一种利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一种利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法及应用。该方法中的微生物采用产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC AY 93161和异常汉逊酵母(Hansenulaanomala var.anomala)CCTCC AY 93047中的一种或两种以上。本发明利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法吸附效果好、成本低、绿色环保，不会产生二次污染，也不会破坏柑橘汁的营养价值，具有较好的市场应用前景。
【专利说明】
一种利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于食品安全技术领域，具体而言，涉及一种利用失活微生物去除柑橘汁 中展青霉素的方法及应用。
【背景技术】
[0002] PAT(patulin，PAT)，又名棒曲霉素，是一种半缩醛内酯，分子式为C7H6O 4,化学名称 为4-羟基-4-氢-呋喃-[3，2碳]-吡喃-2(6氢)酮。PAT具有急性毒性，包括对动物的肺、脑水 月中、肝脏、脾脏、肾的损害和免疫系统的毒害作用;也具有慢性毒性，表现在对动物的细胞毒 性，基因毒性和免疫毒性。对疏基有强未和力，可与含疏基的蛋白和多妝反应，破坏DNA单链 和双链，从而抑制DNA和RNA的合成，也可抑制多种酶活性，特别是一些生化指标中的酶，如 碱性磷酸酶、二磷酸果糖酶和己糖激酶等。此外，PAT对成年哺乳动物和胚胎期动物的肾脏 也有毒害作用。直接接触皮肤，可引起DNA损伤，从而造成细胞周期阻滞和内部介导细胞凋 亡，积累大量具有皮肤毒性的聚胺产物。
[0003] PAT是水果中常见的真菌毒素，在霉烂的杏、李、桃、梨、香蕉、菠萝、青梅、蜜瓜、蕃 茄、樱桃、辣椒、葡萄、柿子、黄瓜、胡萝卜、蕃茄酱、苹果汁、苹果酱、葡萄汁、苹果制品、谷物、 糕点及豆科植物、陈的火腿、干香肠等食品中均有发现。目前，世界上已经有很多国家制定 了水果及其制品中PAT的最高限量标准。1995年，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品 添加剂联合专家委员会(JECFA)将PAT的每天容许摄入量定为0.4yg/kg bw。在欧洲，由欧洲 卫生与消费者保护委员会发起的一项科学研究表明，PAT每日允许摄入量要远远低于JECFA 设定的水平。我国规定在苹果和山楂制品中限量值为SOyg/kg。目前，国内外对柑橘属中PAT 的限量标准属于空白，亟待针对不同柑橘种类、不同食用方式等进行相关PAT限量标准的研 究和完善。
[0004] 为了降低食品中PAT的含量，人们尝试了很多控制方法，比较传统的方法主要可归 纳为物理法和化学法。物理方法如加强原料的挑选和清洗、物理吸附和澄清等，但是这种方 法耗时又费力，而且据报道PAT可以从腐烂部位渗透至未腐烂部位，在完整的水果部位仍然 可以检测到PAT。另外，清洗会使PAT进入清洗用水中造成清洗容器、工具及环境的二次污 染。再者，在果汁加工过程中使用活性炭进行吸附，但活性炭也严重影响了果汁的颜色并且 大大降低了总酚含量。化学方法主要为使用添加剂或化学杀菌剂等手段降低PAT的含量，但 是这些添加剂只能抑制PAT产生菌的生长和产毒，不能够直接去除食品中已经含有的PAT。
[0005] 目前，世界范围内柑橘汁中的PAT污染都很严重，严重影响人们的身体健康，因此 研究如何去除柑橘汁中PAT，这显得尤为重要。
【发明内容】
[0006] 鉴于现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用失活微生物去除柑橘 汁中展青霉素的方法及应用。
[0007] 为了实现本发明的目的，发明人利用多年的科研实践经验，并结合大量试验研究， 优选出灭活后能在柑橘汁中高效去除展青霉素的微生物菌株，从而实现了本发明的目的。 具体地，本发明的技术方案概况如下：
[0008] -种利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，该方法包括如下步骤：
[0009] (1)将酵母菌接种液体培养基中培养，所述的酵母菌选自产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)CCTCC AY 93161 和异常汉逊酵 母（Hansenula anomala var.anomala)CCTCC AY 93047中的一种或两种以上，至细胞数达 到0.5X1010~2.0\1010〇卩1]/11^，然后在1-5°(：下3000~500(^/11^11离心10-3011^11，离心得到 的菌泥用蒸馏水洗涤1~3次；
