专利名称：新型受体蛋白及应用其的炎症疾病诊断方法
技术领域：
本发明涉及自未成熟树状细胞中发现的新型七次跨膜受体蛋白及编码其的DNA。更详细地说，就是涉及序列2记载的氨基酸序列构成的人类来源的七次跨膜受体蛋白及编码其的DNA。应用本发明的七次跨膜受体蛋白及编码其的DNA，能够完成对树状细胞功能有关疾病的治疗或预防有用物质的筛选、这些疾病的诊断方法并制造诊断药物。此外，本发明还涉及由上述DNA插入可复制表达载体而重组的能够复制的重组DNA，上述能够复制的重组载体转化的微生物或培养细胞，上述转化体细胞表面表达的七次跨膜受体蛋白，上述七次跨膜受体蛋白的配基和阻断此配基和七次跨膜受体蛋白聚合的物质的筛选方法，以及和上述七次跨膜受体蛋白结合的抗体。更进一步，本发明涉及包括测定人白细胞表达的七次跨膜受体蛋白表达量的炎症疾病诊断方法。
作为抗原呈递细胞之一的巨噬细胞，对活化的T细胞和B细胞进行抗原呈递(Sornasse等，J.Exp.Med.,175,15-21,1992)，但辅助T细胞的活化依赖于树状细胞引导的抗原呈递。据认为，树状细胞取得外周血中的抗原，在淋巴液中移动，最终在淋巴结中成熟。巨噬细胞和树状细胞完全成熟阶段同时对活化的T细胞进行抗原呈递，但也有报道表明成熟树状细胞能够单独激活原始T细胞(Mehta-Damani等，J.Immunology,153,996-1003,1994)。树状细胞是从造血干细胞中衍生的，但树状细胞的前体和未成熟树状细胞也在血液和淋巴液中存在，完全成熟的树状细胞存在于脾脏和淋巴结。一般来说未成熟树状细胞提取抗原的能力高，成熟后抗原呈递能力上升。因此，进行抗原呈递的树状细胞大量表达MHC(主要组织相容性复合物)Ⅰ类的蛋白和Ⅱ类的蛋白。
如上所述，树状细胞和机体内的免疫和炎症有关，引起有益的免疫应答，加强机体防御。但是，也引起自身免疫等不希望发生的免疫作用和炎症作用。所以，据认为发现控制树状细胞功能的方法，就可以产生有益免疫应答反应而使感染和肿瘤治愈、或减轻有害免疫应答反应而治疗自身免疫性疾病等。
树状细胞的功能，即其增殖、分化、活化、化学趋化等，是由树状细胞表达的各种受体蛋白所控制的。受体是存在于细胞表面、和其它细胞表面和体液中存在的特定物质(信号分子)高亲和力结合，将与信号分子结合的细胞外信息转换为细胞内信号从而引起细胞应答的蛋白质(Alberts,Bruce等编，"Molecular Biology of the Cell",第2版，Garland Publishing,Inc.,681-726页,1989)。和受体结合的物质一般称为配基。使树状细胞表达受体功能变化的物质，即有和受体结合刺激细胞的物质、和受体结合阻断其它配基所致刺激的物质、阻断其它配基所致刺激向细胞内传导的物质，所得物质正控制或反控制树状细胞的功能，能够治疗树状细胞功能不足或过强所致的疾病。
作为受体，已知有细胞因子受体家族、EGF(表皮生长因子)受体家族、七次跨膜受体家族等各种受体蛋白("The Leukocyte AntigenFacts Book",Academic Press Inc.,38-49,1993)，其功能多种多样。这些受体家族之一的七次跨膜受体蛋白家族，又称为G蛋白耦联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)、视紫红质型受体等。七次跨膜受体蛋白的研究只是在近年才开始，应该还存在很多未知的七次跨膜受体蛋白。
以白细胞为例，至今为止已知白细胞中存在的七次跨膜受体有过敏毒素结合的受体家族、趋化因子结合的受体家族、PAF(血小板活化因子)结合的受体等。过敏毒素的受体和嗜中性粒细胞和巨噬细胞的功能，例如活性氧的生成、化学趋化、细胞接触的活化等有关(Bouley,F.et al,Biochemistry,30,2993-2999,1991)。此外，对于作为趋化因子结合受体家族之一的IL-8(白细胞介素8)受体同系物缺陷的小鼠腹腔给予炎症诱导物质，可见嗜中性粒细胞浸润减少、嗜中性粒细胞增多(嗜中性粒细胞活化增殖但没有浸润)、骨髓、淋巴结的粒细胞和浆细胞增加等(饭笹久和松岛纲治著，临床免疫28,731～737,1996)。作用于这些受体的物质中，在可能作为疾病的治疗药物的物质中，有IL-8和MCP-1(单细胞化学趋化蛋白1)等结合受体而刺激细胞的物质、如IL-8类似物等结合受体而阻断配基所致刺激的物质(Howard,O.M.Z.等TIBTECH,14,46-51,1996)。但是，多数情况下，受体和多个信号分子结合，或者信号分子和多个受体结合。因此，考虑疾病的治疗时，只了解信号分子是不够的。例如，对于5-羟色胺，和5-羟色胺这一单一的信号分子相对应，共计有14种受体，包括七次跨膜受体外离子通道型受体等完全不同信号传导途径的受体；更进一步，已知与此14种受体特异结合的化合物(1996Receptor&Ion Channel Nomenclature,Supplement 1-81 TrendsPharmacol.Sci.,1996)，可应用于各种不同受体疾病的治疗。此外，为趋化因子家族时，已知有单一信号分子(一种趋化因子)和多种受体反应的同时单一受体和多种信号分子(多种趋化因子)反应的情况(Power,C.A.等，Trends Pharmacol.Sci.,17,209-213,1996)。
如上所述，即使单一信号分子是疾病的原因，因细胞种类的不同也存在多种受体。所以为了控制作为疾病原因的特定细胞群的功能，相对于确定作用于其细胞的特定信号分子，更重要的是确定其细胞表达的受体。例如，以作为信号分子之一的趋化因子家族为例，存在多种对作用于白细胞的信号分子RANTES(活化中受调节，正常T细胞表达与分泌的Regulated on Activation，Normal T Cell expressed andsecreted)反应的白细胞，不能特定和RANTES显示出反应性的白细胞。但是，白细胞之一的嗜酸性粒细胞特异表达趋化因子受体之一的CCR3(C-C趋化因子受体3)，所以应用受体CCR3就可能得到特异控制嗜酸性粒细胞的方法(Howard,O.M.Z.等，TIBTECH,14,46-51,1996)。
此外，已知人类和其它生物的受体对相同化合物的反应可能不同(例如Marleau,S.等，J.Immunol.157,4141-4146,1996)。已知有对人类受体显示出活化作用的物质对其它种属受体是抑制活性物质的例子(例如Choe,H.等，Cell 85,1135-1148,1996)，如此结合受体的分子已知有能够预防病毒感染的(例如Bleul,C.C.等，Nature,382,829-833,1996)。在这种情况下，了解病毒感染细胞表达的受体是很重要的。此外，已知特定病毒能和特定生物种的受体结合而引起感染。
在信号分子中(例如趋化因子PF4和HCC1等)，推测其受体为七次跨膜受体，但受体蛋白尚未鉴定出来(Premack,B.A.等，NatureMedicine,2,1174-1178,1996；和Loetscher,M.等，J.Exp.Med.,84,963-969,1996)。特别对于趋化因子家族，推测存在更多未知的趋化因子(Howard,O.M.Z.等，TIBTECH,14,46-51,1996)，对应未知的趋化因子可望存在很多受体。
和上述白细胞的情况一样，作用于树状细胞的分子的受体并没有被完全了解，树状细胞也存在很多七次跨膜受体。作为成熟树状细胞中存在的七次跨膜受体，已报道有ChemR23(Samson,M.等，Eur.J.Immuno1.,28,1689-100,1998)。只要取得树状细胞不同分化阶段中表达的受体、进一步取得改变这些受体作用的物质，能够控制树状细胞的功能，还可确立控制疾病的方法。
作为作用于七次跨膜受体的内源性物质，已知对应各种受体有各种物质。例如，作为生理胺的谷氨酸和多巴胺分别作用于谷氨酸受体和多巴胺受体。此外，作为肽的神经肽Y和内啡肽分别与神经肽Y受体和内啡肽受体结合(Watson，S.和Arkinstall,S.,"The G-proteinlinked receptor Facts Book",Academic Press Inc.,1994)。在这之中包括如趋化因子和PAF等已知作用于白细胞的物质，以及不作用于白细胞的物质。
上述活化七次跨膜受体的物质，不论天然、非天然，其物质、七次跨膜受体和表达受体的细胞三者的各自状态相互依赖，从而引起细胞内信号的变化。此信号的变化例如细胞内cAMP浓度的上升和下降、磷酸肌醇浓度的上升、细胞内钙浓度的上升等(Watson,S.和Arkinstall,S.,"The G-protein linked receptor Facts Book",Academic Press Inc.,1994)，目前已经开发出分别测定的方法。所以，测定上述各种反应，能够判断特定物质是否活化特定的七次跨膜受体、或抑制其活化。还有，已知观察这些物质和七次跨膜受体结合所致的细胞增殖、基因表达的变化和化学趋化等生理学现象的方法，可以用这些现象作为指标判断某物质是否活化特定七次跨膜受体、或抑制其活化。如此作用于七次跨膜受体的物质的确认方法多种多样，为了应用这些方法得到作为人类医药品有用的物质，首先取得人类来源的七次跨膜受体蛋白是很必要的。
同样地，得到特异作用于各种七次跨膜受体(例如趋化因子受体家族)的物质有助于开发出选择性抑制特定炎症反应的新药。
以趋化因子为例，一组趋化因子和趋化因子受体控制各种白细胞的趋化。所以推测特定白细胞表达特异的趋化因子受体。实际上，已有报道CCR5在Th1细胞中表达、CCR4在Th2细胞中表达(Loetscher,P.等，NATURE,391,344-345,1998；和Bonecchi,R.等，J.Exp.Med.,187,129-134,1998)，表明对于抗原非特异性炎症，特异细胞性免疫和体液免疫反应的选择涉及趋化因子受体。此外，CXC和CC趋化因子等主要作用于嗜中性粒细胞和单核细胞的趋化因子在急性或慢性炎症反应中起重要作用，因此称为炎症趋化因子。对于此炎症趋化因子的受体，例如分析外周血中趋化因子受体的表达就能够检测炎症疾病和此疾病的严重程度和治疗过程等。
应用上述的受体分析，可能开发出病因未明的炎症疾病等的新诊断方法和治疗方法。例如，风湿是以多发性糜烂性关节炎为主要特征、同时伴随多器官损害的不明原因全身性炎症疾病。反复缓解恶化并慢性进行，导致关节的破坏和变形，最终出现运动器官的功能障碍。目前的治疗目标是早期诊断风湿，快速并最大限度抑制风湿炎症，防止出现关节破坏等严重症状。
如上所述，风湿的治疗从早期开始非常重要。以前的金字塔方式(Smyth,C.J.,Postgrad,Med.,51,No.6,31-39,1972)的类风湿性关节炎(RA)治疗，只是用非甾体抗炎药(NSAID)进行3～6个月的治疗，在RA症状很严重后才给予疾病修饰性抗风湿药(DMARD)。NSAID治疗中RA仍然进行，导致患病关节数目增加，从而使DMARD的效果显著减弱，难于停止骨破坏。所以，为了在发生骨破坏前的初期就给予DMARD,RA的早期诊断很有必要。根据目前所用的RA诊断标准(Arnett,F.C.等，The American Rheumatism Association 1987revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis,Arthritis Rheum,31,315-324,1988)，早期诊断RA很难，至确诊至少要6周。此外，根据临床检查所见，红细胞的沉降速度(血沉组织破坏和严重亢进的非特异性反应)、组织破坏和炎症时迅速增加的急性反应物质CRP(C反应蛋白)的量，对于早期RA患者是显著增加，但这都不是RA特异性的，不能用于鉴别RA和其它胶原病。此外，也有早期RA的血沉正常，但X光见骨破坏进行的例子。更进一步，风湿病因子对于发病1年以内的早期RA 71％阳性，但发病6周内为59％，阳性率低。对于白细胞数、红细胞数、血红蛋白等，早期RA(1年以内)和早期非RA关节疾病之间没有显著差别(山前邦臣著，医学进展，182,No.9,605-610,1997)。
所以，对于风湿的治疗早期的诊断是很有必要的，不确立对风湿诊断有用的诊断标记物就难于早期诊断风湿。
本发明的新型七次跨膜受体C5L2蛋白具有和趋化因子、FMLP、C5a等趋化性因子的受体相同的结构，所以可应用于各种各样炎症疾病的医药、诊断、治疗的领域。更进一步，本发明者们推测本发明的受体对炎症疾病的诊断有用，就风湿和C5L2的联系进行了研究。结果发现，对于炎症疾病的诊断，七次跨膜受体C5L2很有用，从而完成了本发明。
因此，本发明主要的一个目的在于提供对研究控制树状细胞功能的药物有用的人类来源七次跨膜受体蛋白。
本发明的另一个目的在于提供编码上述七次跨膜受体蛋白的DNA、和此DNA插入到表达载体重组的重组DNA、以及此重组DNA转化的微生物或培养细胞。
更进一步，本发明的另一个目的在于提供筛选与七次跨膜受体蛋白结合配基的方法、筛选抑制七次跨膜受体蛋白和该蛋白的配基结合的物质的方法。
更进一步，本发明的另一个目的在于提供和七次跨膜受体蛋白结合的抗体。
更进一步，本发明的另一个目的在于提供包括测定人白细胞表达七次跨膜蛋白的表达量在内的炎症疾病诊断方法。
本发明上述及其它各种目的、各种特征和各种利益，见参照附图和序列表叙述的下面详细说明和权利要求中的记载。序列表的文字说明在序列5中，第18、22和24残基的n表示次黄嘌呤核苷/ⅰ。因为此序列和黑色素瘤的增殖有关，以公知的七次跨膜受体蛋白的序列为基础设计用于变性PCR法的引物。
