能调控元件，包括PL、Lac、trp或大肠杆菌tac启动子。特别优选使用LacZ启动子，它在大肠杆菌中可被IPTG诱导。允许在真核宿主细胞中表达的调控元件例子是酵母的AOXl和GALl，或CMV,SV40,RSV启动子，CMV增强子，SV40增强子或哺乳动物细胞或其他动物细胞中的珠蛋白内含子。为了在酵母中表达，优选使用啤酒酵母的乙醇脱氢酶基因启动子，它在酵母中具有高度活性。更多的适宜载体系统在现有技术中已有介绍，例如见Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.，和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology(1989),GreenPublishing Associates和Wiley interscience,NY。
本发明的核酸分子在植物细胞中表达所需的调控元件，原则上可以是任何在植物细胞中有活性的启动子、增强子、终止子等。可选择启动子使得发生组成性表达，或在某一组织、在植物发育的某一时间点上或在由外部环境决定的时间点上发生表达。启动子相对于植物可以是同源性的或是异源性的。
组成型表达的适宜启动子有组成型表达的花椰菜花叶病毒的35SRNA启动子(见US5,352,605)和遍在蛋白启动子(见US5,614,399)，用于马铃薯块茎特异性表达的patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa,EMBO J.8(1989),23-29)，或保证只在光合作用的组织中表达的启动子如ST-LSl启动子(Stockhaus,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987),7943-7947；Stockhaus.EMBO J.8(1989),2445-2451),Ca/b启动子(见US5,656,496,US5,639,952,Bansal,Proc.Natl.Acad.Sci,USA89(1992),3654-3658)和Rubisco SSU启动子(见US5,034,322,US4,962,028)。但是，也可使用只在由外部环境所决定的某一时间点上才有活性的启动子(见W093/07279)。允许简单诱导的热激蛋白启动子可能具有特殊意义。诸如象蚕豆(Vicia faba)的USP启动子的种子特异性启动子也可使用，它能在蚕豆和其他植物中进行种子特异性表达(Fiedler.Plant Mol.Biol.22(1993),669-679；Bumlein,Mol.Gen.Genet.225(1991),459-467)。而且，也可以使用诸如在WO91/01373中介绍过的果实特异性启动子。为了在成熟期西红柿果实中表达，西红柿多聚半乳糖苷酶启动子顺式调控元件是适宜的，其在果皮内外层中都是有活性的(Nicholass等，Plant Mol.Biol.28(1995),423-435；Montgomery等，Plant Cell5(1993),1049-1062)。Van Haaren等人介绍了西红柿另外一种果实特异性启动子(Plant Mol.Biol.21(1993),625-640)。
此外，还可使用胚乳特异性表达启动子，如谷蛋白启动子(Leisy,Plant Mol.Biol.14(1990),41-50；Zheng,Plant J.4(1993),357-366)，小麦HMG启动子，USP启动子，云扁豆蛋白启动子或玉米的玉米醇溶蛋白基因的启动子(Pedersen,Cell29(1982),1015-1026；Quattrocchio,Plant Mol.Biol.15(1990),81-93)或玉米的shrunken 1-启动子(sh-1)(Werr,EMBO J.4(1985),1373-1380)。
本发明的核酸分子在植物有些部位表达特别有利，这些部位蔗糖含量高或贮存蔗糖。这些器官是象甜菜根或甘蔗茎和甜高梁茎。因此特别优选那些能在这些器官中介导表达的启动子，如马铃薯(Solanumtuberosum)patatin启动子B33。为了在甘蔗茎中特异性表达，可使用与第一个内含子结合的遍在蛋白启动子。
本发明的载体也可能具有附加的功能单元，它能实现宿主生物中载体的稳定化，如细菌的复制起点，用于酵母菌中稳定化和自主复制所需的2-micro-DNA。而且，可能还含有农杆菌T-DNA“左边界”和“右边界”序列，它允许植物基因组中的稳定整合。而且可能还有一个终止序列，它是用于准确终止转录或把poly A尾巴加到转录本上，据说它具有稳定转录本的功能。文献中已介绍过这种元件(如Gielen,EMBO J.8(1989),23-39)并可自由交换。
在一个优选的实施方案中，本发明的载体含有的核酸分子包括一个对于所编码酶的分泌具有功能的信号序列区。这种序列是已知的。能使蛋白质定位到液泡中的信号肽的实例有酵母羧肽酶Y(CPY)的信号肽。Valls等人介绍过相应基因(Cell48,887-899)。植物信号序列例如有大麦外源凝集素基因的信号序列(Raikhel和Lerne.Dev.Genet.12(1991),255-269)或菜豆成熟植物血球凝集素N-末端区43个氨基酸序列(Tague等，Plant Cell2(1990),533-546)。C-末端信号肽的实例有几丁质酶的信号序列(Neuhaus等，Plant J.5(1994),45-54)。
优选的信号序列例如有马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的信号序列。但是，也可使用会导致多肽在选定的宿主中分泌的任何其他信号序列。分泌出来的果糖基转移酶可从培养液中得到并常用于体外合成。
在特选的实施方案中，载体上的核酸分子含有一个编码在植物细胞胞液中定位的信号序列的功能区，优选的是马铃薯patatin基因的信号序列(Sonnewald,Plant.J.1(1998),95-106)。这能使果糖基转移酶在转基因植物细胞和植物如甜草或马铃薯的液胞中进行亚细胞定位，并在液泡中累积菊淀粉型的高分子量聚果糖。而且，已有人如Matusoaka(Journal of Experimental Botany 50(1999),165-174),Chrispeels(Cell68(1992),613-616),Matsuoka(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991),834-838),Bednarek(Plant Cell3(1991),1195-1206),Nakamura(Plant Phys,101(1993),1-5)介绍过液泡定位的信号序列。
在本发明的另一个实施方案，载体上的核酸分子包含一个编码在植物细胞中质体定位的信号序列功能区。
例如，作为信号序列，可以使用菠菜的铁氧还蛋白NADP(+)-氧化还原酶(FNR)的信号序列，它含有5＇端非翻译区以及菠菜质体蛋白铁氧还蛋白NADP(+)-氧化还原酶(FNR)cDNA的侧翼转运肽序列(核苷酸-171到+165；Jansen,Current Genetics13(1988),517-522)。