[0010] (2)将菌泥以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在-22~-18°C下的预冷8-16h，之后再将 预冷的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为-56~-52°C，真空度4-6mtorr，时间 20-30h，冷冻干燥完成之后，即得到失活微生物菌粉；
[0011] (3)将失活微生物菌粉加入柑橘汁中，置于4-10°C温度下震荡或搅拌处理10~ 24h，处理结束后进行离心，过滤，得去除展青霉素的柑橘汁。
[0012] 优选地，如上所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(2)的 技术参数为:预冷温度-20 °C，预冷时间12h，冷冻温度-54°C，真空度5mtorr，时间26h。
[0013] 优选地，如上所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(3)中 失活微生物菌粉的用量与柑橘汁中展青霉素的质量比为2000~10000:1。
[0014] 进一步优选地，如上所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中的 酵母菌为产H元假丝酵母(Candida utilis)CICCl769。
[0015] 再进一步优选地，如上所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中 的柑橘汁为橙汁。
[0016] 另外，由于上述失活微生物利用其细胞上的化学键与展青霉素结合，产生吸附或/ 和降解的作用，从而可以高效去除柑橘汁中展青霉素，因此本发明还提供了上述失活微生 物菌株的新应用，即：失活微生物在制备柑橘汁中展青霉素吸附剂中的应用，所述的失活微 生物选自失活的产H元假丝酵母（Candida utilis)ClCC1769、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)CCTCC AY 93161 和异常汉逊酵母(Hansenula anomala var.anomala)CCTCC AY 93047中的一种或两种以上。优选所述的失活微生物选自失活的产朊假丝酵母(Candida ut i I is) CICCl 769。优选所述的柑橘汁为橙汁。
[0017] 与现有技术相比，本发明利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法吸附效果 好、成本低、绿色环保，不会产生二次污染，也不会破坏柑橘汁的营养价值，具有较好的市场 应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1为利用HPLC检测展青霉素的标准曲线。
[0019]图2为8种菌株对酸化水中展青霉素去除能力的测定结果。
[0020]图3为优选的3种菌株对橙汁中展青霉素去除能力的测定结果。
[0021] 图4为Candida.utilis CICC1769菌株的细胞形态显微图。
[0022]图5为Candida.utilis CICC1769的生长曲线图。
【具体实施方式】
[0023] 以下试验例进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，试验例仅用于例证的 目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变 也包含在本发明范围之内。需要说明的是，本发明所采用的菌株均购买于中国工业微生物 菌种保藏管理中心(CICC)或中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
[0024] 试验例1:8种菌株在模拟酸化水体系中对展青霉素去除能力的评价 [0025] 1、主要试剂的配制
[0026] CM0005乳酸菌培养基：酵母膏7.5g，葡萄糖10 . Og，番茄汁IOOmL，蛋白胨7.5g， KH2P042 · Og，吐温80 0 · 5mL，蒸馏水900mL，pH 7 · 0。121°C 下，灭菌15min。C0006MRS培养基： 酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉8. Og，酵母粉4. Og，葡萄糖20g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5. Og，柠檬酸三 铵2 · Og，磷酸氢二钾2 · Og，硫酸锰0 · 05g，吐温80 1 · Og，蒸馏水1000 mL，pH 6 · 2 ± 0 · 2。121°C 下，灭菌15min。CMO181酵母菌培养基：酵母膏3. Og，麦芽浸膏3. Og，蛋白胨5. Og，葡萄糖 10 .Og，琼脂20.0 g，蒸馈水1000 mLc3IlSO 下，灭菌25min。
[0027] CM0221胰胨-大豆胨琼脂:胰胨-大豆胨琼脂40.0 g，蒸馏水1000mL。121°C下，灭菌 15min〇