在序列6中，第22和28残基的n表示次黄嘌呤核苷/Ⅰ，第21残基的n表示a、g、c或t。因为此序列和黑色素瘤的增殖有关，以公知的七次跨膜受体蛋白的序列为基础设计用于变性PCR法的引物。
序列7的序列，是在和序列1的碱基序列中第1的a至第22的t相当的22碱基序列的5’末端插入间隔序列gggg和限制性内切酶HindⅢ识别序列aagctt而形成的序列，为用于构建C5L2表达载体的化学合成引物。
序列8的序列，是在和序列4的碱基序列中第206的c至第225的a相当的20碱基序列的5’末端插入间隔序列ggga和限制性内切酶SacⅡ识别序列ccgcgg而形成的序列，为用于构建C5L2表达载体的化学合成引物。
序列9的序列是C5L2的RT-PCR所用的化学合成引物。
序列10的序列是C5L2的RT-PCR所用的化学合成引物。
序列11的序列是G3PDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的RT-PCR所用的化学合成引物。
序列12的序列是G3PDH的RT-PCR所用的化学合成引物。
图2表示从健康志愿者外周血调制的粒细胞在室温下保存时C5L2表达率的历时变化，纵轴表示C5L2的表达率，横轴表示取血后的经过时间。图中黑点表示各个值，直线是将其平均值连接。
图3表示从RA患者新鲜血液调制的粒细胞中C5L2表达率和风湿病因子的相关(分布图)，纵轴表示风湿病因子的值，横轴表示C5L2的表达率。
发明的详细说明本发明之一的形式提供了实质纯的人类来源七次跨膜受体蛋白，其特征在于具有序列2记载的氨基酸序列。
接着，为容易理解本发明，首先就本发明的基本特征和优选方案列举如下。1．基本上纯的人类来源七次跨膜受体蛋白，其特征在于具有序列2记载的氨基酸序列。2．基本上纯的肽，其特征在于为序列2记载氨基酸序列中至少5个连续氨基酸序列构成的片段。3．编码上述1记载的七次跨膜受体蛋白的分离DNA。4．根据上述3记载的分离DNA，其特征在于具有序列1记载的碱基序列。5．序列3记载DNA中至少连续12个碱基构成的DNA片段或其衍生物。6．序列4记载DNA中至少连续12个碱基构成的DNA片段或其衍生物。7．和序列3记载DNA互补的RNA中至少连续12个碱基构成的RNA片段或其衍生物。8．含有可表达载体和可操作的插入的上述3～6任一项记载DNA而重组的可复制重组DNA。9．上述8记载的可复制重组DNA转化的微生物或培养细胞。10．应用包括(a)将上述3或4记载的分离DNA与可复制表达载体连接、得到该DNA可操作地插入可复制载体重组形成的可复制重组DNA,(b)该可复制重组DNA转化微生物或培养细胞形成转化体，(c)从该微生物或培养细胞的母体细胞中选出该转化体，(d)培养该转化体、以该转化体表达该DNA等的方法在该转化体细胞表面制造的七次跨膜受体蛋白。11．筛选和上述1的七次跨膜受体蛋白结合的配基的方法，包括将上述1或10记载的蛋白、或上述2记载的肽和样品材料接触，以该蛋白或该肽和配基结合相应所起变化为指标，检测和七次跨膜受体蛋白结合的配基的方法。12．筛选抑制上述1的七次跨膜受体蛋白和该蛋白相应配基结合的物质的方法，包括将上述1或10记载的蛋白、或上述2记载的肽和样品材料接触，以该蛋白或该肽和配基结合相应所起变化为指标，检测抑制七次跨膜受体蛋白和配基结合的物质。13．和上述1记载的七次跨膜受体蛋白特异结合的抗体。14．炎症疾病的诊断方法，包括测定人类白细胞表达的七次跨膜受体蛋白的表达量，所述七次跨膜受体蛋白为序列2记载的氨基酸序列构成的蛋白质。15．根据上述14记载的诊断方法，其特征在于该炎症疾病为类风湿性关节炎。16．根据上述14或15记载的诊断方法，其特征在于该人类白细胞为人类粒细胞。17．根据上述16记载的诊断方法，其特征在于该人类粒细胞为从人类组织采取的粒细胞。18．根据上述17记载的诊断方法，其特征在于该人类粒细胞为至少在诊断进行6小时前采取的粒细胞。19．根据上述14记载的诊断方法，其特征在于该表达量的测定是对编码该蛋白mRNA的定量而进行的。20．根据上述19记载的诊断方法，其特征在于该mRNA的定量是以RT-PCR法进行。21．根据上述14记载的诊断方法，该表达量的测定是对该白细胞表面存在的该蛋白的定量而进行的。22．根据上述21记载的诊断方法，其特征在于该蛋白的定量是用和该蛋白特异反应的抗体进行的。
下面就本发明进行详细的说明。
序列表中记载的氨基酸序列的左端和右端分别为氨基末端(以下称为N末端)和羧基末端(以下称为C末端)，此外碱基序列的左端和右端分别为5’末端和3’末端。
还有，在本发明中，DNA碱基序列中的a表示腺嘌呤，c表示胞嘧啶，g表示鸟嘌呤，t表示胸腺嘧啶。
此外，在本发明中，3个字母表示的氨基酸缩写中Ala为丙氨酸、Arg为精氨酸、Asn为天冬酰胺、Asp为天冬氨酸、Cys为半胱氨酸、Gln为谷氨酰胺、Glu为谷氨酸、Gly为甘氨酸、His为组氨酸、Ile为异亮氨酸、Leu为亮氨酸、Lys为赖氨酸、Met为甲硫氨酸、Phe为苯丙氨酸、Pro为脯氨酸、Ser为丝氨酸、Thr为苏氨酸、Trp为色氨酸、Tyr为酪氨酸、Val为缬氨酸。
本发明所说的“树状细胞”为淋巴结和胚中心所见的胞体突起伸长的星状细胞，是血液干细胞来源的抗原呈递细胞之一。近年来，树状细胞的体外大量调制已成为可能(Romani等，J.Exp.Med.,180,83-93,1994)。可以从骨髓来源或脐带血来源的未分化CD34阳性细胞或外周血单核细胞分化诱导，具体地说，用GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素4)二者刺激能够诱导未成熟树状细胞，用IL-4、GM-CSF和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)三者刺激能够诱导成熟树状细胞(Talmor,M等，Eur.J.Immunol.,28,811-817,1998；和Morse,MA等，Ann Surg.,226,6-16,1997)。
本发明所说的“白细胞”是单核细胞(淋巴细胞、单核细胞)和粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)的总称。粒细胞是白细胞中核成棒状或变细而分叶的细胞，如上所述，由嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞构成。
本发明所说的“人类组织”包括血液、滑液、淋巴液等体液，淋巴结、脾脏、骨髓、胃肠道、滑膜等组织和器官。此外，“组织的采取”是指将组织取出体外，对血液来说就是采血的意思。
本发明所说的“炎症”是包括非特异或特异防御系统反应的机体炎性反应。非特异的防御系统反应是指一般被认为没有免疫记忆的白细胞(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞)介导的炎症应答反应。作为非特异反应的例子，有蜜蜂蛰伤即后的肿胀、细菌感染部位的白细胞聚集(例如细菌性肺炎中肺的浸润和脓肿中脓的形成)等。特异防御反应是指对抗原的特异的免疫系统反应。作为特异防御系统反应的例子，有对抗原(例如病毒)的抗体应答和迟发性超敏反应等。
本发明所说的“炎症疾病”是指上述非特异防御系统功能和特异防御系统功能两方面低下或亢进所致的人体发生障碍的疾病。所以，炎症疾病包括感染疾病和自身免疫性疾病。本来，感染疾病是指免疫系统(宿主对病毒、细菌、寄生虫、霉菌等外来感染进行防御的系统)发生异常，不能排除外来感染所致的疾病；另一方面，自身免疫性疾病是免疫系统排除本来无需排除的自身组织的疾病。自身免疫性疾病已知有脏器和器官特异的疾病和非特异的全身性疾病。免疫调节异常包括全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Ⅰ型糖尿病、炎症性肠病、胆汁性肝硬变、葡萄膜炎、多发性硬化症、克伦病、溃疡性大肠炎、水泡性天疱疮、结节病、牛皮癣、鱼鳞病和格雷夫斯眼病等疾病，其范围很广。
本发明所说的“七次跨膜受体蛋白”为白细胞受体家族的一种，有称为G蛋白耦联受体(GPCR)、视紫红质型受体等。
此外，本发明所述基因操作所需cDNA的构建、以Northern印迹进行的表达研究、以杂交进行的筛选、重组DNA的构建、DNA碱基序列的确定、cDNA文库的构建等一系列分子生物学方法，可按实验指南记载的通常方法进行。具体地说，可参考《分子克隆实验指南》"Molecular Cloning,A laboratory manual",Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.编，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989等。
接着，为更明确本发明的基本特征，对本发明的完成过程进行描述，并就本发明包括技术的特征进行说明。
如下所述，本发明的七次跨膜受体C5L2蛋白质的cDNA片段为未成熟树状细胞所表达的，此外，其全长cDNA从胎盘来源的cDNA文库取得。更进一步，C5L2的mRNA也从正常外周血白细胞中检测出。编码本发明者们发现的七次跨膜受体C5L2蛋白的全长cDNA如本说明书序列表的序列1所示。将序列1的碱基序列和公知基因的cDNA序列进行同源比较。具体地说，就是使用GENETYX-Mac/DB Ver.39.1(Software Development Co.,Ltd.)在GenBank数据库(Release106.0,1998年4月)中对序列1所示的碱基序列进行同源检索。其结果检出下列10种序列(以下大括号内为条目名、数值为同源性)P．pymaeus C5a受体DNA[PPC5AR]56.3％G．gorilla C5a受体DNA[GG5AR]56.7％H．sapiens C5aR过敏毒素受体rRNA[HSC5AR]56.8％人C5a过敏毒素受体mRNA[HUMC5AAR]56.8％H．sapiens C5aR过敏毒素受体RNA[HSC5ANAPL]56.8％M．mullata C5a受体片段[MMC5AR]56.2％P．troglodytes C5a受体DNA[PTC5AR]56.6％C．familiaris补体C5a受体mRNA[CFCOMC5AM]59.1％Rattus norvegicus C5a受体mRNA[AB003042]57.2％R．norvegicus C5a受体mRNA[RNC5AREC]57.2％如上所述，编码本发明七次跨膜受体C5L2蛋白的cDNA与包括人类在内各种生物的过敏毒素受体C5a-R(Kroll,B.等，FEBS Lett.,291,208-210,1991)显示出同源性，但其同源性仅约56～59％。
更进一步，本发明者们将从上述本发明碱基序列所得的推测氨基酸序列记载于序列表的序列2。将此氨基酸序列和多种公知基因编码的氨基酸序列进行同源比较。具体地说，就是就是使用GENETYX-Mac/DB Ver.39.1(Software Development Co.,Ltd.)在Swiss-Prot数据库(Release 35.0,1997年11月)中进行同源检索。其结果检出下列10种序列(以下大括号内为条目名、数值为同源性)
C5A过敏毒素趋化受体(C5A-R)(CD88)[C5AR-HUMAN]38.2％C5A过敏毒素趋化受体(C5A-R)[C5AR-CANFA]39.6％C5A过敏毒素趋化受体(C5A-R)[C5AR-MOUSE]38.1％FMLP-相关受体Ⅱ(FMLP-R-Ⅱ)(RFP)(HM63)[FML2-HUMAN]29.9％FMET-LEU-PHE受体Ⅱ(FMLP-受体)(N-甲酰基多肽受体)[FMLR-HUMAN]28.8％可能G蛋白偶联受体GPR1[GPR1-RAT]28.1％FMET-LEU-PHE受体Ⅱ(FMLP-受体)(N-甲酰基多肽受体)[FMLR-RABBIT]29.8％FMET-LEU-PHE受体Ⅱ(FMLP-受体)(N-甲酰基多肽受体)[FMLR-MOUSE]28.5％可能G蛋白偶联受体GPR1[GPR1-HUMAN]28.1％FMET-LEU-PHE受体Ⅱ(FMLP-R-Ⅰ)[FML1-HUAMAN]26.3％如上所述，编码本发明七次跨膜受体C5L2蛋白的氨基酸序列与公知的人类和其它哺乳动物的七次跨膜受体蛋白显示出同源性，但其同源性仅约30～40％。
从上述同源检索的结果来看，本发明者们发现的C5L2和公知的人类和其它非人哺乳动物的七次跨膜受体蛋白相比，其cDNA序列同源性不足60％，氨基酸序列同源性不足40％，可判断为新序列。
更进一步，本发明者们根据Kyte-Doolittle的方法(J.Mol.Biol.,157,105-132,1982)，解析序列2氨基酸序列的疏水部分和亲水部分。从其结果来看，C5L2作为有七次跨膜部分的细胞膜蛋白质，在细胞表面表达。此外，在上述同源检索中，因为和C5L2确认有同源性的序列任一个都是七次跨膜受体蛋白，所以结论是本发明的蛋白质为新型七次跨膜受体蛋白。
在公知的受体蛋白中，已知有种间同源性非常高的，例如血管紧张素受体Ⅰa，人类(Swiss-Prot Entry:AG2R-Human)和大鼠(Swiss-Prot Entry:AC22-Rat)的同源性超过90％。但是，和本发明的七次跨膜受体C5L2显示出高同源性的序列在数据库没有找到。所以，C5L2不是其它生物已知受体在人类中的对应物，是一种新型受体。