而且，也可以使用玉米蜡样蛋白(Waxy protein)的转运肽加上成熟蜡样蛋白的前34个氨基酸作为信号序列(Klsgen.Mol.Gen.Genet.217(1989),155-161)。在本发明的优选实施方案中，使用的是不带成熟蜡样蛋白前34个氨基酸的蜡样蛋白转运肽。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及质粒pSK-asl,p112-asl,pA7-asl,p35-asl,p35-S3-asl，这些质粒的构建在实施例中(

图1-5中)描述。
本发明的核酸分子和表达载体允许在多种宿主生物，特别是在植物、真菌和细菌中生产菊淀粉型多聚果糖。也可以在宿主生物体之外用这种编码酶生产菊淀粉型多聚果糖。即特别可以在任何宿主细胞中用本发明的核酸分子去生产由它们编码的蛋白并从这些宿主细胞和/或培养液里得到这种蛋白，并把它用于体外合成菊淀粉。
例如，对于啤酒酵母的转化可以使用含有本发明的核酸分子和乙醇脱氢酶启动子的构建体。因为酵母不能利用蔗糖，应使用由于转导了异源性DNA序列而表达蔗糖转运蛋白的细胞。有人介绍过这种细胞的制作，如Riesmeier等(EMBO J.11(1992),4705-4713)。用上述构建体转化的酵母形成菊淀粉型长链聚果糖。因为聚多曲霉果糖基转移酶没有信号肽,所以无法分泌。因此长链聚果糖产生在酵母细胞中，可直接用含有这种聚果糖的酵母细胞作为食品添加剂。如果要在培养液里发酵获得多聚果糖，可以把一个信号序列融合到本发明的核酸分子上以便分泌。
在另外一个实施方案中，本发明涉及暂时或稳定含有本发明的核酸分子或载体的宿主细胞或这种细胞的衍生体。“宿主细胞”一词涉及体外能摄取重组DNA并任选地能合成由本发明核酸分子所编码的蛋白的生物体。宿主细胞可以是源于原核的，也可以是来自真核的。“原核”细胞包括能用本发明核酸分子转化或转染并有利地允许果糖基转移酶活性蛋白表达的所有细菌。原核宿主细胞包括革兰氏阴性、阳性菌，象大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌和枯草芽孢杆菌。“真核”细胞包括昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞及人类细胞。优选的真菌细胞是如能发酵或可被用以发酵的细胞，特别是酵母，特别优选的是啤酒酵母，裂殖酵母，克鲁维酵母，毕赤酵母等。优选这样的真菌细胞是来自曲霉属的细胞，特别优选来自黑曲霉种的细胞。特感兴趣的是，在这些细胞里，本发明的果糖基转移酶和一个分泌信号序列如patatin基因或臭曲霉1-SST基因的信号序列一起表达(Rehm等J.Bac.180(1998),1305-1319)，能把果糖基转移酶分泌到培养液里。使用低或无分泌型转化酶活性的细胞是有利的，本身没有转化酶活性的真菌有如木霉T.reesei。有人介绍过β-呋喃果糖苷酶(来自黑曲霉的转化酶)的表达方法，如Bergès等(Curr.Genet.24(1993),53-59)。本发明编码具有果糖基转移酶活性蛋白的核酸分子或相应载体可由本领域技术人员通过常规方法转染或转化宿主细胞。生产融合的可操作连接基因和其在适宜宿主细胞中表达的方法是本领域技术人员所熟知的并有人介绍过，如Sambrook或Ausubel，见上述文献。优选的宿主是大肠杆菌、真菌，特别是酵母，以及植物细胞。
本发明的细胞优选的特征在于，其中导入的核酸分子相对于转化细胞是异源性的，即在这些细胞里，它不是天然存在的，或是定位在一个与自然界存在的相应序列不同的基因组位点上。
当在植物里表达本发明的核酸分子时，合成蛋白定位在植物细胞任何区室通常是可能的。为了让它定位在特定的区室，可以把本发明的核酸分子连接到能保证定位到理想区室去的DNA序列上，见上面的介绍。这种序列是已知的(见Braun,EMBO J.11(1992),3219-3227；Wolter,Proc.Natl.Acad.Sci；USA.85(1988),846-850；Sonnewald,Plant J.1(1991),95-1061；Rochasosa EMBO.J.8(1989),23-29)。
本发明的宿主包括用本发明一种或几种核酸分子转化的转基因植物细胞、植物组织和植物，以及源于由这种方法所转化细胞的转基因植物细胞。这种细胞含有一种或几种核酸分子，其优选和允许在植物细胞里转录的调控DNA元件、特别是启动子连接。这种细胞不同于天然存在的植物细胞，它们至少含有一种本发明的核酸分子，后者在这些细胞里不是天然存在的，或该分子是定位在细胞基因组的一个非天然定位位点上，即定位在不同的基因组位点上。
在另一个实施方案中，本发明涉及在其胞液中含有本发明蛋白质的植物细胞。在此实施方案中，使用SEQ ID No.2中表示的序列，没有另外的信号序列。
在另外一个优选实施方案中，本发明涉及在其质体中含有本发明蛋白质的植物细胞。为使本发明的蛋白质发生质体定位，可用上述方法修饰本发明的核酸分子和/或载体。
因为液泡通常能贮存大量的蔗糖，蔗糖作为本发明蛋白质的底物，这个部位完全适于繁殖这样的植物细胞，其由于本发明蛋白的活性在液泡中产生多聚果糖。
在一个特别优选的实施方案中，本发明因而涉及液泡中含有本发明蛋白质的植物细胞。
上面已经阐明了必须如何构建本发明的核酸分子和/或载体以调节本发明蛋白质在液泡中定位。
通过本领域技术人员已知的方法，可用转基因植物细胞和植物组织再生整个植物。可由本发明转基因植物细胞通过再生得到的植物也是本发明的一个主题。本发明另一个主题就是含有上述转基因植物细胞的植物。本发明的植物通常可以是任何一种植物，优选是单子叶植物或双子叶植物。优选源于有农业用途之植物的植物细胞，即由人类为提供粮食或技术加工目的、特别是工业目的所栽培的植物。本发明优选涉及产生纤维的植物(如亚麻、大麻、棉花)，贮油植物(如油菜、向日葵、大豆)，贮糖植物(如甜菜、甘蔗、甜高梁、香蕉)和贮蛋白植物(如豆科植物)。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及饲料植物(如饲料或料草、苜蓿草、三叶草等)，蔬菜(如甜瓜、西红柿、香蕉、菊苣、韭葱、芦笋、胡萝卜)或贮淀粉植物(小麦、大麦、燕麦、黑麦、马铃薯、玉米、水稻、豌豆、木薯、绿豆)。
在另一个实施方案中，本发明涉及来自含蔗糖植物的植物细胞(如甜菜、马铃薯、水稻、小麦、甘蔗等)。特别优选甜菜、菊苣、水稻、玉米、马铃薯、甘蔗和小麦。本发明还涉及本发明植物的繁殖材料和收获产物如果实、种子、块茎、根状茎、幼苗、枝条、愈伤组织、细胞培养物等等。
本发明还涉及对制备转基因植物的方法，其中包括(a)通过引入本发明的核酸分子和/或载体遗传修饰植物细胞，(b)由该细胞再生植物，并任选地(c)再从(b)的植物繁殖植物。
在本发明的内容里，“遗传修饰”是指由于引入本发明核酸分子而改变了植物细胞的遗传信息并因本发明核酸分子的存在或表达导致表型改变。优选表型改变是指细胞中可检测的一个或几个功能的改变，如本发明遗传修饰的植物表现出本发明蛋白质的活性或果糖基转移酶总活性提高。
植物可通过本领域技术人员所熟知的方法按步骤(b)来再生。根据本发明方法步骤(c)的进一步植物繁殖，可以是例如无性繁殖如用插枝、块茎或愈伤组织培养和整株植物的再生)或有性繁殖。优选在一控制的条件下进行有性繁殖，即选择具有特异性状的植物进行杂交育种并繁殖。
本发明涉及可由本发明的方法获得的植物。