[0028] CM0787强化梭菌琼脂培养基：牛肉膏lO.Og，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，葡萄糖 5. Og，淀粉I .Og，氯化钠5. Og，乙酸钠3. Og，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000 mL，琼脂 158，121。(：下，灭菌1511^11，口!16.8±0.2(25。(：）。
[0029] Imol/LNaOH溶液:称取4. OgNaOH固体，溶解后定容于IOOmL水中。
[0030] PAT标准溶液:准确称取标准品Img置于IOmL的容量瓶中，用乙酸乙酯稀释、定容， 配置成l〇〇yg/mL的PAT乙酸乙酯标准储备液，置于-20°C保存。
[0031 ] 取标准储备液（100yg/mL) ImL于IOOmL烧杯中用氮气吹干，用酸化水（乙酸酸化至 pH 4.0)溶解洗涤转入到IOOmL锥形瓶用酸化水(pH 4.0)定容，即为1000yg/L的PAT酸化水 试验溶液，置于_20°C保存，备用。
[0032] 2、菌体处理
[0033]用接种环挑取一环菌悬液于200mL相应培养（于500mL三角瓶）中，酵母菌置于30 °C，120r/，mim振荡培养24h。
[0034] 根据标准生长曲线，使细胞数达到I X 101QCFU/mL以上，。然后4000r/min在4°C下离 心20min，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤2次。
[0035] 将洗涤后的菌泥采用高压蒸汽灭菌法在121°C下灭菌20min，然后在-20°C下的预 冷i 2h，再将经过预冷处理的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，其中设置温度为-54 °C，真 空度5mt〇rr，时间26h。冷冻干燥完成之后，即得到失活菌粉。
[0036] 3、PAT的HPLC检测方法
[0037] 按照AOAC标准方法测定，展青霉素的检测条件为：
[0038] 1)检测条件:色谱柱Unitary ODS C18反相柱(250mmX4.6mmX5ym);流动相为乙 腈:水= 1:9,超声波脱气30min;检测器为紫外检测器，检测波长276nm;柱温30°C;流速为 1.0mL/min，进样量为20yL;样品在检测前需经0.22μπι微孔膜过滤后收集至HPLC 2mL进样瓶 中，供HPLC测定。展青霉素的出峰时间为8.1-10.1 min。
[0039] 2)标准曲线绘制：用酸化水（冰醋酸调节pH值为4.0)配置不同浓度梯度（1000、 500、250、125、100、50、25yg/L)的PAT标准品，在高效液相色谱上进行定量检测，建立峰面积 与PAT浓度之间的一元线性回归方程。
[0040] 测定的标准曲线如图1，线性回归方程为y = 0.0148X-2.3862，相关系数为0.9998。 在25-1000yg/LPAT浓度范围内，与对应的峰面积之间具有良好的线性关系。
[0041] 3)去除率的计算:展青霉素去除率=(对照展青霉素HPLC峰面积-吸附后展青霉素 HPLC峰面积)/对照展青霉素HPLC峰面积X 100 %
[0042] 试验过程中通过HPLC测定样品的峰面积代入图1建立的回归方程，即可计算出样 品中PAT的浓度。
[0043] 4、8种菌株对展青霉素去除能力的测定
[0044]发明人结合自身经验选择可能具有较强的吸附展青霉素能力的菌株:两歧双歧杆 菌6071、短乳杆菌20023、鼠李糖杆菌6224、屎肠球菌21605、嗜酸乳杆菌6081、产朊假丝酵母 1769、异常汉逊酵母93161和酿酒酵母93047 (见表1)。 Γ 00451 券1社胳苗姓
[0047]以2%的接种量取-80 °C甘油贮存液中的8种菌在各自对应培养基中活化培养20h， 再以2%接种量传代两次后，离心10min(5000r/min，4°C)收集菌体，再用蒸馏水洗涤并离心 3次，121°C，15min灭菌后冷冻干燥。
[0048]分别在IOmL含有1000yg/L PAT的酸化水体系中加入0.1 g灭活菌粉，随后将其置于 20 °C恒温摇床中处理18h，摇床转速为120r/min。对照为没有添加吸附剂的PAT溶液，每个处 理设三个重复。处理结束后使用高速冷冻离心机（130(K)r/min，10min，4°C)对PAT溶液进行 离心，过滤，上清液用于检测PAT的含量。
[0049] 采用HPLC方法测定上清液中的展青霉素残留量用以评估吸附效率，通过计算，找 出其中吸附能力最强的菌株。
[0050] 5、结果与分析