因本发明的C5L2和过敏毒素受体C5a-R具有一定(虽然不高)同源性，推测其属于和人类过敏毒素受体相同的亚家族。根据最近的报道，人类过敏毒素受体C5a-R(Kroll,B.等，FEBS Lett.,291,208-210,1991)、人类过敏毒素受体C3a-R(Crass,T.等，Eur.J.Immunol.,26,1944-1950,1996)、细菌来源肽FMLP受体(Boulay,F.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,168,1103-1109,1990)、ChemR23(Samson,M.等，Eur.J.Immunol.,28,1689-1700,1998)等从同源性来看在GPCR家族中形成亚家族(Samson,M.等，Eur.J.Immunol.,28,1689-100,1998)。已知属于此亚家族的受体都和免疫调节有很深关系(例如过敏毒素受体C3a-R和C5a-R参与机体的变态反应和炎症反应，FMLP-R参与感染防御、ChemR23参与作为抗原呈递细胞的树状细胞和巨噬细胞介导的免疫诱导)。属于此亚家族的本发明的C5L2可能也参与了炎症和感染引起的免疫调节，本发明者们就C5L2和炎症疾病的关系进行研究。其结果是，根据Northern印迹判定外周白细胞显示出C5L2基因的强表达，其中粒细胞显示出特别强的表达。此外，本发明者们，对于采取的体液或组织，着眼于C5L2表达量可能在采取后贮存时发生变化这一点，分离采血即后和保存一定时间后外周血所含的粒细胞，解析C5L2的历时表达量。结果发现，对于健康人外周血来源的粒细胞，编码C5L2蛋白的mRNA量在采血后到第6小时急剧减少，其后至24小时后缓慢减少。另一方面，对RA患者外周血作相同的解析，RA患者外周血来源的粒细胞中编码C5L2的mRNA量在采血后24小时也不减少。此现象未见于作为趋化因子受体的CCR4、CCR5，是本发明者们发现的C5L2特有的现象。
如上所述的深入研究结果，本发明者们发现，采血后C5L2表达量的变化作为炎症疾病的标志物很有用，从而完成了本发明。
本发明提供了七次跨膜受体C5L2蛋白的全长蛋白质及其部分多肽片段。
本发明的七次跨膜受体C5L2蛋白是外周血白细胞、特别是粒细胞强表达的七次跨膜受体，是本发明者们首先发现的蛋白质。本发明的蛋白质是具有对C5L2受体的特异配基结合活性、信号传递通路中向处于下游的信号传递活性的蛋白质。
此种蛋白质之一为具有序列2氨基酸序列的蛋白质，但本发明的蛋白质并不仅限于序列2的氨基酸序列。作为具有上述受体特性的多肽，自然界发生的生物种内变异、等位基因变异等突变所产生的变异体(即一个或多个氨基酸缺失、取代或添加形成的氨基酸序列)也包括于本发明的蛋白质中。涉及氨基酸的改变、取代例如Bennett等的申请(国际专利申请WO96/02645)等详细记载的，可参考它进行构建。此外，本发明也包括上述蛋白质的盐。
还有，本发明蛋白质可在翻译后受到修饰。序列2的氨基酸序列中存在连接有糖链的部分。例如，序列2上3位的Asn是N-糖苷键通式序列Asn-X-Ser/Thr的Asn，可以受到N-糖基化修饰。此外，推测为N-乙酰基-D-半乳糖胺的O-糖苷键的部分，是丝氨酸、苏氨酸残基高频出现的部分。这些糖链加成的蛋白质和没有加成糖链的蛋白质相比一般在机体内对分解更稳定，此外也有更强的生理活性。所以，本发明的蛋白质包括含有具序列2的氨基酸序列中连接有N-乙酰基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-半乳糖胺等的N-糖苷键或O-糖苷键的糖链的蛋白质。
更进一步，本发明的蛋白质可具有抗原表位等公知的标志序列。例如可具有FLAG(MDYKDDDDK)、T7(MASMTGGQQMG)、HSV(SQPELAPEDPED)、S(KETAAAKFERQHMDS)、Myc(EQKLISEEDL)、His(HHHHHHHH)、HA(YPYDVPDYA)等标志序列(括号内的序列全部为氨基酸的单字母代码)。标志序列存在于C5L2蛋白的C末端或N末端，可以很容易地用流式细胞计或Western印迹(免疫/印迹法)等检出本发明的蛋白。
C5L2蛋白及其片段对以诊断为目的抗体的制造、以诊治疾病为目的医药品的研究很有用。所述片段是C5L2蛋白的部分序列构成的肽，为本发明C5L2全长蛋白质的至少5个连续氨基酸构成的部分序列，此部分肽和全长蛋白质一样，对抗体的制造、配基的筛选、研究调节和C5L2结合引起的树状细胞反应而进行疾病治疗的物质很有用。例如以相当于细胞外区域或细胞内区域部位的5～8个氨基酸残基的肽作为抗原可以用于抗体的制造。具体地说，可以将实施例9中制造抗体所用的抗原是序列2的氨基酸序列中第6～32氨基酸构成的部分肽段和第1～23氨基酸构成的部分肽段作为抗原。作为配基等的筛选所用的部分肽段，例如可以使用包括认为是C5L2配基结合部位的N末端细胞外区域(序列2的第1～35氨基酸残基)、第一细胞外袢环部分(序列2的第96～108氨基酸残基)、第二细胞外袢环部分(序列2的第172～198氨基酸残基)或第三细胞外袢环部分(序列2的第681～726氨基酸残基)。
取得本发明蛋白质及其部分肽段的方法没有特殊的限定，具体地说，有根据氨基酸序列信息制造合成肽的方法，或将编码肽的基因引入宿主细胞内合成肽的方法。作为将编码肽的基因引入宿主细胞内合成肽的方法，可以参照已有的书籍(Kriegler，《基因转移和表达-实验室手册》Gene Tranfer and Expression-A Laboratory Manual,Stockton Press,1990；横田等，バイオマニユアルシリ-ズ4、基因转移和表达·解析法、羊土社、1994)等记载的多种方法。
本发明也提供编码上述七次跨膜受体蛋白C5L2的DNA。
作为编码七次跨膜受体C5L2蛋白DNA的一例，本发明的人类来源cDNA序列和氨基酸序列一起记载于序列1。更进一步，从C5L2 mRNA序列所得的DNA序列记载于序列3，和序列3的DNA序列互补的DNA序列记载于序列4。序列3的序列为序列1的DNA序列及其5’和3’末端存在的非翻译区域(分别为第1～71核苷酸和第1086～1287核苷酸)构成的碱基序列。在从自然界分离的基因组DNA或cDNA中，因遗传密码的简并，其DNA编码的氨基酸序列不发生变化而DNA碱基序列发生变异的情况经常发生。如此因变异和遗传密码简并所得的碱基序列也包含在本发明的DNA中。此外，因5’非翻译区域和3’非翻译区域不涉及蛋白质的氨基酸序列的限定，非翻译区域的碱基序列更容易变异。如此因变异和遗传密码筒并所得的碱基序列也包含在本发明的DNA中。
本发明者们所得的C5L2全长碱基序列如序列1所示，但也确认有和此序列不同的序列克隆。例如，序列1 DNA序列的第724～729个为6个连续的胸腺嘧啶(t)，进一步也检测出多连1个t的7个连续t的克隆。利用本发明C5L2的含此部位(即含有连续的胸腺嘧啶的部位)的核酸探针、核酸引物，可以区别检出连续6个t的序列和7个t的序列。
要取得编码本发明C5L2的DNA，可根据本说明书序列1、3和4载的碱基序列进行合成。必需天然DNA时，可以从未成熟树状细胞和正常外周血来源白细胞等确认表达C5L2的组织中提取，另外如说明书实施例2所述从胎盘来源cDNA文库中取得。此外，要取得编码序列1记载的C5L2的DNA，可以从引入包括编码C5L2全氨基酸序列cDNA的重组DNA的转化体(具体地说本发明者们转化的E.Coli:DH5-pcDNAC5L2等)中分离。
更进一步，本发明还提供序列3或4记载的DNA中至少连续12个碱基构成的DNA片段及其衍生物、以及与序列3记载的DNA互补的RNA中至少连续12个碱基构成的RNA片段及其衍生物。
如上所述，本发明的基因和其它公知的基因同源性低(不足60％)，难于应用其它基因作为探针的交叉杂交法等进行克隆。应用交叉杂交克隆的例子很多(例如Murphy,P.M.等，Science,253,1280-1283,1991；Combadiere,C.等，J.Biol.Chem.,270,16491-16494,1995)，但尚未报道有本发明的七次跨膜受体C5L2的克隆。此外，如本说明书的实施例所示，使用C5L2 cDNA序列一部分的cDNA文库的筛选不能检测出公知受体基因的克隆(参照实施例2)，此外，根据使用C5L2 cDNA序列一部分的Northern印迹的解析，不能检测出公知受体基因的转录产物(参照实施例3)。所以，使用公知基因的交叉杂交难于克隆本发明的基因，本发明的DNA片段或RNA片段对于将C5L2 cDNA及其片段、基因组DNA及其片段从其它DNA中检测出来很有用。
作为对cDNA和基因组DNA的检出有用的核酸片段，有序列2或3的碱基序列、或与此碱基序列互补的DNA及RNA中至少连续12个、优选16个以上、更优选20个以上碱基构成的DNA片段和RNA片段、或者这些核酸片段的衍生物。核酸片段的长度因此片段的特异性、检测时和核酸结合的稳定性等而异。进行以DNA片段作为引物的PCR(聚合酶链式反应)法时，优选使用Tm(双链解离温度)45℃以上的DNA片段。在进行PCR等的时候，当2条DNA链彼此结合时，以每个GC对为4℃，每个AT对为2℃，合计计算，可推测Tm。所以，用于检出序列的GC含量高(90％以上)时，使用至少连续12个碱基构成的核酸片段，一般来说，用GC含量约50％的序列检测时，必需使用至少连续16个碱基构成的核酸片段。当以和DNA结合较DNA之间结合更稳定的核酸衍生物作为引物时，可以使用较短的核酸序列检出目的DNA。
以诊断目的而检测本发明基因的表达，可以使用序列4的DNA(序列3DNA的互补链)、序列3DNA互补所得的RNA(反义RNA)、或其中至少12个、优选16个以上、更优选20个以上碱基构成的核酸片段、反义DNA和RNA、或反义核酸经甲基化、甲基磷酸化、脱氨基化、或硫磷酸化的衍生物等探针或印物，采用杂交、引物延伸、核酸酶保护测定、逆转录基因扩增(RT-PCR)等方法。具体地说，使用实施例4所示序列4的碱基序列(和序列3DNA互补的DNA)的片段可以检测出C5L2的mRNA。
更进一步，使用本发明的碱基序列，可以检出和克隆大鼠等其它生物具有的本发明基因同源体。更进一步，使用本发明的DNA、RNA及其片段，同样能够克隆包括人、小鼠在内的基因组上的基因。具体地说，就是可以应用转基因小鼠、基因导向小鼠、本发明基因和相关基因同时失活的双敲除小鼠等近年来开发的基因操作技术进行研究。此外，含本发明基因的基因组如果有异常，也可以应用于基因诊断和基因治疗。
为明确本发明的七次跨膜受体C5L2蛋白的更详细功能，对细胞和机体给予反义核酸。例如，对于C5L2过剩反应为病态的疾病，可以使用反义核酸抑制基因的表达而进行治疗。反义核酸的给予可以通过将反义核酸插入适当载体以获得重组核酸来实现。对于此反义核酸的制造例、使用例，可以参照Murray,J.A.H.编，ANTISENSE RNA AND DNA,Wiley-Liss,Inc.,1992。
更进一步，本发明还提供了重组DNA，其特征在于含有上述本发明任一种的DNA。
调制本发明重组DNA所用的载体没有特殊的限定，可以利用通常所用的载体。具体地说，有大肠杆菌来源的pBR322、pUC8、pUC18、pUC19、pUC119(都为日本宝酒造社制造)、枯草杆菌来源的质粒、酵母来源的质粒等质粒载体、λgt10、λgt11(都为美国Stratagene公司制造)等的噬菌体载体、逆转录病毒和痘苗病毒等动物病毒。也可以使用其它能在宿主体内增殖的载体。作为本发明重组DNA的具体例子，有载体使用pcDNA3.1/Myc-His(+)B的重组DNA(参照实施例4)。还有，含有编码本发明七次跨膜受体C5L2蛋白全长氨基酸序列的cDNA的质粒pcDNAC5L2引入大肠杆菌DH5的转化细胞E.Coli:DH5-pcDNAC5L2已由通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(亍305-0046日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)于平成10年(1998年)9月1日进行了保藏(保藏号FERM BP-6833)。
此外，本发明的重组DNA优选引入公知的宿主体内。所以，本发明也提供了重组DNA转化的微生物或培养细胞。
本发明的重组DNA引入的宿主没有特殊的限定，只要是能够表达本发明重组DNA的微生物和培养细胞即可。具体地说，可以对埃希氏杆菌属细菌(E.coli大肠杆菌)、芽孢杆菌属细菌(Bacillus subtilis枯草杆菌)等原核细胞，应用氯化钙法等引入重组DNA。作为上述埃希氏杆菌属细菌的例子，有大肠杆菌K12、HB101、MC1061、LE392、JM109、INVαF’。作为芽孢杆菌属细菌的例子，有枯草杆菌M1114。此外，对于噬菌体载体，例如可以应用体外包装法(Proc.Natl.Acad.Sci.,75,4242-4246,1978)引入增殖的大肠杆菌。更进一步，可以使用动物细胞、昆虫细胞等真核细胞作为宿主。
更进一步，本发明利用转化体，提供了在其细胞表面表达的七次跨膜受体蛋白。具体地说，就是应用包括(a)连接编码C5L2的DNA与可复制的表达载体，得到该DNA可操作地插入可复制载体重组形成的可复制重组DNA，(b)该可能复制重组DNA转化微生物或培养细胞形成转化体，(c)从该微生物或培养细胞的母体细胞筛选转化体，(d)培养该转化体、在该转化体上表达该核酸等的方法，在该转化体细胞表面制造C5L2，等的方法在该转化体细胞表面制造的七次跨膜受体蛋白。