本发明还涉及根据本发明植物的繁殖材料以及由本发明方法所产生的转基因植物。“繁殖材料”包括适用于经无性或有性繁殖途径产生后代的那些植物部分，对天性繁殖，象果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物特。优选的繁殖材料是块茎和种子。
在另外一个实施方案中，本发明涉及本发明植物的可收获的植物部分，如果实、叶子、贮藏根、根、花、芽、籽苗或茎，优选种子或块茎。
在另外一个优选实施方案中，本发明涉及动物和/或人类的食料，其含有本发明的可收获的植物部分，优选种子或块茎。
优选本发明的植物部分消耗后对人类和/或动物健康有利，这是与那些没有用本发明方法进行遗传修饰的相应植物部分相比较而言的。本发明的动物和/或人类食料的情况与此相同。对于人类，本发明食料的消耗可导致例如改善肠道菌群组成，特别是增加肠道内双歧杆菌含量，据推测此菌有利于人类健康(Izzo,Trends in Food Science＆Techno1ogy9(1998),255-257)。这些有利的作用优选是预防性作用或支持食料利用的作用。
本发明另外的主题是产生宿主细胞的方法，其中用本发明的核酸分子或载体转化适宜宿主细胞。各种所考虑宿主细胞的转化方法是本领域技术人员已知的。
在另外的实施方案中，本发明涉及生产果糖基转移酶的方法，其中将本发明的宿主细胞在足以使本发明的核酸分子表达的条件下培养，然后从培养物中分离出果糖基转移酶，即从细胞和/或可能存在的培养基。在上述方法中，转化或转染的细胞例如在发酵罐中培养直到达到最适细胞浓度。在有可诱导的启动子的情况下，由本发明核酸分子所编码的蛋白质，只在发酵步骤结束时才被诱导表达。然后，以这种方法表达的蛋白质可按常规方法从培养基、细胞裂解物或细胞膜提取部分中纯化出来。已经表达的蛋白质，如微生物方法表达的，可通过制备型层析法或免疫学纯化方法如使用可识别由本发明核酸分子编码的蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体分离和纯化出来。在这一点上应提一下的是，具有果糖基转移酶活性并由本发明核酸分子编码的蛋白质可以额外含有功能性氨基酸序列，如蛋白质尾标物(GST、GFP、Flag、LA多肽，His-tag)，它们可能源于异源性蛋白或人工合成产生的。
而且，本发明还涉及具有果糖基转移酶活性的蛋白质，即由本发明核酸分子编码的果糖基转移酶或由本发明的方法可获得的果糖基转移酶。可优选使用本发明的果糖基转移酶去生产菊淀粉型聚果糖，也可以用它们制备能用以检测和/或纯化果糖基转移酶的抗体。
本发明另一个主题是与本发明核酸分子或片段特异性杂交的核酸分子，优选的是至少具有10个，特别是15个，特别优选至少50个核苷酸的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸例如可用作PCR反应的引物，分子杂交的探针或其他。
本发明另一个主题是生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，其中本发明的宿主细胞或含有它们的宿主生物在允许本发明果糖基转移酶表达并合成聚果糖的条件下培养。
通过提供本发明的核酸分子，使得通过基因工程方法在生物体中生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖成为可能，至今为止，用常规方法这是不可能的。例如可以在诸如细菌，真菌或植物细胞里表达本发明的核酸分子以便增加相应果糖基转移酶活性或把它导入到正常情况下不能表达上述酶的细胞里。由于表达或额外表达本发明的至少一种核分子，本发明的宿主细胞就能合成聚果糖，特别是菊淀粉型聚果糖。因此，本发明另一个主题是可从本发明的宿主细胞以及可从植物的繁殖材料、可从植物及其收获的产物中获得的聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖。
本发明特别涉及生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允许果糖基转移酶产生和蔗糖或等价底物反应生成菊淀粉型聚果糖的条件下培养本发明宿主细胞或含有这种细胞的宿主，任选蔗糖从细胞外加入；(b)从培养的宿主细胞、宿主或从培养基中获取如此产生的聚果糖。
宿主细胞优选是植物细胞，宿主优选是植物。从植物里获取聚果糖、特别是菊淀粉型的聚果糖的方法已有介绍，如Vogel(Inulin andInulin-containing Crops,Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam,A.Fuchs(Ed)(1993),65-75))。
本发明另一个主题是体外产生聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允许向聚果糖转化的条件下将蔗糖或等价底物与本发明果糖基转移酶接触；以及(b)获取用如此产生的聚果糖。
与蔗糖等价的底物为，例如由宿主细胞或一个或几个其他酶转化成蔗糖的底物，它也可以是那些能替换用作本发明的果糖基转移酶底物的二糖或寡聚糖，一个例子是三糖棉子糖。但是，也可使用衍生化的蔗糖。优选由上述方法得到的菊淀粉是长链菊淀粉，优选聚合度DP大于20，优选大于50，特别是大于100，特别优选聚合度大于200。
本发明还涉及一种产生聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，包括从上述一种本发明的植物/植物细胞和/或从这种植物某些部分提取聚果糖的步骤。优选这种方法也包括在提取聚果糖之前先收获栽培的植物和/或其部分的步骤，特别优选在收获前栽培本发明植物的步骤。从植物或植物某些部分中提取聚果糖的方法是本领域技术人员清楚的并已有介绍，如Gibson(International Sugar Journal 96(1994),381-387),Vogel(Stud.Plant Sci.3(1993),Inulinand Inulin-Containing Crops,65-75)。
本发明还涉及聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖，它可从本发明的宿主细胞中或根据上述本发明的方法获得。这种聚果糖可优选用以生产表面活性剂，用以增加水系统的粘度，作为去污剂，作为悬浮剂，用于加速沉降剂和络合或者用于结合水。
而且，本发明的合成聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的宿主细胞可被用作食品添加剂。这种应用是有好处的，因为果聚糖对健康有利(Roberfroid等，J.of Nutrition128(1998),11-19；Kleesen等，Am.J.Clin.Nutr.65(1997),1397-1402)。
本发明也涉及生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，其特征在于真菌果糖基转移酶或表达真菌果糖基转移酶的宿主生物用于生产聚果糖。优选使用本发明的果糖基转移酶或本发明的宿主细胞。本发明首次显示用这种真菌果糖基转移酶生产菊淀粉型聚果糖是可能的。
