一种抑制李斯特菌的涂层、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及食品安全领域，具体设及一种抑制李斯特菌的涂层、其制备方法及应 用。 技术背景
[0002] 单核细胞增生李斯特菌（单增李斯特菌）的危害由来已久，且该菌在环境中无处 不在。1983年，在美国马萨诸塞州爆发了一起由污染李斯特菌的己氏杀菌全脂牛奶和含 2%脂肪的牛奶造成的至少14人死亡的案例。1985年，在美国加利福尼亚州再次爆发了由 单增李斯特菌污染的墨西哥类型软芝±造成的人感染李斯特菌病的病例。该次爆发中有超 过100例的确诊病例，并造成了至少40人死亡。美国食品和药品管理局于1986年进行的一 项调查显示，全美357家乳品加工厂中，有2. 5%的工厂在其产品中含有李斯特菌。Lwasor 等人在1989年从全蛋液中分离出了单增李斯特菌，随后对肉、蔬菜等的检测中都发现了单 增李斯特菌的存在。近年来还出现了由污染的豆芽、卷屯、菜和香瓜导致的李斯特菌病爆发 病例。李斯特菌是一种革兰氏阳性杆菌，可W在4°C至45°C生长，单独的制冷措施不足W防 止其在食品中的繁殖，Doyle等人于1987的调查中发现单增李斯特菌能在己氏杀菌条件下 存活，所W其在原料和食品加工工程中不可避免的存在，因此二次杀菌处理十分必要。
[0003] 现有技术中，牛奶等食物储存过程中需要添加化学成分的抑菌、杀菌剂，由于化学 成分抑菌、杀菌剂大多数采用化学方法合成，存在较多安全隐患，不符合消费者对于安全、 健康和天然的要求。
[0004] 耐久肠球菌NJ株产生的细菌素对李斯特菌属（尤其是单增李斯特菌）、耐久肠球 菌、粪肠球菌和尿肠球菌都能抑制，对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液链球菌嗜 热亚种和大肠杆菌等菌株无抑制作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抑制李斯特菌的涂层，能高效抑制李斯特菌的生长，应 用食品保鲜时可有效避免现阶段使用的广谱杀菌细菌素对食品中其他有益菌的抑制，无毒 副作用，可W用于玻璃、塑料、陶瓷和铁制品上。
[0006] 本发明的另一目的是提供所述涂层的制备方法，该方法安全、简单、成本低，适合 在食品工业广泛的推广。
[0007] 本发明的再一目的是提供所述涂层在食品安全领域中的应用。
[0008] 本发明目的是通过W下方案来实现的：
[0009] 一种抑制李斯特菌的涂层，含有95-105质量份聚乳酸，20-65质量份可抑制李斯 特菌的细菌素；所述细菌素来源于耐久肠球菌巧nterococcus化rans)NJ株。
[0010] 在本发明中，所述可抑制李斯特菌的细菌素效价为7*105-9*105AU/g。
[0011] 在本发明中，所述涂层的厚度为0.1-0. 3毫米。
[0012] 在本发明中，所述可抑制李斯特菌的细菌素采用如下方法制备：发酵培养耐久肠 球菌巧nterococcus化rans)NJ株，取发酵液，离屯、分离上清液和菌体沉淀；将所述上清液 采用大孔吸附树脂分离，收集含有所述细菌素的洗脱液A;采用异丙醇水溶液洗涂菌体沉 淀表面的细菌素，得到洗脱液B;合并洗脱液A和B，用截留分子量为1000-3000化的透析袋 分离，取截留液，即得所述可抑制李斯特菌的细菌素。
[0013] 本发明还提供一种制备所述抑制李斯特菌涂层的方法，包括如下步骤：将聚乳酸 和可抑制李斯特菌的细菌素加入溶剂中，揽拌至聚乳酸溶解、所述细菌素均匀分散于溶剂 中，得到涂层溶液；将所述涂层溶液倒入容器内或者涂覆于物体表面，除去溶剂、干燥。
[0014] 优选的技术方案中，所述溶剂为二氯甲烧。
[0015] 优选的技术方案中，每15ml溶剂内加入的聚乳酸为0. 5-1. 5邑。
[0016] 优选的技术方案中，所述干燥的溫度为25-90°C，干燥时间为2-20小时。
[0017] 在本发明中，所述容器或物体的材料为塑料、陶瓷、金属或玻璃。
[0018] 本发明还提供所述抑制李斯特菌涂层在食品安全方面的应用。
[0019] 本发明抑制李斯特菌的涂层，能高效抑制李斯特菌的生长，应用食品保鲜储存领 域时可有效避免现阶段使用的广谱杀菌细菌素对食品中其他有益菌的抑制，无毒副作用， 可W用于玻璃、塑料、陶瓷和铁制品上，成本低廉。本发明所述涂层的制备方法，安全、简单、 成本低，适合在食品工业广泛的推广。
【附图说明】：
[0020] 图1显示了涂层前后玻璃瓶的变化。从左往右分别为无涂层玻璃瓶（没有涂覆任 何物质）、对照涂层玻璃瓶、含有细菌素NJ的涂层玻璃瓶（该玻璃瓶内壁涂覆了含有细菌素 NJ的涂层）。
[0021] 图2显示了 4°C条件下培养不同时间后，各玻璃瓶内牛奶样品中单增李斯特菌 ScottA的菌落数，其中"无"表示玻璃瓶中无涂层，PLA表示对照涂层玻璃瓶，NJ表示内壁 涂覆了含有细菌素NJ的涂层的玻璃瓶，且NJ前方数字表示涂层中细菌素NJ的含量。