在转化体细胞表面制造C5L2时使用的重组载体，在载体中插入的编码C5L2的DNA的5’端可以有翻译起始密码子、其3‘端可以有翻译终止密码子。翻译起始密码子和翻译终止密码子可以用适当的合成核酸接头进行添加。更进一步，为表达目的DNA,DNA上游优选连接有启动子。本发明所用的启动子，可以是和用于基因表达的宿主相对应，没有特殊的限定。宿主为埃希氏杆菌属细菌时，优选tac启动子、trp启动子、lac启动子等；宿主为芽孢杆菌属细菌时，优选SPO1启动子、SPO2启动子等。宿主为原核细胞时，引入的重组DNA优选和启动子同样具有核糖体结合部位。此外，宿主为酵母时，优选PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等；宿主为动物细胞时，优选SV40来源的启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子等。
作为制造本发明C5L2时所用的DNA，只要是编码序列2氨基酸序列构成的C5L2的DNA即可，没有特殊的限定。具体地说，可以使用序列1的碱基序列。此外，为生产附加特定功能的C5L2，可以在编码C5L2的DNA上连接公知的碱基序列。例如，为保证在细胞表面上的表达，在5’末端(相当于肽的N末端)添加编码信号肽的DNA；为使产生的蛋白质容易检出，可以添加编码抗原表位的DNA。作为如此技术的一例，可以参照Choe,H.等，Cell,85,1135-1148,1996等。
用于制造C5L2的转化体是将如上述构建的重组DNA、载体引入可表达载体的宿主细胞中得到。作为宿主所用的细胞，有上述埃希氏杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、酵母、动物细胞等。优选的宿主为动物细胞，有猴细胞COS-7、Vero细胞、中国仓鼠细胞CHO、蚕细胞SF9等。按本说明书实施例5和7进行，很容易将上述重组DNA引入293细胞和CHO细胞，制造转化体；将转化体培养，可以在转化体细胞表面制造C5L2。应用培养转化体的C5L2制造可以按实施例5所用的Western印迹法和FACS(荧光活化细胞分拣器)加以确认。
使用本发明的七次跨膜受体蛋白，可以筛选七次跨膜受体蛋白的配基。本发明提供了包括将实质上纯的受体C5L2蛋白、其部分序列构成的肽、或转化体细胞表面制造的C5L2和受试样品材料接触，以C5L2或其肽和配基结合所引起的变化为指标，检出与七次跨膜受体蛋白结合的配基等的筛选方法。
本发明筛选方法中所用的C5L2可以是精制蛋白质也可以是未精制蛋白质，但必需具有和体内相同的配基结合活性。未精制的C5L2包括细胞膜部分、本发明蛋白质在细胞膜上表达的天然细胞和转化体等。
本发明筛选方法所用的含有配基的样品材料没有特殊的限定，例如可以使用含有生理配基的生物体来源组织和细胞的提取液或培养上清、合成化合物和微生物的培养上清。因本发明的受体与公知的人过敏毒素受体具有同源性，C5L2的配基并不限于属于趋化因子家族的物质，可以是生长抑素、血管紧张素、缓激肽等多肽激素、补体或菌体成分等。
作为检出C5L2配基的方法，没有特殊的限定，例如将C5L2和样品材料接触，测定生成的C5L2和配基复合物的量和/或未结合样品材料的量的方法、测定样品材料和C5L2结合引起的反应的方法。作为测定复合物的量/或未结合样品材料的量的方法，例如可以用放射性化合物和染料等标记样品材料，与C5L2接触，然后分离C5L2配基复合物和未结合的样品材料，利用标记测定复合物的量和/或未结合的样品材料的量。作为一例，本说明书的实施例6中，测定放射标记的未结合配基候选化合物的量。此外，当和受体结合的物质已确定时，可以标记此物质，看样品材料和标记物质是否发生竞争，测定样品材料的结合。这些方法的具体例子有浅沼干人等、实验医学11、22～29、1993等。其它也有如SPA(闪烁亲近测定法)的不分离C5L2-配基复合物和未结合的样品材料而测定配基结合量的方法。
作为测定样品材料和C5L2结合引起的反应的方法，有使用C5L2参与的信号传导系统各种方法。作为如此方法，例如唐木英明等编、实验医学7、26～109、1989年记载的、细胞内钙浓度的测定方法、如Samson,M.等，Biochem.35,pp.3362-3367,1996的使用微生理计(microphysiometer)的方法、测定细胞内cAMP量的方法等。作为一例，本说明书的实施例7中，使用给予LPS大鼠的血清观察C5L2转化细胞的化学趋化。
此外，作为使用本发明的七次跨膜受体蛋白部分序列构成的片段肽确定配基的方法，有使用BIACORETM的方法、使用树脂柱精制的方法等。BIACORETM为利用两个蛋白质会合表面胞质团(plasmon)共振进行检测的装置(蛋白质核酸酵素，37、2977～2984、1992)。此时，精制的本发明肽、优选将N末端细胞外区域部分固定于BIACORETM的传感器芯片端，在其上添加作为配基候选的样品材料，研究部分肽和样品材料的结合(即样品材料是否为本发明的七次跨膜受体蛋白配基)。此外，通过制造将本发明的部分肽段固定于柱层析用树脂上的亲合柱，例如可以亲合精制细胞培养物上清中存在的人型C5L2的配基。如此精制的配基能够分离和鉴定。
根据使用上述本发明的全长蛋白质及其部分肽段的筛选方法所得的配基，对筛选作用于七次跨膜受体C5L2、调控树状细胞的功能而治疗疾病的物质很有用。
更进一步，作用于本发明的七次跨膜受体C5L2蛋白的物质，即在发现本发明蛋白质的配基时，可以搜索改变C5L2和配基的作用的物质、即活化结合所致反应、或者抑制活化的物质。具体地说，就是包括将实质上纯的受体C5L2蛋白、其部分序列构成的肽、或转化体细胞表面表达的C5L2，与和该蛋白质或肽结合的配基和样品材料接触，将引起的蛋白质或肽和配基结合的变化作为指标，检出抑制C5L2和配基结合的物质的方法。
作为具体的筛选方法，例如可以采用本说明书实施例8进行的转化体化学趋化实验。此外，和决定C5L2受体配基的方法一样，抑制配基和本发明蛋白质或肽段结合的物质作用于七次跨膜受体蛋白，调控树状细胞的反应，作为对疾病进行治疗的物质很有用。
此外，使用本发明的七次跨膜受体蛋白部分序列构成的肽，筛选抑制肽和配基结合的物质等筛选方法，和确定配基的方法一样，可以采用使用BIACORETM的方法。
更进一步，本发明提供了特异识别七次跨膜受体C5L2蛋白的抗体。
制造本发明的抗体所用的抗原没有特殊的限定，作为C5L2蛋白特征的长度越长越好，优选使用序列2记载的氨基酸序列中至少连续5个氨基酸构成的部分肽段，更优选至少连续8个氨基酸构成的部分肽段。此肽段保持原样、或者和KLH(匙孔血蓝蛋白)和BSA(牛血清白蛋白)等载体蛋白交联后，根据需要和佐剂一起接种动物，回收其血清，可得到含有C5L2识别抗体(多克隆抗体)的抗血清。此外，可以以抗血清将抗体精制使用。作为接种抗原的动物，使用绵羊、牛、山羊、家兔、小鼠、大鼠等，但制造多克隆抗体时优选绵羊。具体地说，如实施例9，可以制成抗人C5L2蛋白兔多克隆抗体和抗人C5L2蛋白的免疫球蛋白溶液。
此外，根据调制杂交瘤细胞的公知方法，可以得到单克隆抗体，此时优选使用小鼠。此外，可以将序列2所示的氨基酸序列全长或其中5个残基以上、优选8个残基以上氨基酸构成的部分肽段和GST(谷甘胱肽S-转化酶)等融合的产物精制，或者保持原样而作为抗原使用。使用按参考书(Antibodies a laboratory Manual,E.Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory)所示的各种方法和基因克隆法等分离的免疫球蛋白基因、使用细胞表达的基因重组抗体，可以制造单克隆抗体。
本发明的抗体可以用于七次跨膜受体C5L2蛋白的精制。此外，使用特异识别七次跨膜受体C5L2蛋白的抗体，能够检出和定量C5L2，作为伴有细胞分化异常的疾病和自身免疫性疾病，例如可以作为恶性肿瘤、病毒感染、风湿等疾病的诊断药使用。此外，如本说明书中实施例5所示，这种检出和定量可以应用Western印迹、FACS等方法。关于Western印迹，其方法详细记载于"Antibodies a laboratoryManual"(E.Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory)的471-510页；此外，关于免疫沉降、免疫测定等，分别详细记载于同书421-470页、553-612页。使用FACS的临床诊断例子，例如天神美夫等编《流式细胞测定法手册》(Flow Cytomety Handbook)(ScienceForum社、1984年)的第4部《流式细胞测定法的临床医学应用》所示；关于FACS时细胞的染色，详细记载于高津圣志、龙伸介著《免疫研究的基础技术》(羊土社、1995)pp.16～61；关于操作方法，详细记载于天神美夫等编《流式细胞测定法手册》(Science Forum社、1984年)。
更进一步，本发明提供了包括测定人白细胞表达的七次跨膜受体C5L2蛋白表达量的炎症疾病诊断方法。
同源检索的结果等显示，本发明的七次跨膜受体C5L2很深入地参与了炎症、感染引起的免疫调节；此外因为外周血白细胞的表达量高，所以考虑应用于伴有炎症的疾病。首先，将白细胞划分为淋巴细胞(T细胞、B细胞、单核细胞)和粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)，根据C5L2表达量用RT-PCR解析的结果，判定序列2的氨基酸序列在粒细胞中强表达。接着，着眼于炎症疾病之一的类风湿性关节炎(RA)，从RA患者和健康人共30例以上的外周血调制粒细胞，用RT-PCR解析。此外，就RA患者的滑液、从滑液分离得的细胞、滑膜组织片、滑膜组织片用胶原酶处理所得的细胞、以及从此滑膜组织片所得细胞分离的白细胞，用RT-PCR进行解析。其结果可见，C5L2在滑液中的粒细胞也强表达，几乎不含粒细胞的滑膜组织则几乎未见表达。
此外，本发明者们着眼于在人体分离采取的体液或组织中，C5L2表达量在分离采取后变化的可能性，分离采血直后和一定时间过后外周血所含的粒细胞，解析历时的C5L2表达量变化。具体地说，从健康人采取血液，其一部分以密度离心法得到粒细胞部分。残留血液在室温下静置、一定时间过后和新鲜血液一样以密度离心法得到粒细胞部分。关于各粒细胞部分，以使用序列9和10的化学合成引物的RT-PCR测定细胞中mRNA的量。其结果可见，在健康人外周血来源的粒细胞中，C5L2的mRNA量在采血后6小时急剧减少，其后至24小时后缓慢减少(参照图2)。
更进一步，将RA患者外周血进行和上述相同的解析，可见RA患者外周血来源粒细胞中的C5L2 mRNA量在采血后24小时不减少。
关于粒细胞部分中C5L2的表达，采血即后的新鲜血液中表达量很高，采血后保存的时候表达量大大减少。如此现象未见于趋化因子受体CCR4和CCR5，是本发明的受体C5L2的特有现象，为本发明者们首先发现。
粒细胞部分中C5L2表达的调控如下所述。人外周血白细胞中各血细胞的比率是淋巴细胞25～33％、单核细胞3～7％、嗜中性粒细胞55～60％、嗜酸性粒细胞1～3％、嗜碱性粒细胞0～0.7％(参照《生物化学辞典》，东京化学同人)，换算成粒细胞部分(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，九成以上为嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞为非特异性免疫系统的一员，是通过接触、趋化、吞噬、杀菌等一系列机制，将病原体(主要是细菌)排出体外的白细胞。外周血中成熟嗜中性粒细胞的血中滞留时间为10～16小时、寿命为2～3天；成熟嗜中性粒细胞中有在血液中循环的也有黏附在血管内皮细胞壁上的。它们的数量在正常时大致相同，成熟嗜中性粒细胞黏附在血管内皮细胞壁后向组织趋化。趋化到组织中的成熟嗜中性粒细胞消失在口腔、消化道、肺泡等，在肝脏、脾脏、皮下等组织处发生凋亡，被巨噬细胞所吞噬，其在组织内的平均寿命为1～4天。已趋化到组织的成熟嗜中性粒细胞不回到血液中，在炎症部位的细胞凋亡被控制，其寿命延长。另一方面，吞噬细菌的嗜中性粒细胞寿命缩短。对于凋亡的嗜中性粒细胞，其趋化能力、吞噬作用、变形、黏附能力、脱颗粒、活性氧生成等功能全部降低。[Haslett,C.等，Chest,99(Suppl.3):6S,1991；和Whyte,M.K.等，J.Immunol.,150,5124-5134,1993]。持续发生的嗜中性粒细胞凋亡、活化都对机体有害，应研究防止此问题的机制。
本发明的C5L2普遍表达于细胞中，感染或炎症等异常在体内发生时，表达C5L2的细胞向异常部位趋化，发生作用。即，炎症部位中充分作用的细胞中表达C5L2，细胞向炎症部位趋化，开始产生杀菌作用，C5L2在其作用完成后表达降低。此外，表达C5L2的细胞向不涉及炎症的组织趋化、发生凋亡时，C5L2从细胞中消失。所以，对于血管内存在的正常状态下多点不同的采血后的血液，采血后的保存引起细胞活性下降或诱导发生凋亡，使C5L2表达量降低。
另一方面，已有报道表明，对于炎症部位趋化的嗜中性粒细胞，调控凋亡使其寿命延长(Watson,R.W.等，J.Immunol.,158,945-953,1997)，非活动期的贝切特氏病患者的外周血中嗜中性粒细胞的凋亡被抑制(坂根刚和岳野光洋著，《嗜中性粒细胞功能低下和功能亢进》，医药杂志社，1998)，所以认为炎症疾病患者外周血中的嗜中性粒细胞的凋亡同样受到抑制。因此，在细胞活性降低和凋亡诱导发生的采血后的血液中，从炎症患者所得的嗜中性粒细胞的活性维持不变，C5L2的表达量不象健康人那样减少，而是维持不变。此外，嗜中性粒细胞的活性持续不降低可能是炎症慢性化的原因。
根据上述深入研究的结果，本发明者们发现，测定采血后C5L2表达量的变化、或采血一定时间后的C5L2表达量，作为炎症疾病的标志物很有用，从而完成了本发明。