最后，本发明涉及真菌果糖基转移酶在生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖中的应用。
已列举了这样和那样的实施方案，这对本领域技术人员是显而易见的，并包含在本发明说明书和实施例中。关于上述方法、培养基和应用的进一步文献可从现有技术中获得，如从公共图书馆、使用电子媒介等。为这一目的，公共数据库，象“Medline”是有用的，它可以利用互联网获得，如在以下的网址上http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其它数据库和网址本领域技术人员是清楚的，并能在互联网上找到，如在网址http//www.1ycos.com上。在Berks,TIBTECH12(1994),352-364上提供了有关生物技术专利或专利申请的资源和信息纵览。
图1表示用于转化细菌的质粒pSK-asl的结构。
图2表示用于转化酵母细胞的质粒p112-asl的结构。
图3表示用于转化植物细胞的质粒pA7-asl的结构。
图4表示用于转化植物的质粒p35-asl的结构。
图5表示用于转化植物的质粒p35-s3-asl的结构。
图6表示用pSK-asl转化的大肠杆菌的薄层层析分析结果。第一道表示用无pBluescript SK插入片段的载体的对照实验结果。第二道表示用质粒pasl的实验结果，其中asl编码区不在lacZ基因的读码框里(第2道)。在这种情况下，asl编码区不能与β-半乳糖苷酶融合翻译，而从内源性起始密码子开始进行，效率低。第3道到第6道表示pSK-asl多种转化子的实验结果。当细菌长到OD600达0.4时，开始用100mMIPTG诱导培养物，诱导两小时后，收集细胞，并在50mM磷酸钠(pH6.0)中裂解。把蛋白提取物与600mM蔗糖在37℃下保温12小时。作为薄层层析的标准品，第7-9道分别上样品为1-蔗果三糖(7)，蔗糖(8)和果糖(9)。
图7表示含有质粒p112-asl(第2道)或p112-aslL(第3道)的转化酵母细胞的薄层层析分析结果。载体p112-aslL含有菠菜蔗糖转运蛋白的5＇前导序列。第1道表示未转化的酵母细胞的对照实验结果。从酵母的蛋白提取物中检测到了果糖基转移酶活性。作为标准品，第4道上是果糖，第5道是1-蔗果三糖、nystose和果糖-nystose混合物，第6道是蔗糖。
图8表示含有pA7-asl质粒的植物细胞的薄层层析分析结果。第1道表示用不带有插入片段pA7的载体的转化分析结果(50μg)；第2道-5道表示用pAT-asl载体转化的分析结果(第2道上样10μg，第3道20μg，第4、5道50μg)。作为标准品，第6道上为1-蔗果三糖、nystose和果糖-nystose的混合物，第7道为蔗糖，第8道为果糖。
对每次实验，均用500,000个原生质体。在转化后，原生质体于25℃保温2天，然后在50mM磷酸钠(pH6.0)中得到蛋白提取物，它与500mM蔗糖在28℃保温20小时。取4μl10倍稀释的混合物上样。
图9表示用35-asl转化的植物的薄层层析分析结果。随机选择12株植物，每次在200μl水中提取20mg叶子材料，取4μl提取物上样。作为标准品，F道上为果糖，S道上为蔗糖，St道上为1-蔗果三糖、nystose和果糖-nystose的混合物。
图10表示用35-s3asl转化的植物的薄层层析分析结果。随机选择12株植物，在200μl水中每次提取20mg叶子材料，取4μl提取物上样。作为标准品，F道上为果糖，S道上为蔗糖，St道上是1-蔗糖果三糖、nystose和果糖-nystose的混合物。
图11表示从富含果糖基转移酶的聚多曲霉中提取的蛋白质，经过“400-0mM硫酸铵”从苯基葡聚糖柱(phenyl superose column)洗脱下来的样品(E道)。在标有“M”的道中分离了分子量标志。标志蛋白分子量以KD(千道尔顿)表示在右边。
以下实施例用以说明本发明实施例1从聚多曲霉中纯化afl-SST在含有2％麦芽提取物、0.5％蛋白胨和2％蔗糖的培养基上接种聚多曲霉IAM2544。培养基通过加入2％琼脂固化。孢子被铺在平板上并在25℃保持直到平板完全干燥。从平板上收集分生孢子，再溶解在50mM磷酸钠(pH6.0)中。用三通道法氏压力器(French Pressure Cell)来裂解分生孢子。
为纯化，把匀浆物吸附到Sepharose Q柱上，用0-1000mM氯化钾线性梯度洗脱结合的蛋白。在500～700mM氯化钾之间得到具有蔗糖水解活性的部分，把这些部分洗脱液合并并对磷酸钠缓冲液(pH6.0)透析。为了富集蛋白，把它再吸附到Sepharose Q上(床体积为2ml)，用10ml体积洗脱。把洗脱液调到2M硫酸铵浓度，并吸附到phenylsuperose上，用2M硫酸铵洗涤后，用带有2M～0M硫酸铵线性梯度的100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)洗脱。在400～0mM的硫酸钠洗脱梯度中得到有活性的部分。把得到的蛋白混合物作SDS-PAGE电泳分析，结果表示在图11中。Muramatsu和Nakakuki介绍了用聚多曲霉的菌丝体相似地富集蔗糖水解活性(Biosci Biotech Biochem59(1995),208-212)。该纯化没有得到对测序适用的同质性蛋白。
为了鉴定果糖基转移酶，使用了半变性的聚丙烯酰胺凝胶，把10μg在phenyl superose柱上用0.1％SDS、10％甘油、50mMTris pH6.8洗脱下来的蛋白样品上样。电泳后，把凝胶放在50mM磷酸钠(pH6.0)，1％Triton×100中再缓冲三次10分钟，然后再在50mM磷酸钠pH6.0，1％Triton×100,500mM蔗糖中孵育30分钟，然后把凝胶在0.1％(w/v)2,3,5-氯化三苯基四唑鎓(TTC),0.5MNaOH中煮沸。由此TTC和还原型糖一起形成红色甲染料。在图11中标记出来的蛋白带就是由于这种蛋白有蔗糖水解活性而产生的斑点，因此，它就可被鉴定为聚多曲霉的果糖基转移酶。从制备胶里分出这种蛋白带，并从胶中洗脱出这种蛋白用以测序。由于该蛋白N-末端是封闭的，用内肽酶LysC和AspN进行酶解，通过HPLC纯化多肽，并按Edmann方法进行测序，得到以下序列LysCVLPSTSQASEK(SEQ ID No.3)AspNDDPLVTYR (SEQ ID No.4)DPYVFQNHEV (SEQ ID No.5)为了克隆这个基因，在噬菌体λZapⅡ中构建了eDNA文库(Stragene,Heidelberg)。因为从分子孢子中制备RNA是不可能的，所以就按Logemann等人的方法从菌丝体中来制备RNA(Anal.Biochem.163(1987),16-20)，通过polyA吊钩系统(polyA TractSystem)得到polyA+-RNA(Promega,Medison.USA)。按照操作手册说明合成cDNA并在λZapⅡ噬菌体中进行克隆(Stratagene,Heidelberg)。根据蛋白的序列，设计了下列引物引物asp19下游5＇-GAYGAYYTNGTNACNTAYMG (SEQ ID No.6)引物asp19上游5＇-CKRTANGTNACNARRTCRTC (SEQ ID No.7)引物asp31-下游5＇-GTNTTYCARAAYCAYGARG (SEQ ID No.8)引物asp31上游5＇-TGRTTYTGRAANACRTANGG (SEQ ID No.9)引物lysl上游5＇-GCYTGNSWNGTNSWNGG (SEQ ID No.10)在用完整的cDNA文库作底物和asp19下游/asp31上游引物组合的PCR反应中(退火温度为40℃)，得到一个约为350bp的DNA片段，放射标记后用以筛选cDNA文库(Megaprime Kit,BoehringerMannheim,Mannheim)。体内切除后，以pBluescript质粒来扩增得到的克隆。内切酶酶解后，对cDNA插入片段进行比较，并对克隆的插入片段完全测序，其序列表示在SEQ ID No.1中，由其推导的蛋白质序列表示在SEQ ID No.2中。