[0022] 图3显示了 25°C条件下培养不同时间后，各玻璃瓶内牛奶样品中单增李斯特菌 ScottA的菌落数，其中"无"表示玻璃瓶中无涂层，"PLA"表示对照涂层玻璃瓶，"NJ"表示 内壁涂覆了含有细菌素NJ的涂层的玻璃瓶，且NJ前方数字表示涂层中细菌素NJ的含量。
[0023] 图4显示了牛奶在玻璃瓶内、4°C条件下保存42天后状态，其中图A中玻璃瓶的涂 层内含有250mg细菌素NJ，图B中玻璃瓶的涂层内含有500mg细菌素NJ。
[0024] 图5是涂层中细菌素NJ和乳酸链球菌细菌素Nisin加入量对抑制单增李斯特菌 ScottA的生长情况的比较。其中"无"表示玻璃瓶中无涂层，"PLA"表示对照涂层玻璃瓶， "NJ"表示内壁涂覆了含有细菌素NJ的涂层的玻璃瓶，"NISN"表示内壁涂覆了含有乳酸链 球菌细菌素Nisin的涂层的玻璃瓶，NJ或NISN前方数字表示涂层中细菌素的含量。
[00巧]图6是铁质容器涂层前后对比，其中（A)是无涂层，度）是有涂层。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1细菌素NJ的制备 W27] 发酵培养基配方：膜蛋白腺（0X0ID) 30g/L，酵母粉（0X0ID)lOg/L，牛肉膏 (0X0ID)lOg/l，憐酸氨二钟5g/l，乳糖5g/l，使用憐酸调节pH值6. 5,溶剂为水。
[0028] 将保存在-70 °C的耐久肠球菌巧nterococcusdurans)NJ株（公开于 化201310265229. 3号发明专利中）接种于发酵培养基中，37°C、厌氧条件下过夜培养用W 活化NJ株。然后再W1% (v/v)的接种量将活化的NJ株菌液转接于发酵培养基中，在隔水 式恒溫培养箱中37Γ、厌氧条件下静置培养1她。
[0029] 耐久肠球菌NJ株所产细菌素命名为细菌素NJ。细菌素NJ的纯化过程如下：收 集培养1化后的耐久肠球菌NJ株发酵液，4°C、12000r/min离屯、20min，分离上清液和菌体 沉淀，其中上清液作为细菌素NJ粗提液。将大孔树脂狂AD-16树脂）进行预处理：采用抑 2.0、浓度为70% (v/v)的异丙醇水溶液漂洗，然后采用超纯水平衡。细菌素NJ粗提液采 用预处理后的大孔树脂吸附，pH2.0、浓度为70% (v/v)的异丙醇水溶液洗脱，收集洗脱液 A。另外，用抑2.0、浓度为70% (v/v)的异丙醇水溶液重新悬浮菌体沉淀，洗涂粘附在肠 球菌上的细菌素，4°C、12000r/min离屯、20min取上清液，作为洗脱液B。合并洗脱液A、B， 在75°C恒溫旋转蒸发至25mU采用截留分子量为1000化的透析袋透析过夜，取截留液再次 75°C恒溫旋转蒸发至25mU冷冻干燥后得到细菌素NJ冻干粉。
[0030] 细菌素NJ的成本计算过程如下：1L培养基经过W上制备方法可W得到细菌素冻 干粉5g，成本为454. 11元，具体分析如表一。因此，细菌素NJ的成本为90.8元/克。 阳03U 表一：细菌素NJ的成本
[0032]
[0033] 细菌素NJ效价的测定W单核细胞增生李斯特菌作为指示菌，具体方法如下：将 Ig/mL细菌素溶液进行2倍倍比稀释（在EP管中加入100μL的超纯水，然后取100μL肠 球菌素加入超纯水中，混匀后逐级向下稀释）。取稀释好的细菌素溶液5μ以滴加到接种有 0.5% (v/v)新鲜的单核细胞增生李斯特菌的ΒΗΙ固体培养基（北京陆桥技术股份有限公 司）上，通过琼脂扩散法检测该梯度细菌素稀释液的抑菌效果。细菌素的效价用下式计算：
[0034] X= 2"X(1000/A)
[0035] 式中：η-细菌素对单核细胞增生李斯特菌有抑菌效果的最大稀释次数;A-滴加的 细菌素溶液的体积（μ?;X-细菌素的效价（AU/mL或者AU/g)。
[0036] 经过检测，本实施例中制备的细菌素NJ的效价为819200AU/g。
[0037] 实施例2在玻璃瓶内壁涂覆抑制李斯特菌的涂层 阳03引 1.制备涂层的溶剂选择
[0039] 为了选择安全、高效的溶剂，考察大量溶剂对聚乳酸（PLA)的溶解性能，其中部分 溶剂的溶解性能列于表二。PLA，购自化化reworks化C，型号为4060D，比重1. 24,溶体密度 在230°C时为1. 08,玻璃化转变溫度为55-60°C，相对粘度为3. 4。 柳4〇] 表二：PLA的溶解情况（室溫）
[0041 ]
[0042] 从表二可W看出，PLA在二氯甲烧和氯仿中有较好的溶解性，室溫条件即可溶解， 在丙酬中溶解性相对略差，由于氯仿的毒性较大，故本实验选取二氯甲烧作为溶剂。 阳0创 2.在玻璃瓶内壁涂覆含有细菌素NJ的涂层 W44] 准确称取一克PLA和80mg细菌素NJ。将PLA