专利名称：中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法
技术领域：
本发明是一种中国人共刺激信号抑制因子，即细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的基因工程表达蛋白的制备方法及其用途。
共刺激信号抑制因子是主要表达于成熟T细胞表面的蛋白分子，与T细胞参与的免疫应答负调控有关，在国际上正在被广泛地重视，共刺激信号抑制因子不久将被用作免疫耐受剂来治疗某些自身免疫疾病及对付器官移植中的排斥现象等。要对共刺激信号抑制因子进行进一步的功能和应用研究，首先需要得到共刺激信号抑制因子基因资料，目前有关共刺激信号抑制因子的分子生物学资料多为外国人适用，况且均是融合蛋白。中国人共刺激信号抑制因子目前尚无研究报道，不利于适合中国人在该领域的基因工程产品的应用。
本发明的目的是分离中国人共刺激信号抑制因子的DNA序列。
本发明的目的是研制一种适合中国人的天然的共刺激信号抑制因子的基因工程产品及其制备方法。
中国人共刺激信号抑制因子(即细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、或CTLA4、或淋细平)，主要表达于成熟T细胞表面的蛋白分子，与T细胞参与的免疫应负调控有关。T细胞的应答、活化同时需要两种信号，其中第一信号是抗原特异性的，它由T细胞表面的抗原受体(TCR)和抗原递呈细胞(APC)上的主要组织相容性复合物(MHC)分子与抗原的复合物相互作用所提供，第二信号是非抗原依赖性的“共刺激信号”(Costimulatary signal)，它由T细胞表面的CD28和抗原递呈细胞表面的B7二个分子的相互作用所提供。CTL-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4，Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4)是CD28的同源分子，它主要表达在成熟T细胞的表面。CTLA-4基因有4个外显子，其中第一外显子为前导序列，第二外显子编码膜外功能片段，又称V区(V domain)，是B7分子的配体，第三外显子为穿膜区，第四外显子是胞浆内区。CTLA-4与CD28作用不同的是，CD28对于T细胞的活化具有正调控作用，而CTLA-4对于T细胞的活化具有负调控作用。当缺乏CTLA-4时会导致淋巴细胞的增殖紊乱，出现类似于自身免疫病的症状。本发明分离了中国人共刺激信号抑制因子，用现有的白细胞DNA抽提方法，DNA测序仪为Applied Biosystems Model 373A Version 1.2.0，引物设计与合成根据国外发表的人CTLA-4基因序列，在其V区两侧设计3个寡核苷酸引物上游引物CTL15’ATGCACGTGG CCCA GCCTGCTGT3’下游引物CTL2a5’AATTACATAAATCTGGGTTCCGTTGCC 3’和CTL2b5’AATTACATAAATCTGGGTTCCGCTGCC3’引物由加拿大SANGON生物工程公司合成。扩增时，以人基因组DNA为模板，扩增CTLA-4的V区。PCR反应体系常规，PCR循环参数为94℃ 1min，66℃ 1min，72℃ 1.5min，35个循环。以1.8％琼脂糖电泳对PCR产物进行初步鉴定，然后对PCR产物电泳分离条带进行切胶纯化，用Applied Biosystems Model 373A测序仪分析序列。
图1序列中Hu1和Hu2是已发表的人CTL-4基因序列，Mouse是小鼠CTL-4基因序列，Hu(Chinese)是中国人CTL-4基因序列。
经对PCR产物进行DNA序列分析，确证PCR产物是CTLA-4的第二外显子，并且发现中国人群的序列有两处与国外报道的不一致，其中第54位密码子处中国人为ATG(甲硫氨酸)，而现有报道为ACG(丝氨酸)，第110位密码子处中国人为ACC(苏氨酸)，而现有报道为GCC(丙氨酸)，推测在不同人群中存在着等位基因差异性。本发明取5ul PCR产物加入8ul电泳上样液(含0.05％溴酚兰，0.05％二甲苯青FF，96％甲酰胺，20mmol/LEDTA)，并2ulTE(pH8.0)加热至97℃变性10min后立即置0℃冰水浴中，用12％聚丙烯酰胺变性凝胶(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺比例为49∶1，5％甘油，0.5×TBE)电泳，250V 4℃电泳3h。将凝胶置37℃固定液(10％乙醇，0.5％冰乙酸)中浸泡10min用双蒸水洗4次，再浸泡于银染液(0.2％硝酸银)中7min，再用双蒸水洗4次后置显色液(1.5％氢氧化钠，0.4％甲醛)中显色观察结果，完成SSCP分析。分析结果未发现有多态性，与已测序的PCR-SSCP电泳格局完全一致，说明该基因非常保守。分子具有重要的生物学功能。
本发明分离了中国人共刺激信号抑制因子的基因，并且对中国人基因密码子的DNA进行改造，选择采用宿主优势密码子，在设计上游引物时将部分位点的密码子改为宿主的最适密码子。