实施例2
为转化各种原核和真核宿主细胞而构建含有真菌果糖基转移酶编码区的重组子。
为了用真菌果糖基转移酶转化各种宿主细胞，根据分子生物学标准技术方法制备了许多不同的重组子(Sambrook等，1989,ColdSpring Harbor Laboratory Press)，这些重组子表示在图1-5中，其制备方法分述如下pSK-asl是pasl的衍化子，pasl是在体内切割后从聚多曲霉eDNA文库的一个λZapⅡ克隆中得到的。pasl含有作为EeoR Ⅰ/XhoⅠ片段的cDNA。pSK-asl由pasl而来，是通过BamHⅠ和SmaⅠ酶切，再填平BamHⅠ的粘性末端，再连到载体上而得到。通过去掉4个核苷酸，asl的编码区就被接入到LacZ基因的读码框中(图1)。
p112-asl是克隆在p112A1NE载体上的(见Riesmeier等，EMBOJ.11(1992)4705-4713)，先用BamHⅠ酶切，填平粘末端，然后再用NotⅠ酶切，从pasl中得到asl片段(先用Asp718酶切，填平后再用NotⅠ酶切)(图2)。
pA7-asl是从pA7而来的，通过把pasl编码区(Smal/Asp718酶切片段，填平粘末端)克隆到载体已填平的Asp718和SmaⅠ酶切位点的上得到的。通过HindⅢ酶切来证实片段的正确方向，酶切可产生大约1900bp的片段。pA7是pUC18的衍化子，在EcoRⅠ和Asp718之间含有花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子(CaMV528bp；nt6909-7437,Franck等，Cell 21(1980),285-294)，在SphⅠ和HindⅢ之间还含有根癌农杆菌章鱼氨酸合成酶基因的终止子(Gielen等，EMBO J.3(1984),835-846)(图3)。
p35-asl是从pBinAR来的，通过把pasl用Asp718/Notl酶切、填平得到的asl片段连到已用Smal酶切的载体上而得到。pBinAR是pBin19的衍化子(Bevan,Nucl.Acids Res.12(1984),8711),在EcoRⅠ和Asp718之间含有花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(CaMY,528bp；nt6909-7347,Franck等，同上)，在SphⅠ和HindⅢ之间还含有根癌农杆菌章鱼氨酸合成酶基因的终止子(Gielen等，同上)(图4)。
p35-s3-asl是两步克隆出来的。第一步，把来自pasl的BamHⅠ/Asp718片段(粘末端用T4聚合酶填平)克隆到pS3载体上(它已用BamHⅠ酶切并填平了)，因此，就得到pS3-asl重组子。载体pS3含有patatin基因B33的PCR扩增片段(Posahl等，Mo1.Gen.Genet.203(1986),214-220)，后者含有725-1400个核苷酸。这个PCR片段在725核苷酸位置上装上了一个Asp718酶切位点(GGTACC)，在1400位置上装上ATGG序列，结合1399和1400位核苷酸就产生了一个NcoⅠ酶切位点。把这个PCR片段插到Asp718和SmaⅠ内切酶位点之间。从pS3-asl制备SacⅠ(填平)/XbaⅠ片段，它含有融合S3-asl片段。把这一片段克隆到pBinAR上的SmaⅠ和XbaⅠ内切酶位点之间(图5)。
用标准方法转化相应宿主。根据Hanahan(J.Mol.Biol.166(1983),557-580)的方法转化大肠杆菌，根据Dohmen等人的方法转化啤酒酵母(Yeast7(1991),691-692)，根据Damm和Willmitzer的方法，在烟草原生质体中进行临时性表达(Mol.Gen.Genet,213(1989),15-20)，根据Dietze等人的方法对马铃薯进行稳定转化(Potrykus,I and G.Spangenberg(Ed.),Gene trasfer to plants,xxii+361(1995),24-29；Springer-Verlag；Berlin,Germang；New York,New York,USA.ISBN3-540-58406-4)。
实施例3表达真菌果糖基转移酶的转基因宿主细胞或生物体的果糖基转移酶的活性分析。
菊淀粉的体内合成表达真菌果糖基转移酶的转基因宿主细胞或生物体培养在含2％蔗糖(植物组织除外)的培养基上。在以大肠杆菌K12作宿主生物体的情况下，把编码大肠杆菌蔗糖通透酶的功能性cscB基因作为重组子引入到pACYC184载体上。在啤酒酵母的情况下，把菠菜的蔗糖转运蛋白基因引入到p112AINE载体上(Riesmeie等，EMBO J.11(1992),4705-4713)。细胞在有蔗糖存在情况下至少培养24小时，然后收集细胞，用50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)洗涤后破碎。
表达真菌果糖基转移酶的植物栽培在土壤中。4周后采集叶子和其他组织标本，并在1ml水/g鲜重中在不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮存在下提取，通过离心去掉细胞碎片。
每次在预铸DC胶片的硅胶上上样4μl提取物(Schleicher和Schüll,Dassel,Germany)并在丙酮/水(87∶13)中展开两次。用尿素-磷酸试剂进行果糖残基检测试验(Rber等，Planta199(1992),528-536)。
菊淀粉的体外合成在50mM磷酸钠(pH6.0)、50μMPMSF、lmMDTT、10％(v/v)乙二醇溶液中破碎表达真菌果糖基转移酶的细胞，把细胞提取物在50mM磷酸钠(pH6.0)、500mM蔗糖、50μMPMSF、lmMDTT、0.02％(w/w)NaN3、10％(v/v)乙二醇溶液中，于25℃保温12小时。用水10倍稀释混合物，然后在预铸的硅胶DC膜上上样4μl(Schleicher和Schüll,Dassel,Germany)并在丙酮/水(87∶13)中展开两次。用尿素-磷酸试剂进行果糖残基的检测试验(Rber等，同上)每个分析的结果分别表示在图6到10中。这些图是孵育混合物或细胞匀浆进行薄层层析后用含果糖的糖类染色的硅胶凝胶膜的显影结果。利用在丙酮/水(87∶13)中进行薄层层析，单糖、寡糖和多聚物就可根据大小分开。果糖比蔗糖迁移的更远，依次蔗糖比蔗果三糖迁移的更远等等。聚合度(DP)大于7的寡聚糖或更大的糖类未能分开，仍保留在上样原点上。