本发明的诊断方法，对以嗜中性粒细胞的功能低下或亢进为一种原因的炎症疾病，例如类风湿性关节炎、贝切特氏病、Sweet综合症和坏疽性脓皮症等嗜中性粒细胞性皮肤病、成年人呼吸窘迫综合症(adult respiratory distress syndrome；ARDS)、缺血再灌注损伤、败血症休克综合症、全身性炎症反应综合症(systemic inflammatoryresponse syndrome；SIRS)、胰腺炎等的诊断很有用，优选用于风湿、特别是类风湿性关节炎的诊断。目前所用的风湿的标记物必需进行6周时间的长期观察，应用以C5L2表达量作为标记物的本发明诊断方法，诊断结果能在数日内得到，可以早期诊断。
此外，本发明的诊断方法对慢性炎症疾病的检出有用。嗜中性粒细胞的凋亡和继而发生的巨噬细胞吞噬是正常免疫不可缺的，嗜中性粒细胞活性的维持成为显示炎症慢性化的指标。所以，C5L2的表达成为慢性炎症疾病的标志物。此外，在如溃疡性大肠炎和克仑病等缓解恶化反复的炎症疾病中，从C5L2的表达量可以判定疾病是否为活动期。
作为本发明诊断方法中所用的细胞，优选白细胞，特别是粒细胞。炎症部位中充分激活的细胞粒细胞持续表达C5L2，细胞活性如果降低则C5L2的表达也消失。所以，如上所述，健康人的粒细胞在采血后C5L2的表达量历时降低。为明确检出特别是炎症患者和健康人之间的差别，诊断所用的粒细胞优选至少6小时前采取的粒细胞。
定量C5L2表达量的方法没有特殊的限定，例如有定量白细胞中存在的C5L2的mRNA的方法和定量细胞表面存在蛋白质的方法。从基因转录来的mRNA，经细胞内机制翻译成蛋白质，从mRNA量可以推测蛋白质量。编码C5L2的mRNA的定量所用的方法没有特殊的限定，优选应用RT-PCR(逆转录PCR)法。RT-PCR法是用逆转录酶从mRNA合成cDNA后，使用耐热DNA聚合酶和对C5L2特异的两种引物，扩增从mRNA合成的cDNA的方法。从扩增的核酸量可以相对求出细胞中所含的mRNA量。
作为RT-PCR所用的引物，为本发明的DNA片段，即序列3或4的DNA中至少连续12个、优选16个以上、更优选20个以上的碱基观察的DNA片段、或其衍生物。具体地说，可以使用序列9和10记载的引物。作为定量C5L2的mRNA的方法，可以应用本说明书的实施例11的方法。具体地说，使用序列9和10的引物检出C5L2的mRNA，进一步使用序列11和12的引物检出同一样品中的G3PDH。编码C5L2的mRNA量可以以G3PDH的PCR产物量作为100％求出相对值(表达率)。
作为定量细胞表面上存在蛋白质的方法，只要是特异性定量C5L2的方法，并没有特殊的限定，优选使用和本发明C5L2特异结合的抗体。具体地说，如本说明书的实施例9，可以使用以序列2记载的氨基酸序列中至少连续5个以上氨基酸构成的部分肽段作为抗原所得的抗体。作为使用抗体的C5L2蛋白表达量的定量方法，可以应用如实施例11所示的FACS和免疫沉降等方法。使用FACS的临床诊断例子，例如可以参照天神美夫等编《流式细胞测定法手册》(Science Forum社、1984)第4部、流式细胞测定法的临床医学应用。更进一步，关于免疫沉降、免疫测定等，分别详细记载于《抗体实验手册》(E.Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory)的421-470页和553-612页。
此外，有报道表明在从发生炎症关节的滑液等炎症部位取得的体液中，七次跨膜受体蛋白(例如CD97)的细胞外结构域以溶解、稳定的游离状态存在(James X.Gray等，J.Immunol.,157,5438-5447,1996)。定量血液和滑液中游离的C5L2蛋白或其部分肽段也成为炎症疾病诊断的有效手段。此时，如上所述，优选使用本发明的C5L2特异结合的抗体，作为C5L2蛋白的定量法，可以采用Western印迹和FACS等方法。发明的最佳实施方案接着就本发明的实施方案进行详细的说明，但本发明并不仅限于此。
回收所得未成熟树状细胞，悬浊于30毫升PBS(磷酸缓冲盐)后，使用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(瑞典、Pharmacia Biotech公司制造)，除不进行第二柱纯化外按操作规程提取mRNA。接着，用1微克提取的mRNA，应用SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(美国Life Technologies公司制造)按其操作规程合成cDNA，进一步用寡(dT)引物使cDNA成双链(dsDNA)。用苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀后，将dsDNA溶于40微升灭菌水，制成cDNA样品。
cDNA样品用PCR进行扩增。具体地说，往2微升cDNA样品中加入0.5微升作为DAN聚合酶的5U/微升TaKaRa Taq(编码R001A)(日本宝酒造公司制造)、聚合酶中添加的10×PCR缓冲液和dNTP混合物(各核苷酸的浓度2.5mM)分别5微升和4微升、作为引物的序列5和6所示的合成寡聚核苷酸分别200pmol，使最终容量为50微升。PCR使用TaKaRa PCR热循环器480(日本宝酒造公司制造)，95℃下1分钟、40℃下2分钟、72℃下3分钟的循环进行5次循环后，95℃下1分钟、50℃下2分钟、72℃下3分钟的循环进行25次循环。所得PCR产物的一部分用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，确认扩增约700bp的cDNA。将此区带从凝胶中切下，用GENECLEANⅡ试剂盒进行精制，所得cDNA片段用TA克隆试剂盒(美国Invitrogen公司制造)与pCR2.1载体(美国Invitrogen公司制造)重组。用重组cDNA的pCR2.1载体转化大肠杆菌One Shot Competent Cells(美国Invitrogen公司制造)，以氨苄青霉素耐性为指标回收转化体(即克隆)，按Wizardminipreps(美国，Promega公司制造)的操作手册精制质粒。精制的质粒用限制性内切酶EcoRⅠ消化，切出约700bp的DNA以确认上述PCR产物已和载体重组。
对于精制的质粒，用荧光测序仪(美国Applied Biosystems公司制造)确定重组cDNA片段的碱基序列。序列样品的调制使用PRISM,Ready Reaction Dye Terminator Cycle测序试剂盒(美国、AppliedBiosystems公司制造)。具体地说，往0.5毫升容量的微试管中加入9.5微升原液、4.0微升0.8pmol/微升的T7启动子引物(美国GIBCOBRL)和6.5微升0.16微克/微升测序用模板DNA，混合，用100微升矿物油分层后，用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480进行PCR。反应条件为，96℃下30秒、55℃下15秒和60℃下4分钟为一次循环，进行25次循环后，在4℃下保温5分钟。往反应后的混合液中加入80微升灭菌精制水，搅拌，离心分离水相后，水层用苯酚/氯仿提取3次。然后，在室温下用乙醇沉淀后，干燥沉淀的DNA。将DNA溶于4微升含10mM EDTA的甲酰胺，在90℃下变性2分钟后，在冰水中冷却，作为测序用样品。
对约250个克隆确定DNA的碱基序列，其中1个克隆具有和序列1的第235～852相对应的碱基序列。用GenBank(Release 106.0、1998年4月)进行同源检索，结果表明此序列类似七次跨膜受体家族。
接着，将实施例1所得受体基因片段用放射性同位素32P制成标记的探针。受体基因片段重组的pCR2.1载体用EcoRⅠ消化，所得EcoRⅠ片段(约700bp)用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分离后，从凝胶中切出，用GENECLEANⅡ试剂盒进行精制。精制的EcoRⅠ片段用Megaprime DNA标记系统(code RPN1607)(英国Amersham公司制造)，按其操作规程用α-32P-dCTP(code AA0005)(英国Amersham公司制造)标记。接着用Quick SpinTMColumn SephadexG-50(德国BoeringerMannheim公司制造)精制标记的DNA,5分钟沸水浴后，冰冷却2分钟，制成探针。
对固定DNA的滤膜和32P标记的受体基因片段探针进行杂交。将上述DNA固定滤膜浸入含有6×SSC溶液、5×Denhardht溶液、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)和100微克/毫升鲑鱼精子DNA的杂交液中，在65℃下振荡2小时后，往杂交液中加入上述32P标记的探针，在65℃下振荡16小时，进行杂交。
接着，将滤膜浸入含有0.1％SDS的2×SSC溶液中，在室温下清洗3次，进一步用相同溶液在室温下清洗15分钟后，在-85℃下进行放射自显影。在放射自显影中，回收对应强曝光部分的噬菌体克隆。培养此噬菌体，按上述相同方法进行筛选，分离完全单一的克隆。
使用分离的噬菌体克隆中的2个克隆确定新型七次跨膜受体的全长基因的碱基序列。按通常方法，分别调制此2个克隆的噬菌体约为109pfu(噬斑形成单位)，用WizardLambda Preps(美国Promega公司制造)精制噬菌体DNA后，用EcoRⅠ消化得到DNA片段。同样地调制EcoRⅠ消化的质粒pBluescriptⅡ KS(+)(美国Stratagene公司制造)，将噬菌体DNA的EcoRⅠ片段重组在其中。重组了DNA的克隆的碱基序列用荧光序列分析仪进行解析，确定新型七次跨膜受体的全长基因，即序列3所示的碱基序列。本发明者们将此新型七次跨膜受体命名为C5L2。序列3中只编码C5L2蛋白的部分的碱基序列记载于序列1。此外，此含有编码此C5L2蛋白质的DNA的质粒命名为pBSC5L2。
实施例2中基因全长碱基序列所得的人七次跨膜受体C5L2的各器官中mRNA的表达以Northern印迹进行解析。作为固定各器官RNA的滤膜，使用Multiple Tissue Northern(MTN)印迹滤膜(Cat.#7757-1、#7759-1、#7760-1和#7767-1)(美国CLONTECH公司制造)。作为探针，C5L2基因3’末端的NaeⅠ-EcoRⅠ片段以实施例2相同的方法使用32P标记的形式使用。将上述滤膜浸入含5×SSPE溶液(1×SSPE溶液为0.15M NaCl/10mM NaH2PO4/1mM EDTA、pH7.4)、10×Denhardht溶液、2％SDS、50％甲酰胺和100微克/毫升鲑鱼精子DNA的杂交液中，在50℃下振荡2小时。接着将探针加入杂交液中，在50℃下振荡16小时，进行杂交。
滤膜的清洗是在含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，50℃下20分钟2次，60℃下20分钟1次。清洗后的滤膜在-85℃下进行放射自显影。其结果在外周血白细胞和脾脏中检出相当于C5L2的约2.4kb非常强的区带。此外，骨髓、淋巴结、脊髓、肾脏、肝脏、肺、胎盘和心脏也确认有弱的区带。尺寸较大区带见于外周血白细胞、脾脏和睾丸中。脑、骨骼肌、胰脏、胸腺、前列腺、胃、甲状腺、气管、肾上腺、胎儿脑、胎儿肺、胎儿肝和胎儿肾脏等任一个未检出区带。
未成熟树状细胞也检出2.4Kb的区带，但成熟树状细胞未检出区带。这说明C5L2的表达随着树状细胞的成熟而消失。
此混合物用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480,96℃下1分钟、60℃下1分钟、72℃下2分钟的循环进行20次循环后，在72℃下进行7分钟反应。所得PCR产物的一部分用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，确认扩增约1150bp的cDNA。按通常方法，PCR产物用苯酚/氯仿提取，进一步用乙醇沉淀，回收作为沉淀物的DNA。回收的DNA溶于灭菌水，得到DNA溶液。接着，所得DNA溶液依次用HindⅢ、SacⅡ处理。在0.8％琼脂糖凝胶上分离后，从凝胶中切出HindⅢ-SacⅡ片段，用GENECLEANⅡ试剂盒进行精制。PcDNA3.1/Myc-His(+)B也和上述一样用HindⅢ、SacⅡ消化后精制。将C5L2的HindⅢ-SacⅡ片段插入pcDNA3.1/Myc-His(+)B的HindⅢ-SacⅡ片段切出部位中，用DNA连接试剂盒Ver.2(日本宝酒造公司制造)连接，得到C5L2重组质粒。用所得质粒转化大肠杆菌DH5感受态细胞(日本宝酒造公司制造)。以氨苄青霉素抗性为指标回收转化体(即克隆)，用WizardMinipreps(美国Promega公司制造)按附带的说明书分离质粒。分离的质粒用限制性内切酶HindⅢ和SacⅡ消化，切出约1150bp的DNA，以确认C5L2基因重组入载体。重组了C5L2基因的重组DNA命名为pcDNAC5L2。
还有，大肠杆菌DH5中引入pcDNAC5L2的菌株E.Coli:DH5-pcDNAC5L2已由日本通商产业省工业技术生命工学工业技术研究所于平成10年9月1日进行保藏(保藏号FERM BP-6833)。