[0051 ]在酸化水体系中，采用HPLC法检测8种菌对展青霉素混合溶液中展青霉素的吸附 减少量来确定菌株对展青霉素的去除能力，从而筛选出高效去除展青霉素的菌株。展青霉 素检测标准曲线如图1所示，筛选试验结果如图2所示。从图2中可以看出，在所选择的8种菌 株中，对展青霉素去除能力较强的有Candida .utilis CICC1769, Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161 和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047,其中最强的 为菌株Candida.utiIis CICC1769，在18h内，此菌株对展青霉素的去除效率达到了60%以 上；Candida utilis CICC1769的去除能力与Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161 和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047相比，对展青霉素的去除能力具有显著性 差异(Ρ<0·05)，而对展青霉素去除能力最低的菌株Lactobacillus acidophilus CICC 6081，此株菌对展青霉素几乎没有去除能力，仅为1.56%。发明人选择对展青霉素去除率最 高的Candida.utilis CICC1769，Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161 和 Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047作后续研究。
[0052]试验例2:3种优选菌株对橙汁中展青霉素去除能力的评价(1)
[0053]以2%的接种量取-80 °C甘油贮存液中的3种优选菌在各自对应培养基中活化培养 20h，再以2 %接种量传代两次后，离心I Omin (5000r/min，4 °C)收集菌体，再用蒸馏水洗涤并 离心3次，121°C，15min灭菌后冷冻干燥。分别在IOmL含有1000yg/L PAT的橙汁体系中加入 〇.2g灭活菌粉，随后将其置于10°C恒温摇床中处理10h，摇床转速为120r/min。处理结束后 使用高速冷冻离心机（13000r/min，10min，4°C)对吸附体系溶液进行离心分离，采用HPLC方 法测定上清液中的展青霉素残留量用以评估吸附效率。
[0054]在澄汁体系中，米用HPLC法检测Candida .utilis ClCC1769, Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161 和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047 3种菌对澄 汁中展青霉素的去除能力。通过展青霉素的吸附减少量来评价菌株对展青霉素的去除能 力，从而筛选出高效去除橙汁展青霉素的菌株。在10°c下，吸附去除IOh后，试验结果如图3 所示。从图3中可以看出，在所选择的3种菌株中，对展青霉素去除能力较强的是 Candida.utilis CICC1769,展青霉素去陈率可达93.4%，其次为Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161 和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047。发明人选择 对展青霉素去除率最高的Candida.utilis CICC1769作后续研究。
[0055]试验例3:3种优选菌株对橙汁中展青霉素去除能力的评价(2)
[0056] 以2 %的接种量取-80 °C甘油贮存液中的3种优选菌在各自对应培养基中活化培养 20h，再以2 %接种量传代两次后，离心I Omin (5000r/min，4 °C)收集菌体，再用蒸馏水洗涤并 离心3次，121°C，15min灭菌后冷冻干燥。分别在IOmL含有500yg/L PAT的橙汁体系中加入 O.lg灭活菌粉，随后将其置于5°C恒温摇床中处理10h，摇床转速为120r/min。处理结束后使 用高速冷冻离心机（13000r/min，IOmin，4°C)对橙汁进行离心分离，采用HPLC方法测定上清 液中的展青霉素残留量用以评估吸附效率。
[0057] 在澄汁体系中，米用HPLC法检测Candida .utilis ClCC1769, Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161 和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047 3种菌对澄 汁橙子中展青霉素的去除能力。通过展青霉素的吸附减少量来评价菌株对展青霉素的去除 能力，从而筛选出高效去除橙汁展青霉素的菌株。在5 °C下，吸附去除24h后， Candida.utilis ClCC1769对展青霉素去陈率可达97.4%，其次为Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161 和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047。发明人选择 对展青霉素去除率最高的Candida.utilis CICC1769作后续研究。
[0058] 试验例4:Candida.utilis CICC1769形态特征分析
[0059] 将最优吸附菌株Candida.utilis CICC1769接入相应液体培养基中连续活化3代 后，在固体培养基中划线分离，静置于30°C恒温培养箱中培养36-48h后，观察菌落形态，同 时挑取单菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌落形态和个体形态，结果如图4所示：