在图6中可以看到，用不带插入片段的载体pBluescript转化的大肠杆菌克隆株，不能转化蔗糖(第1道)，而用pasl质粒转化的克隆株合成了三糖-蔗果三糖。用质粒pSK-asl转化的克隆株也能合成较大分子量的寡聚糖(第3～6道)。同时，果糖残基转移到水里，因此形成果糖。上面提到的转化是由来自聚多曲霉的SFT所催化的。图7表示用质粒112-asl所转化酵母的蛋白提取物可以合成果聚糖。这些酵母中的果糖基转移酶活性高于用质粒112-aslL转化的酵母菌。由于在实验有效的时间内能得到果糖基转移酶活性数量较少，所以后者只能合成三糖。合成的果聚糖分子大小取决于反应时间和果糖基转移酶活性。图8证实，在给定的反应时间里，在转化的烟草原生质体提取物里合成的果聚糖大小取决于所生产的果糖基转移酶活性数量，后者又取决于转化的pA7-asl质粒的数量。在第3～5道中可以看到，已合成了聚合度(DP)大于7(DP＞7)的寡糖和多糖，它们在层析时没有从上样点迁移出去，同样情况适用于从稳定转化植物的提取物，见图9和10中所示。
序列表<110> Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften e.V.<120>编码具有果糖基转移酶活性的酶的核酸分子及其应用<130>C1056PCT<140><141><160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2197<212>DNA<213>聚多曲霉<400>1gaattcggca cgaggccgcc atgaagctcc cctcttcact ggacattctt ctcgccagac 60aggcggttgg cggtactgag gtcgactacg actcaccacc ccctgacctg acgacgctcc 120ctgagaactc gctgttcgag acctggagac ccaagatcca cgttctgccc ccaaatggcc 180aaatcgggga cccatgcgct cattacaatg acccggcgac gggtttgttc catgtcggat 240tcctccacaa tggcaccggc atttccagcg tctacaccga tgacctggtg acctatcgtg 300atatcaatcc taacggcggc tacattattg ttgctggtgg ccccaatgac cccgaagccg 360tctttgatgg atctgtcatc cccagcggaa tcgatgacct gcccacgctc ctttatacct 420ctgtgacatc gttgccaatc cactggactc taccttatac ccccggaagc gagactcagt 480cactggccgt aagtgacgat ggtggtcacc acttcgataa gcttgaccga ggcccagtca 540ttccacttcc gccagatgga ctcgatgtta cagccttccg tgacccttat gtattccaga 600accacgaggt agacgaagtt accggtagtg acccagatac atggtatgcc gccatatccg 660ggggtgtcca tgatgtaggg cccggaatct ttctctaccg caaccaagac tcctcctttg 720agaactggga atatctaggc gagtggtggc aagaacccgc caactcgact tggggtgacg 780gcacttgggc caaacgctgg ggctacaatt tcgaaaccgg caacgtcttc tctctcgatc 840gagaagggta caacgttgac ggccacacgt ttatgactat tggagttgag ggtgcatacg 900cgcccatcca gccctcggtt acatctatgc atgccatgct gtgggcagcg ggaaatgttt 960cctcagagaa tggcgaaaac gttaccttca cgccttatat ggccggtgct ttggactggg 1020gcatggccgc atacgccggt gctggaaagg ttctacccag cacatctcag gcttctgaga 1080agagtggagc gcccgaccgc ttcatctcgt gggtttggct tacaggtgat gaatttggtg 1140ctgccgctgg atttcctgct gcccagcagg ggtggcagaa tactctcctg cttccgcgtg 1200aattgagtat acacacaatc cagaatgtgg tcgacaacga actcatccac gagactgcat 1260cctggcgtgt ggcagaacat ggcggcgaga ggagatctgg tggtgtcgag ctggagacac 1320tgggaatcaa tattgcgagg gagacctacg atgcaatcgt ctcttctggg acctcgtttg 1380aggagccttc gcgagacatt aatgaatccg gcaccattcc atttgagcgc tcgcccacta 1440gcaggttctt cgcccttgaa gcccaaatct ccttccccca gtctgcgcga gactcggaag 1500tccagtccgg atttcaaatc cttgcttctg aactcgagtg gacgacgatc tattatcagt 1560tttcgaatga gtcgattgtc attgaccgta accacacaag tgctgcgtcc gagactacac 1620ctggtctcgg tactgtgact gagtctggcc gtatccggct tttcgatatc gcgggtggtt 1680gcgatcatga tggacatggc ggccacgatg gcggcaacga tgatgaccac aacggtgacg 1740gtgatcatag cggtgacggt gaccacaatg acgatgatga ccataacgtc gacggcgatg 1800acaaggagcg tgctcgttac caaaagcgag atggcccttg cgataaagac catgataagg 1860ttgagacatt ggatctcacc attgtcgtcg ataactcagt gcttgaagtt tacgccaact 1920cacgatttgt ggtgtcgacc tgggttcggc cttggtacac caattcaacg gagattcgct 1980tcttccacaa cggcgagggt gaggtcagct ttgacaacat tgcggttcat gatggtctgt 2040atgatgcata tccggacagg gacaactgaa gatttcactg gttgatgtat tagcttgcga 2100gctataaaga tggcgataat