上述转化体的膜部分如下调制。将转化体(pcDNAC5L2转化体和对照)培养48～72小时，以PBS洗净细胞后，往培养细胞中加入1毫升/平板含EDTA(终浓度0.01％)的PBS。用细胞刮刀Cell Scraper-L(Cat.No.MS-93300)(日本住友电木社制造)将细胞从平板上剥离。平板上剥离的细胞用PBS清洗2次后，悬浊于0.5毫升CompleteTM(蛋白酶抑制剂混合剂片)(德国Boeringer Mannheim公司制造)的25mMHEPES溶液(pH7.4)，转移入微试管。用装有26G注射针头的注射器匀化细胞悬浊液后，用微试管用离心机(MRX-150型)(日本Tomy精工公司制造)在4℃、3000rpm下离心5分钟。回收离心分离所得的上清，回收的上清进一步在15000rpm下离心15分钟，回收沉淀物。此沉淀物用HMS液(50mM HEPES,pH7.4/5mM MgCl2/150mM NaCl)清洗2次后，悬浊于100微升的HMS液。此悬浊液作为膜部分调制液。
接着，使用所得膜部分调制液，以Western印迹法确认七次跨膜受体C5L2蛋白的表达。具体地说，往膜部分中加入2-巯基乙醇，进行5分钟沸水浴加热的还原处理后，使用5～15％梯度凝胶进行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺电泳)分子量标记使用rainbow标记物(高分子范围)(英国Amersham公司制造)。SDS-PAGE结束后，将丙烯酰胺凝胶中的蛋白质用微型印迹槽(美国Bio-Rad Laboratories公司制造)转印于Immun-Blot PVDF膜(免疫印迹用)(美国Bio-RadLaboratories公司制造)上。将转印有蛋白质的滤膜浸入BLOCKACE液，在4℃下振荡过夜，进行印迹。用TBS-T(20mM Tris-HCl,pH7.6/137mM NaCl/0.1％Tween 20)洗净滤膜后，用ECL Western印迹检测系统(英国Amersham公司制造)，根据操作手册进行Western印迹(蛋白质印迹、免疫印迹)。一次抗体使用实施例9制造的抗C5L2抗血清，二次抗体使用过氧化酶标记抗兔Ig驴抗体(英国Amersham公司制造)，分别在室温下反应1小时。对于和各抗体反应后的滤膜，分别用TBS-T在室温下振荡10分钟清洗3次。将洗净后的滤膜浸入ECL Western印迹检测系统的反应液5分钟，然后感光于X射线胶片。其结果是，在引入pcDNAC5L2的细胞的膜部分中检出约38～42Kb的区带，只引入pcDNA3.1/Myc-His(+)B载体的细胞的膜部分未检出此区带。
结果表明，C5L2转化细胞和作为对照的细胞之间放射活性没有显著差异。
基因引入后的细胞在含400微克/毫升Geneticin(Cat.No.11811-023)(美国GIBCO BRL)的培养基上以各种细胞浓度进行培养。培养2周时间增殖的细胞作为C5L2表达细胞。
使用上述C5L2表达CHO细胞，进行化学趋化的测定。作为含配基候选物质的样品材料，使用如下调制的LPS给予大鼠的血清。将明尼苏打沙门氏菌Re595来源的LPS(美国SI6MA)用生理盐水悬浊，使最终浓度为1毫克/毫升，用超声波仪(日本Branson公司制造)作超声波处理使之成透明液体。将其用生理盐水稀释10倍，对7周龄的Wistar大鼠(购自日本生物材料公司)尾静脉给予400微升。给药约22小时后的大鼠用乙醚麻醉，开腹，从心脏取血。所得血液用微试管用离心机在4℃、13000rpm下离心15分钟，其上清作为含有配基候选物质的样品材料。
在96孔微板箱(目录号EF-2292-96)(日本Funakoshi公司制造)中装入96孔微板(目录号FE-2300-02)(日本Funakoshi公司制造)和用含15微克/毫升纤连蛋白(美国SIGMA)的PBS处理的框架滤膜(孔径8微米)(目录号FE-2340-08)(日本Funakoshi公司制造)。下腔加入用含0.15％BSA(牛血清白蛋白)的RPMI1640培养基(Cat.No.22400-071)(美国GIBCO BRL)10倍稀释的样品材料。上腔加入用含0.15％BSA的RPMI1640培养基悬浊的C5L2蛋白表达CHO细胞，在5％二氧化碳、37℃下保温5小时，使样品材料和C5L2蛋白接触。然后，将滤膜固定和染色，在显微镜下观察。结果表明，观察化学趋化的细胞可见LPS给药大鼠血清中含有配基候选化合物。
此外，合成序列2的氨基酸序列中第1～23氨基酸构成的肽，和上述一样免疫家兔，采取其血清。从血清中用硫安沉淀粗制抗体蛋白质，应用透析与PBS进行缓冲液交换。在按附带操作手册固定抗原肽的AF-Tresyl TOYOPEARL凝胶(日本东曹株式会社制造)柱上，通过精制抗血清的一部分，使抗体蛋白质和抗原肽结合，以1.0M甘氨酸缓冲液(pH2.5)从柱上洗脱免疫球蛋白。免疫球蛋白应用透析与PBS进行缓冲液交换。此溶液中含有结合性高的抗C5L2免疫球蛋白，将其作为亲合精制抗C5L2抗血清溶液。对于此亲合精制抗C5L2抗血清溶液中的0.3毫克蛋白质，按附带的操作手册和EZ-Link(cat.No.21338)(美国PIERCE公司制造)反应，进行免疫球蛋白的生物素化。
从健康人采取外周血，用Ficoll回收单核细胞层。所得单核细胞进一步在培养皿(FALCON)中培养，然后回收黏附的细胞。将此黏附的单核细胞在37℃、5％二氧化碳环境下培养。还有，单核细胞因培养而分化，7天得到未成熟树状细胞时，11天得到成熟树状细胞。培养基使用含10％FBS(美国Intergen公司制造)和含1×抗生素-抗真菌剂的RPMI1640培养基。培养开始后7天进一步使用添加了刺激因子人GM-CSF(终浓度100ng/ml)和人IL-4(终浓度50ng/ml)的培养基，第7天以后的培养进一步使用添加人TNF-α(终浓度10ng/ml)的培养基，从健康者外周血调制树状细胞。
对于按上述培养方法所得的树状细胞，细胞表面表达的C5L2蛋白质用流式细胞计检测。树状细胞的标记如下所述进行。将细胞悬浊于含小鼠正常血清(丹麦DAKO公司制造)的PBS，作为一次标记，添加生物素化标记抗C5L2抗血清，在4℃下反应30分钟。阴性对照中，作为一次标记使用生物素化标记的兔IgG抗体。一次标记的细胞用PBS清洗2次。接着，作为二次标记，将FITC标记抗生物素蛋白(美国Beckton Dickinson公司制造)加入洗净后的细胞中，在4℃下反应30分钟。然后洗净细胞，得到标记细胞，以FACS Calibur(美国BecktonDickinson公司制造)测定荧光强度。
图1表示树状细胞表面表达的C5L2用FACS测定的结果。其结果表明，C5L2在未成熟树状细胞中表达高，相比之下成熟树状细胞中表达低。由此可见，本发明的新型七次跨膜受体C5L2在未成熟树状细胞中表达，在成熟树状细胞中表达减少。
PBMC和粒细胞的纯度分别用流式细胞计检定。细胞染色，首先取5～10×104个细胞入1.5毫升容量的试管，悬浊于1％BSA/PBS，离心。往沉淀的细胞部分中加入1％BSA/PBS 20倍稀释的荧光标记抗体，4℃下反应30分钟。对于荧光标记抗体，T细胞检测使用FITC标记抗人CD3抗体(克隆HIT3a；Cat.No.30114x)(Pharmingen公司制造)，B细胞检测使用PE(藻红蛋白Phycoerythrin)标记抗人CD19抗体(克隆HIB19；Cat.No.30655x)(Pharmingen公司制造)、PBMC检测使用FITC标记抗人CD14抗体(克隆M5E2；Cat.No.30544x)(Pharmingen公司制造)、粒细胞检测使用FITC标记抗CD66b抗体(克隆G10F5；Cat.No.33734x)(Pharmingen公司制造)，分别进行反应，标记细胞。反应后，细胞用1％BSA/PBS洗净，通过30微米的尼龙筛，用FACS Calibur测定荧光强度而检定纯度。(2)RNA的调制从如上所述调制的PBMC和粒细胞，按以下方法提取RNA。将5～10×106个细胞装入1.5毫升的试管，每次用PBS(-)0.5毫升清洗2次。洗净后尽量除去PBS(-)，加入400微升4M GITC溶液(4M异硫氰酸胍/25mM柠檬酸钠，pH7/0.5％N-月桂酰基肌氨酸钠)和2微升2-巯基乙醇，在室温下搅拌10分钟。使用装有20G注射针头的1毫升注射器，剪断细胞溶解的GITC溶液中的基因组DNA。接着，依次加入40微升2M乙酸钠(pH4.2)、440微升水饱和苯酚、120微升氯仿∶异戊醇(24∶1)，各试剂添加后充分混合，在冰中放置5分钟。用微试管用离心机将混合物在4℃、14000rpm下离心20分钟后，取300微升上层移入新试管。往新试管中加入同体积的2-丙醇，和上层液混合后，-80℃下放置30～60分钟。取出试管，在冰中将样品解冻后，用微试管用离心机在4℃、14000rpm下离心30分钟。弃去上清，用70％乙醇清洗3次沉淀物后，风干作为沉淀物所得的RNA平板。往RNA的平板中加入10～20微升的灭菌水，在65℃的温浴槽加热1～2分钟，溶解RNA。所得RNA溶液用DNaseⅠ(Amplification Grade)(Cat.No.18068-015)(美国GIBCO BRL)处理，分解基因组DNA。更进一步，用苯酚/氯仿提取，用乙醇进行沉淀，精制RNA，所得RNA的沉淀物溶于灭菌水，得到RNA。(3)RT-PCR法用1～5微克上述调制的RNA，按照SUPERSCRIPTTMⅡ RNase H-Reverse Transcriptase(Cat.No.18064-014)(美国GIBCO BRL)的操作手册，以逆转录反应合成cDNA。MRNA的表达量以相对于对照G3PDH基因表达量的表达率求出，C5L2基因和G3PDH基因分别进行PCR扩增。
PCR使用GeneAmp PCR Core Reagents(美国，PERKIN ELMER公司制造)、按附带的操作手册进行。往21.3微升相当15ng RNA的cDNA溶液中加入3微升10×PCR缓冲液、2.4微升25mM MgCl2,10mM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.6微升，20μM的5’引物和3’引物分别0.3微升，再加入0.15微升TaqStartTM抗体(美国CLONTECH公司制造)、0.15微升AmpliTaqDNA Polymerase，混合。C5L2基因的扩增使用序列9和10记载的引物，G3PDH基因的扩增使用序列11和12的引物。使用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480，在94℃下、进行2分钟的变性过程后，94℃下45秒、60℃下45秒、72℃下2分钟作为一个循环，共进行30次循环的扩增反应。最后循环后在72℃下进行7分钟的延长反应，然后冷却至4℃结束反应。反应液10微升用2％琼脂糖凝胶进行电泳后，使用Gel Print 2000i/VGA(美国Bio Image公司制造)将电泳图像存入计算机。用图像分析软件Basic Quantifier(日本BioImage Limited公司)将各基因的PCR产物量数值化，以同一样品中的G3PDH基因的PCR产物量作为100％，用相对值表示C5L2基因的PCR产物量。PCR进行2次，其平均值用于分析。(4)健康人的分析应用上述(1)～(3)的方法，研究自8个健康志愿者调制的PBMC和粒细胞中C5L2基因的表达率。用流式细胞计检定细胞纯度，粒细胞部分的CD66b阳性细胞的比率为细胞组分中全细胞数的90.5±3.2％(平均值±S.E.)，PBMC部分中CD66b阳性细胞的比率为4.1±0.9％。粒细胞中C5L2基因的表达率为73.4±17.8％，PBMC中C5L2基因的表达率为0.5±0.5％。由此结果可见，C5L2基因主要在粒细胞中表达(P≤0.01)。结果如表1所示。
表1健康人外周血来源单核细胞(PBMC)部分和粒细胞部分中C5L2基因的表达率
平均值±S.E. a)％G3PDH b)FACS分析(％)(5)采血后C5L2基因表达率的历时变化接着，研究采血后的C5L2基因表达率的历时变化。健康志愿者8例，对于从采血即后的血液(下面称为“新鲜血液”)调制的粒细胞和从采血后放置1夜的血液(下面称为“保存血液”)调制的粒细胞，比较C5L2基因的表达率。以G3PDH基因表达率作为100％，从新鲜血液调制的粒细胞的C5L2基因表达率为73.4±17.8％，从保存血调制的粒细胞的C5L2基因表达率为10.8±3.1％，可见C5L2基因的表达率历时减少。(P≤0.01)结果如表3所示。
更进一步，对于健康志愿者3例，从采血即后、6小时后和24小时后的外周血调制的粒细胞，同样地测定C5L2基因的表达率。结果是，C5L2基因表达率的平均值在采血即后为71.7％、6小时后为31.1％、24小时后为10.6％。由此可见，采血后6小时C5L2基因的表达率急剧减少，其后至24小时后继续减少，但其变化和最初6小时相比减慢。结果如图2所示。(6)RA患者的分析接着，从8例RA患者新鲜血调制的PBMC部分和粒细胞部分，比较C5L2基因的表达率。其结果可见，PBMC部分几乎不表达(0.0±0.0％)，只是粒细胞部分表达(44.7±4.7％)。对于RA患者，和健康人一样C5L2基因见于粒细胞部分高表达(P≤0.01)。对于此时的CD66b阳性细胞比率，PBMC部分为3.3±2.2％，粒细胞为80.9±5.8％。结果如表2所示。
接着，分析从RA患者8例的新鲜血液和12例保存血液分别调制的粒细胞部分中的C5L2基因的表达，和健康志愿者8例的新鲜血液和保存血液的分析结果进行比较。结果可见，以G3PDH基因的表达率为100％，从RA患者新鲜血液调制的粒细胞部分中C5L2基因的表达率为44.7±4.7％，从RA患者保存血液调制的粒细胞部分中C5L2基因的表达率为42.8±6.9％。RA患者来源的粒细胞部分中C5L2基因的表达率和健康人的不同，并不历时减少，而是维持不变。对于从保存血液调制的粒细胞部分中C5L2基因的表达率，相对于健康人的10.8±3.1％，RA患者为42.8±6.9％,RA患者来源的保存血液中C5L2基因的表达率比健康人的显著增高(P≤0.001)。结果如表3所示。