[0060] Candida.utilis CICC1769菌落形态：于30°C培养48h，在CM0181酵母菌固体培养 基上生长良好，菌落乳白色，平滑，有光泽，边缘整齐。菌落个体如图4所示，细胞形态为腊肠 形，菌体单一、成对或聚集成链存在，宽度约4μηι，长度约1 Ομπι，两端圆滑，革兰氏阳性，无鞭 毛和芽孢。
[0061 ]试验例5:Candida.utiIis CICC1769生长特性分析
[0062] 取-80°C保存的最优吸附菌株Candida.utilis CICC1769,将其在相应固体培养基 上划线培养。在30°C培养48h后，从生长良好单菌落上挑取单菌落接种到液体培养基中静置 24h，培养温度30°C。然后按2 %接种量将此活化后的试验菌株培养液接种到液体培养基中 于温度为30°C的恒温培养箱中静置培养24h，每隔2h取5mL培养液使用紫外分光光度计测 600nm下的OD值并进行平板计数，根据结果绘制菌株生长曲线，结果如图5所示。
[0063] 从图5中可以看出：〇311(1丨(^.此丨1丨8(：10：1769在010181培养基中生长速度快，在 8h左右进入对数期，20h左右进入稳定期。肉眼观察菌株Candida.utilis CICC1769在试管 中的生长情况，可以发现，约3h后，试管中的液体CM0181培养基开始变浑浊，5h后开始又沉 底沉积在试管底部，约12h后开始形成大量乳白色絮状的沉淀，这些沉淀大部分蓄积在试管 底部也有一部分附着在试管壁上，摇动试管未发现气泡产生。
【主权项】
1. 一种利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下 步骤： (1) 将酵母菌接种液体培养基中培养，所述的酵母菌选自产朊假丝酵母（Candida utilis)CICC1769、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)CCTCC AY 93161 和异常汉逊酵 母（Hansenula anomala var.anomala)CCTCC AY 93047中的一种或两种以上，至细胞数达 到0.5X1010 ~2.0X1010CFU/mL，然后在 1-5°C 下 3000-5000r/min 离心 10-30min，离心得到 的菌泥用蒸馏水洗涤1~3次； (2) 将菌泥以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在-22~-18°C下的预冷8-16h，之后再将预冷 的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为-56~-52°C，真空度4-6mtorr，时间20-30h，冷冻干燥完成之后，即得到失活微生物菌粉； (3) 将失活微生物菌粉加入柑橘汁中，置于4-10°C温度下震荡或搅拌处理10~24h，处 理结束后进行离心，过滤，得去除展青霉素的柑橘汁。2. 根据权利要求1所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步 骤（2)的技术参数为：预冷温度-20°C，预冷时间12h，冷冻温度-54°C，真空度5mtorr，时间 26h〇3. 根据权利要求1所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步 骤(3)中失活微生物菌粉的用量与柑橘汁中展青霉素的质量比为2000~10000:1。4. 根据权利要求1-3任一项所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特 征在于，所述的酵母菌为产肮假丝酵母(Candida util is) CICC1769。5. 根据权利要求1-3任一项所述利用失活微生物去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特 征在于，所述的柑橘汁为橙汁。6. 失活微生物在制备柑橘汁中展青霉素吸附剂中的应用，所述的失活微生物选自失活 的产H元假丝酵母（Candida utilis)CICC1769、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) CCTCC AY 93161 和异常汉逊酵母(Hansenula anomala var.anomala)CCTCC AY 93047中的 一种或两种以上。7. 失活微生物在制备柑橘汁中展青霉素吸附剂中的应用，所述的失活微生物选自失活 的产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的柑橘汁为橙汁。
【文档编号】A23L2/84GK105961997SQ201610383233
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】彭帮柱, 潘思轶, 薛淑静, 关键, 胡昊
【申请人】华中农业大学