tagtagattt aatccaatga attacctgcc gagattgcag 2160atttattctt acaaaaaaaa aaaaaaaaaa actcgag 2197<210>2<211>682<212>PRT<213>聚多曲霉<400>2Met Lys Leu Pro Ser Ser Leu Asp Ile Leu Leu Ala Arg Gln Ala Val1 5 10 15Gly Gly Thr Glu Val Asp Tyr Asp Ser Pro Pro Pro Asp Leu Thr Thr20 25 30Leu Pro Glu ASh Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro Lys Ile His Val35 40 45Leu Pro Pro Asn Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Asn Asp50 55 60Pro Ala Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly65 70 75 80Ile Ser Ser Val Tyr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg Asp Ile Asn85 90 95Pro Ash Gly Gly Tyr Ile Ile Val Ala Gly Gly Pro Ash Asp Pro Glu100 105 110Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Ile Asp Asp Leu Pro115 120 125Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Thr Ser Leu Pro Ile His Trp Thr Leu130 135 140Pro Tyr Thr Pro Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ser Asp Asp145 150 155 160Gly Gly His His Phe Asp Lys Leu Asp Arg Gly Pro Val Ile Pro Leu165 170 175Pro Pro Asp Gly Leu Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe180 185 190Gln Asn His Glu Val Asp Glu Val Thr Gly Ser Asp Pro Asp Thr Trp195 200 205Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val His Asp Val Gly Pro Gly Ile Phe210 215 220Leu Tyr Arg Asn Gln Asp Ser Ser Phe Glu Asn Trp Glu Tyr Leu Gly225 230 235 240Glu Trp Trp Gln Glu Pro Ala Asn Ser Thr Trp Gly Asp Gly Thr Trp245 250 255Ala Lys Arg Trp Gly Tyr Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Phe Ser Leu260 265 270Asp Arg Glu Gly Tyr Asn Val Asp Gly His Thr Phe Met Thr Ile Gly275 280 285Val Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Ile Gln Pro Ser Val Thr Ser Met His290 295 300Ala Met Leu Trp Ala Ala Gly Asn Val Ser Ser Glu Asn Gly Glu Asn305 310 315 320Val Thr Phe Thr Pro Tyr Met Ala Gly Ala Leu Asp Trp Gly Met Ala325 330 335Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Lys Val Leu Pro Ser Thr Ser Gln Ala Ser340 345 350Glu Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Trp Val Trp Leu Thr355 360 365Gly Asp Glu Phe Gly Ala Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ala Gln Gln Gly370 375 380Trp Gln Asn Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Ser Ile His Thr Ile385 390 395 400Gln Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Ile His Glu Thr Ala Ser Trp Arg405 410 415Val Ala Glu His Gly Gly Glu Arg Arg Ser Gly Gly Val Glu Leu Glu420 425 430Thr Leu Gly Ile Asn Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Val Ser435 440 445Ser Gly Thr Ser Phe Glu Glu Pro Ser Arg Asp Ile Asn Glu Ser Gly450 455 460Thr Ile Pro Phe Glu Arg Ser Pro Thr Ser Arg Phe Phe Ala Leu Glu465 470 475 480Ala Gln Ile Ser Phe Pro Gln Ser Ala Arg Asp Ser Glu Val Gln Ser485 490 495Gly Phe Gln Ile Leu Ala Ser Glu Leu Glu Trp Thr Thr Ile Tyr Tyr500 505 510Gln Phe Ser Asn Glu Ser lle Val lle Asp Arg Asa His Thr Ser Ala515 520 525Ala Ser Glu Thr Thr Pro Gly Leu Gly Thr Val Thr Glu Ser Gly Arg530 535 540Ile Arg Leu Phe Asp Ile Ala Gly Gly Cys Asp His Asp Gly His Gly545 550 555 560Gly His Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp His Asn Gly Asp Gly Asp His565 570 575Ser Gly Asp Gly Asp His Asn Asp Asp Asp Asp His Asn Val Asp Gly580 585 590Asp Asp Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gln Lys Arg Asp Gly Pro Cys Asp595 600 605Lys Asp His Asp Lys Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Ile Val Val Asp610 615 620Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Ser Arg Phe Val Val Ser Thr625 630 635 640Trp Val Arg Pro Trp Tyr Thr Ash Ser Thr Glu Ile Arg Phe Phe His645 650 655Asn Gly Glu Gly Glu Val Ser Phe Asp Asn Ile Ala Val His Asp Gly660 665 670Leu Tyr Asp Ala Tyr Pro Asp Arg Asp Asn675 680<210>3<211>11<212>PRT<213>聚多曲霉<400>3Val Leu Pro Ser Thr Ser Gln Ala Ser Glu Lys1 5 10<210>4<211>7<212>PRT<213>聚多曲霉<400>4Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg1 5<210>5<211>10<212>PRT<213>聚多曲霉<400>5Asp Pro Tyr Val Phe Gln Ash His Glu Val1 5 10<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>6gaygayytng tnacntaymg20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>7ckrtangtna cnarrtcrtc20<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>8gtnttycara aycaygarg19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>9tgrttytgra anacrtangg20<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工序列<400>10gcytgnswng tnswngg1权利要求
1．编码果糖基转移酶的核酸分子，其选自下组(a)编码一种包含SEQ ID No.2中所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；(b)包含SEQ ID No.1中所示编码区核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)与(a)或(b)的核酸分子的互补链杂交的核酸分子；(d)核苷酸序列由于遗传密码子的筒并性而与(c)的核酸分子序列不同的核酸分子；以及与其互补的核酸分子。
2．根据权利要求1的核酸分子，它是DNA或RNA分子。
3．根据权利要求1或2的核酸分子，其编码一种真菌多肽。
4．根据权利要求3的核酸分子，其中真菌要是曲霉属的真菌。
5．含有根据权利要求1～4中任何一项的核酸分子的载体。
6．根据权利要求5的载体，其中核酸分子可操作地与保证可翻译RNA在原核和/或真核细胞中转录和合成的调控元件相连。
7．根据权利要求6的载体，其中核酸分子含有编码影响果糖基转移酶细胞内或细胞外定位的信号序列的区域。
8．用根据权利要求1～4中任何一项的核酸分子或根据权利要求5～7中任何一项的载体所转化的宿主细胞或源于这种细胞的细胞。
9．根据权利要求8的宿主细胞，它是细菌细胞或真菌细胞。
10．已用权利要求1～4中任何一项的核酸分子或权利要求5～7中任何一项的载体转化了的植物细胞或源于这种细胞的细胞。
11．一种制备植物的方法，其中(a)通过引入权利要求1～4中任何一项的核酸分子和/或权利要求5～7中任何一项的载体而遗传修饰植物细胞，和(b)由该细胞再生植物，和任选地(c)再从(b)中的植物繁殖植物。
12．含有根据权利要求10的植物细胞或可由权利要求11的方法得到的植物细胞的植物。
13．根据权利要求12的植物，它是一种有用植物。
14．含有权利要求10的植物细胞的权利要求12或13植物的繁殖材料。
15．权利要求12或13的植物可收获的植物部分。
16．含有权利要求15的可收获植物部分的动物和/或人类的食料。
17．一种制备权利要求8或9的宿主细胞的方法，其中用权利要求1～4任何一项的核酸分子或用权利要求5～7中任何一项的载体转化适当的细胞。
18．一种制备果糖基转移酶的方法，其中根据权利要求8或9的宿主细胞或权利要求10的植物细胞在允许合成果糖基转移酶的条件下培养，并从培养细胞和/或培养基分离出果糖基转移酶。
19．由权利要求1～4中任何一项的核酸分子编码的或可由权利要求8的方法得到的果糖基转移酶。
20．与权利要求1～4中任何一项的核酸分子或其互补链特异性杂交的核酸分子。
21．一种生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允许产生果糖基转移酶的条件下培养权利要求8或9的宿主细胞或含有这种细胞的宿主，并将任选加入的蔗糖或等价底物转化为聚果糖，和(b)从培养的细胞、宿主或培养基得到如此产生的聚果糖。
22．一种生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，包括(a)在允许转化成聚果糖的条件下，用权利要求19的果糖转酶接触蔗糖或等价底物；和(b)获取如此产生的聚果糖。
23．一种生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法，包括从权利要求10的植物细胞、权利要求12或13的植物或这种植物的部分提取聚果糖的步骤。
24．一种生产表面活化剂的方法，包括权利要求21或22的(a)步骤和(b)步骤或权利要求23的提取步骤。
25．权利要求8或9的宿主细胞或权利要求10的植物细胞作为食品添加剂的应用。
26．权利要求19的果糖基转移酶在生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖中的应用。
全文摘要
公开了编码具有果糖基转酶活性的多肽的核酸分子，还公开了含有这种核酸分子的载体、宿主细胞和转基因植物，以及使用所述宿主和/或由它们所产生的果糖基转移酶生产聚果糖、特别是菊淀粉型聚果糖的方法。
文档编号A23L1/09GK1317048SQ99810593
公开日2001年10月10日 申请日期1999年8月27日 优先权日1998年9月2日
发明者A·G·海尔, J·雷姆, R·温登伯格 申请人:马普科技促进协会