表2RA患者外周血来源单核细胞(PBMC)部分和粒细胞部分中C5L2基因的表达率
平均值±S.E. a)％G3PDH b)FACS分析(％)表3健康人和RA患者外周血来源单核细胞(PBMC)部分和粒细胞部分中C5L2基因的表达率因保存的变化
％G3PDH 平均值±S.E.
更进一步，RA患者的新鲜血液中C5L2基因的表达率和类风湿因子的表达率之间确认有显著的正相关关系(相关系数R=0.846,P≤0.01)，表明C5L2基因的表达率对于风湿的诊断很有用。结果如图3所示。
产业上的利用可能性使用本发明的人类来源新型七次跨膜受体蛋白及编码其的DNA，能够筛选对树状细胞功能有关疾病的治疗或预防有用的物质，发明如此疾病的诊断方法和诊断药。更进一步，应用本发明的包括测定人白细胞表达的七次跨膜受体蛋白质表达量的炎症疾病诊断方法，能够快速诊断炎症疾病，而且对以前在疾病初期阶段难于诊断的风湿等可以早期诊断。
序列表<110>旭化成工业株式会社<120>新型受体蛋白及应用其的炎症疾病诊断方法<130>99-1043<150>JP 10-249752<151>1998-09-03<150>JP 11-070800<151>1999-03-16<150>PCT/JP99/04801<151>1999-09-03<160>12<210>1<211>1014<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)...(1011)<400>1atg ggg aac gat tct gtc agc tac gag tat ggg gat tac agc gac ctc 48Met Gly Asn Asp Ser Val Ser Tyr Glu Tyr Gly Asp Tyr Ser Asp Leu1 5 10 15tcg gac cgc cct gtg gac tgc ctg gat ggc gcc tgc ctg gcc atc gac 96Ser Asp Arg Pro Val Asp Cys Leu Asp Gly Ala Cys Leu Ala Ile Asp20 25 30ccg ctg cgc gtg gcc ccg ctc cca ctg tat gcc gcc atc ttc ctg gtg144Pro Leu Arg Val Ala Pro Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val35 40 45ggg gtg ccg ggc aat gcc atg gtg gcc tgg gtg gct ggg aag gtg gcc192Gly Val Pro Gly Asn Ala Met Val Ala Trp Val Ala Gly Lys Val Ala50 55 60cgc cgg agg gtg ggt gcc acc tgg ttg ctc cac ctg gcc gtg gcg gat240Arg Arg Arg Val Gly Ala Thr Trp Leu Leu His Leu Ala Val Ala Asp65 70 75 80ttg ctg tgc tgt ttg tct ctg ccc atc ctg gca gtg ccc att gcc cgt288Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu Pro Ile Leu Ala Val Pro Ile Ala Arg85 90 95gga ggc cac tgg ccg tat ggt gca gtg ggc tgt cgg gcg ctg ccc tcc336Gly Gly His Trp Pro Tyr Gly Ala Val Gly Cys Arg Ala Leu Pro Ser100 105 110atc atc ctg ctg acc atg tat gcc agc gtc ctg ctc ctg gca gct ctc384Ile Ile Leu Leu Thr Met Tyr Ala Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Leu
115 120 125agt gcc gac ctc tgc ttc ctg gct ctc ggg cct gcc tgg tgg tct acg432Ser Ala Asp Leu Cys Phe Leu Ala Leu Gly Pro Ala Trp Trp Ser Thr130 135 140gtt cag cgg gcg tgc ggg gtg cag gtg gcc tgt ggg gca gcc tgg aca480Val Gln Arg Ala Cys Gly Val Gln Val Ala Cys Gly Ala Ala Trp Thr145 150 155 160ctg gcc ttg ctg ctc acc gtg ccc tcc gcc atc tac cgc cgg ctg cac528Leu Ala Leu Leu Leu Thr Val Pro Ser Ala Ile Tyr Arg Arg Leu His165 170 175cag gag cac ttc cca gcc cgg ctg cag tgt gtg gtg gac tac ggc ggc576Gln Glu His Phe Pro Ala Arg Leu Gln Cys Val Val Asp Tyr Gly Gly180 185 190tcc tcc agc acc gag aat gcg gtg act gcc atc cgg ttt ctt ttt ggc624Ser Ser Ser Thr Glu Asn Ala Val Thr Ala Ile Arg Phe Leu Phe Gly195 200 205ttc ctg ggg ccc ctg gtg gcc gtg gcc agc tgc cac agt gcc ctc ctg672Phc Leu Gly Pro Leu Val Ala Val Ala Ser Cys His Ser Ala Leu Leu210 215 220tgc tgg gca gcc cga cgc tgc cgg ccg ctg ggc aca gcc att gtg gtg720Cys Trp Ala Ala Arg Arg Cys Arg Pro Leu Gly Thr Ala Ile Val Val225 230 235 240ggg ttt ttt gtc tgc tgg gca ccc tac cac ctg ctg ggg ctg gtg ctc768Gly Phe Phe Val Cys Trp Ala Pro Tyr His Leu Leu Gly Leu Val Leu245 250 255act gtg gcg gcc ccg aac tcc gca ctc ctg gcc agg gcc ctg cgg gct816Thr Val Ala Ala Pro Asn Ser Ala Leu Leu Ala Arg Ala Leu Arg Ala260 265 270gaa ccc ctc atc gtg ggc ctt gcc ctc gct cac agc tgc ctc aat ccc864Glu Pro Leu Ile Val Gly Leu Ala Leu Ala His Ser Cys Leu Asn Pro275 280 285atg ctc ttc ctg tat ttt ggg agg gct caa ctc cgc cgg tca ctg cca912Met Leu Phe Leu Tyr Phe Gly Arg Ala Gln Leu Arg Arg Ser Leu Pro290 295 300gct gcc tgt cac tgg gcc ctg agg gag tcc cag ggc cag gac gaa agt960Ala Ala Cys His Trp Ala Leu Arg Glu Ser Gln Gly Gln Asp Glu Ser305 310 315 320gtg gac agc aag aaa tcc acc agc cat gac ctg gtc tcg gag atg gag 1008Val Asp Ser Lys Lys Ser Thr Ser His Asp Leu Val Ser Glu Met Glu325 330 335gtg tag 1014Val<210>2<211>337<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Gly Asn Asp Ser Val Ser Tyr Glu Tyr Gly Asp Tyr Ser Asp Leu1 5 10 15Ser Asp Arg Pro Val Asp Cys Leu Asp Gly Ala Cys Leu Ala Ile Asp20 25 30Pro Leu Arg Val Ala Pro Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val35 40 45Gly Val Pro Gly Asn Ala Met Val Ala Trp Val Ala Gly Lys Val Ala50 55 60Arg Arg Arg Val Gly Ala Thr Trp Leu Leu His Leu Ala Val Ala Asp65 70 75 80Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu Pro Ile Leu Ala Val Pro Ile Ala Arg85 90 95Gly Gly His Trp Pro Tyr Gly Ala Val Gly Cys Arg Ala Leu Pro Ser100 105 110Ile Ile Leu Leu Thr Met Tyr Ala Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Leu115 120 125Ser Ala Asp Leu Cys Phe Leu Ala Leu Gly Pro Ala Trp Trp Ser Thr130 135 140Val Gln Arg Ala Cys Gly Val Gln ValAla Cys Gly Ala Ala Trp Thr145 150155 160Leu Ala Leu Leu Leu Thr Val Pro Ser Ala Ile Tyr Arg Arg Leu His165 170 175Gln Glu His Phe Pro Ala Arg Leu Gln Cys Val Val Asp Tyr Gly Gly180 185 190Ser Ser Ser Thr Glu Asn Ala Val Thr Ala Ile Arg Phe Leu Phe Gly195 200 205Phe Leu Gly Pro Leu Val Ala Val Ala Ser Cys His Ser Ala Leu Leu210 215 220Cys Trp Ala Ala Arg Arg Cys Arg Pro Leu Gly Thr Ala Ile Val Val225 230 235 240Gly Phe Phe Val Cys Trp Ala Pro Tyr His Leu Leu Gly Leu Val Leu245 250 255Thr Val Ala Ala Pro Asn Ser Ala Leu Leu Ala Arg Ala Leu Arg Ala260 265 270Glu Pro Leu Ile Val Gly Leu Ala Leu Ala His Ser Cys Leu Asn Pro275 280 285Met Leu Phe Leu Tyr Phe Gly Arg Ala Gln Leu Arg Arg Ser Leu Pro290 295 300Ala Ala Cys His Trp Ala Leu Arg Glu Ser Gln Gly Gln Asp Glu Ser305 310 315 320Val Asp Ser Lys Lys Ser Thr Ser His Asp Leu Val Ser Glu Met Glu325 330 335Val<210>3<211>1287<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3cctgtgtgcc acgtgctgga caaatcttaa ctcctcaagg actcccaaaa ccagagacac 60caggagcctg aatggggaac gattctgtca gctacgagta tggggattac agcgacctct 120cggaccgccc tgtggactgc ctggatggcg cctgcctggc catcgacccg ctgcgcgtgg 180ccccgctccc actgtatgcc gccatcttcc tggtgggggt gccgggcaat gccatggtgg 240cctgggtggc tgggaaggtg gcccgccgga gggtgggtgc cacctggttg ctccacctgg 300ccgtggcgga tttgctgtgc tgtttgtctc tgcccatcct ggcagtgccc attgcccgtg 360gaggccactg gccgtatggt gcagtgggct gtcgggcgct gccctccatc atcctgctga 420ccatgtatgc cagcgtcctg ctcctggcag ctctcagtgc cgacctctgc ttcctggctc 480tcgggcctgc ctggtggtct acggttcagc gggcgtgcgg ggtgcaggtg gcctgtgggg 540cagcctggac actggccttg ctgctcaccg tgccctccgc catctaccgc cggctgcacc 600aggagcactt cccagcccgg ctgcagtgtg tggtggacta cggcggctcc tccagcaccg 660agaatgcggt gactgccatc cggtttcttt ttggcttcct ggggcccctg gtggccgtgg 720ccagctgcca cagtgccctc ctgtgctggg cagcccgacg ctgccggccg ctgggcacag 780ccattgtggt ggggtttttt gtctgctggg caccctacca cctgctgggg ctggtgctca 840ctgtggcggc cccgaactcc gcactcctgg ccagggccct gcgggctgaa cccctcatcg 900tgggccttgc cctcgctcac agctgcctca atcccatgct cttcctgtat tttgggaggg 960ctcaactccg ccggtcactg ccagctgcct gtcactgggc cctgagggag tcccagggcc 1020aggacgaaag tgtggacagc aagaaatcca ccagccatga cctggtctcg gagatggagg 1080tgtaggctgg agagacattg tgggtgtgta tcttcttatc tcatttcaca agactggctt 1140caggcatagc tggatccagg agctcaatga tgtcttcatt ttattccttc cttcattcaa 1200cagatatcca tcatgcactt gctatgtgca aggccttttt aggcactaga gatatagcag 1260tgaccaaaac agacacaaat cctgccc 1287<210>4<211>1287<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4gggcaggatt tgtgtctgtt ttggtcactg ctatatctct agtgcctaaa aaggccttgc 60acatagcaag tgcatgatgg atatctgttg aatgaaggaa ggaataaaat gaagacatca 120ttgagctcct ggatccagct atgcctgaag ccagtcttgt gaaatgagat aagaagatac 180acacccacaa tgtctctcca gcctacacct ccatctccga gaccaggtca tggctggtgg 240atttcttgct gtccacactt tcgtcctggc cctgggactc cctcagggcc cagtgacagg 300cagctggcag tgaccggcgg agttgagccc tcccaaaata caggaagagc atgggattga 360ggcagctgtg agcgagggca aggcccacga tgaggggttc agcccgcagg gccctggcca 420ggagtgcgga gttcggggcc gccacagtga gcaccagccc cagcaggtgg tagggtgccc 480agcagacaaa aaaccccacc acaatggctg tgcccagcgg ccggcagcgt cgggctgccc 540agcacaggag ggcactgtgg cagctggcca cggccaccag gggccccagg aagccaaaaa 600gaaaccggat ggcagtcacc gcattctcgg tgctggagga gccgccgtag tccaccacac 660actgcagccg ggctgggaag tgctcctggt gcagccggcg gtagatggcg gagggcacgg 720tgagcagcaa ggccagtgtc caggctgccc cacaggccac ctgcaccccg cacgcccgct 780gaaccgtaga ccaccaggca ggcccgagag ccaggaagca gaggtcggca ctgagagctg 840ccaggagcag gacgctggca tacatggtca gcaggatgat ggagggcagc gcccgacagc 900ccactgcacc atacggccag tggcctccac gggcaatggg cactgccagg atgggcagag 960acaaacagca cagcaaatcc gccacggcca ggtggagcaa ccaggtggca cccaccctcc 1020ggcgggccac cttcccagcc acccaggcca ccatggcatt gcccggcacc cccaccagga 1080agatggcggc atacagtggg agcggggcca cgcgcagcgg gtcgatggcc aggcaggcgc 1140catccaggca gtccacaggg cggtccgaga ggtcgctgta atccccatac tcgtagctga 1200cagaatcgtt ccccattcag gctcctggtg tctctggttt tgggagtcct tgaggagtta 1260agatttgtcc agcacgtggc acacagg 1287<210>5<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>修饰碱基<222>18<223>i<220><221>修饰碱基<222>22<223>i<220><221>修饰碱基<222>24<223>i<220><223>与黑色素瘤增殖相关的已知七次跨膜受体蛋白序列为基础设计的变性PCR法的引物<400>5atcttaagct tgaacctngc cntngcdgac 30<210>6<211>33<212>DNA<213>人工合成序列<220><221>misc difference<222>21<223>a,g,c or t<220><221>修饰碱基<222>22<223>i<220><221>修饰碱基<222>28<223>i<220><223>与黑色素瘤增殖相关的已知七次跨膜受体蛋白序列为基础设计的变性PCR法的引物<400>6cccaacgaat tcrtagatsa nnggrttnay rca 33<210>7<211>32<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于构建含有C5L2基因重组DNA的合成引物；引物中含有序列1碱基序列第1个的a至第22个的t相当的22碱基序列的5’末端中插入间隔序列gggg和限制性内切酶HindⅢ识别序列aagctt形成的序列<400>7ggggaagctt atggggaacg attctgtcag ct32<210>8<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于构建含有C5L2基因重组DNA的合成引物；引物中含有序列4碱基序列第206个的c至第225个的a相当的22碱基序列的5’末端中插入间隔序列gggg和限制性内切酶SacⅡ识别序列ccgcgg形成的序列<400>8gggaccgcgg cacctccatc tccgagacca 30<210>9<211>26<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增C5L2基因的RT-PCR中所用的合成引物<400>9atcatcctgc tgaccatgta tgccag 26<210>10<211>25<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增C5L2基因的RT-PCR中所用的合成引物<400>10aaccggatgg cagtcaccgc attct 25<210>11<211>26<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增G3PDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的RT-PCR中所用的合成引物<400>11tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt26<210>12<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>扩增G3PDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的RT-PCR中所用的合成引物<400>12catgtgggcc atgaggtcca ccac 2权利要求
1．一种实质上纯的人类来源七次跨膜受体蛋白，其特征在于具 有序列2记载的氨基酸序列。
2．一种实质上纯的肽，其特征在于为序列2中记载氨基酸序列中至少5个连续氨基酸序列构成的片段。
3．编码权利要求1记载的七次跨膜受体蛋白的分离DNA。
4．根据权利要求3记载的分离DNA，其特征在于具有序列1记载的碱基序列。
5．序列3记载DNA中至少连续12个碱基构成的DNA片段或其衍生物。
6．序列4记载DNA中至少连续12个碱基构成的DNA片段或其衍生物。
7．和序列3记载DNA互补的RNA中至少连续12个碱基构成的RNA片段或其衍生物。
8．可复制重组DNA，是权利要求3～6任一项记载DNA与可复制表达载体重组得到的。
9．权利要求8记载的可复制重组DNA转化的微生物或培养细胞。
10．七次跨膜受体蛋白，通过包括以下步骤的方法得到，(a)将权利要求3或4记载的分离DNA与可复制表达载体连接、得到该DNA可操作地插入可复制载体重组形成的可复制重组DNA，(b)该可复制重组DNA转化微生物或培养细胞形成转化体，(c)从该微生物或培养细胞的母体细胞中选出该转化体，(d)培养该转化体、以该转化体表达该DNA等的方法在该转化体细胞表面制造。
11．筛选和七次跨膜受体蛋白结合配基的方法，包括将权利要求1或10记载的蛋白、或上述2记载的肽和样品材料接触，以该蛋白或该肽和配基结合相应所起变化为指标，检测和七次跨膜受体蛋白结合配基。
12．筛选抑制七次跨膜受体蛋白和该蛋白相应配基结合的物质的方法，包括将权利要求1或10记载的蛋白、或权利要求2记载的肽和样品材料接触，以该蛋白或该肽和配基结合相应所起变化为指标，检测抑制七次跨膜受体蛋白和配基结合的物质的方法。
13．和权利要求1记载的七次跨膜受体蛋白特异结合的抗体。
14．一种炎症疾病的诊断方法，其特征在于，对于炎症疾病的诊断方法，包括测定人类白细胞表达的七次跨膜受体蛋白的表达量，该七次跨膜受体蛋白为序列2记载的氨基酸序列构成的蛋白质。
15．根据权利要求14记载的诊断方法，其特征在于该炎症疾病为类风湿性关节炎。
16．根据权利要求14或15记载的诊断方法，其特征在于该人类白细胞为人类粒细胞。
17．根据权利要求16记载的诊断方法，其特征在于该人类粒细胞为从人类组织采取的粒细胞。
18．根据权利要求17记载的诊断方法，其特征在于该人类粒细胞为至少在诊断进行6小时前采取的粒细胞。
19．根据权利要求14记载的诊断方法，其特征在于该表达量的测定是对编码该蛋白mRNA的定量而进行的。
20．根据权利要求19记载的诊断方法，其特征在于该mRNA的定量是以RT-PCR法进行。
21．根据权利要求14记载的诊断方法，该表达量的测定是对该白细胞表面存在的该蛋白的定量而进行的。
22．根据权利要求21记载的诊断方法，其特征在于该蛋白的定量是用和该蛋白特异反应的抗体进行的。
全文摘要
本发明公开了未成熟树状细胞中发现的新型七次跨膜受体蛋白及编码其的DNA。更进一步，本发明公开了与能复制上述DNA的表达载体重组的可复制重组DNA，上述可复制重组DNA转化的微生物或培养细胞，上述转化体细胞表面表达的七次跨膜受体蛋白，筛选上述七次跨膜受体蛋白的配基和抑制配基与七次跨膜受体蛋白结合的物质的方法，以及和上述七次跨膜受体蛋白结合的抗体。更进一步，本发明公开了包括测定人白细胞表达的七次跨膜受体蛋白表达量的风湿等炎症疾病的诊断方法。
文档编号C12N1/15GK1317046SQ99810627
公开日2001年10月10日 申请日期1999年9月3日 优先权日1998年9月3日
发明者高桥恒夫, 大野满春, 石丸弘, 菅野仁喜, 高桥千晶 申请人:旭化成株式会社