真核酵母用克隆引物有Y1.1E；Y1.2Tapa；Y1.3Apa；Y2.1cla；Y2.2Txba；Y2.3Xba用于在真核中表达，引物中已对中国人基因密码子的DNA进行改造，选择采用在宿主(真核酵母)中优势密码子，上游引物中前6个密码子被改造为宿主的最适密码子G9→T，C12→T，G15→A，T18→A。引物并含有EcoRI和ApaI克隆用接头。上游引物特征’EcoRI-ATG---G9→T，C12→T，G15→A，T18→A----；’下游引物特征(反意)’------TAA-ApaI’。
原核大肠杆菌克隆引物有PCTL1PN；PCTL2B；PCTL2H；CTL2；PBV-CTL1；PXE-CTL2，用于在原核中表达，引物中已对中国人基因密码子的DNA进行改造，选择采用在宿主(原核)中优势密码子，上游引物中前6个密码子被改造为宿主的最适密码子G9→T，C12→T，T18→G。引物并含有XhoI，EcoRI，NdeI和BamHI克隆用接头。上游引物特征(1)5’-XhoI-EcoRI-ATG--G9→T，C12→T，T18→G--3’；(2)5’-NdeI-ATG-T9-T12-T18-T24-T27----------3’。下游引物特征(反意)(1)5’---------TGA-EcoRI-XhoI 3’；(2)5’-------------TAA-BamHI 3’。
本发明转化用质粒的构建是以相同内切酶水解质粒和目的基因，纯化后以连接酶连接构建转化用质粒pPICLA，pPBCTLA，pETCTLA，具体结构见图2，3，4。图5、6质粒上游引物特征5’-XhoI-EcoRI-ATG--G9→T，C12→T，T18→G--3’；下游引物特征(反意)5’--------------TGA-’EcoRI-XhoI 3’。图2质粒上游引物特征5’-NdeI-ATG-T9-T12-T18-T24-T27---------3’；下游引物特征(反意)5’------------------TAA-BamHI 3’。
将已构建的载体PPICLA，PETCTLA，PPBCTLA转化至宿主菌，经培养，并以PCR扩增鉴定相应的菌株，获得了阳性转化克隆。
上述构建的质粒载体可以在真核中表达，如酵母，X33，GS115，Km71等。
上述构建的质粒载体可以在原核中表达，如大肠杆菌，BL21，DH5α等。
上述构建的质粒载体在酵母中表达更好。
上述构建的质粒载体在大肠杆菌中表达更好。
上述构建的质粒载体在大肠杆菌中能增殖。
上述构建的质粒载体在在酵母中能增殖。增殖的质粒用作基因探针，检测效果良好。
本发明构建的质粒表达的蛋白具有中国人共刺激信号抑制因子基因的相同功能。
以上述已构建的载体转化相应的菌株，培养并提取质粒，以相应的內切酶水解，电泳鉴定，结果从相应的阳性转化克隆中获得了与导入的目的基因一致的DNA片段。
本发明对上述阳性转化克隆进行诱导表达，以含空白质粒的受体菌作为对照，经过SDS-PAGE之后，用考马斯亮蓝染色并观察结果，发现其中多个样品有一个条带在空白对照中未见到，参照标准低分子量蛋白条带的位置可以看出该条带略小于13,700D(RNA酶条带)，这与理论预期值的11,400相符，所以这条新的条带应该就是所克隆的目的基因的表达产物，见图9，经过电脑分子生物学图象分析系统(BCA)对表达产物分析分子量分析与理论预期值相符，见图10，阳性克隆中目基因的蛋白表达量可达5％，表达量为5.4-28.0mg/L目的蛋白产物，见图11。
本发明克隆、表达了中国人共刺激信号抑制因子基因编码的天然蛋白分子，使该蛋白可以生产，是一种很有前途的生物工程免疫耐受诱导药物，可用于各种自身免疫性疾病治疗，还可用于各种动物和人的各种器官移植后排异反应以及用于各种过敏性疾病的治疗和预防，并可作为抗原用于免疫各种动物以制备抗体用于科研和临床的相关基因分析探针用作检测分析。
本发明分离了中国人基因共刺激信号抑制因子DNA基因，用基因工程技术采用宿主优势密码子，构建天然蛋白表达载体系列，并且克隆表达，获得含有中国人基因共刺激信号抑制因子的阳性菌株。与国外含共刺激信号抑制因子融合蛋白相比，它更适合于中国人，并且成本大大降低。该基因工程产物用于免疫疾病的治疗，不仅有科学价值，还有广阔的市场前景。
图1是中国人CTLA-4第二外显子PCR产物的电泳结果图。
图2是中国人共刺激抑制因子CTLA-4第二外显子PCR-SSCP的分析结果图。
图3是DNA自动分析仪对中国人CTLA-4基因测序结果图。
图4是中国人共刺激信号抑制因子测序图。
图5是本发明构建质粒pPICLA图。
图6是本发明构建质粒pPBCTLA图。
图7是本发明构建质粒pETCTLA图。
图8是含目的基因重组质粒pPICLA，pPBCTLA，pETCTLA转化宿主菌后的PCR鉴定图。
图9是质粒pPBCTLA转化宿主菌后质粒DNA酶切鉴定图。
图10是转化子经诱导后的SDS-PAGE结果图。
实施例1以人工合成的特异性引物对中国人白细胞DNA的CTLA-4基因进行体外扩增，将扩增产物进行1.5％琼脂糖电泳，切胶纯化所要目的基因DNA片段，以0.3M醋酸钠(pH5.3)和80％乙醇沉淀目的基因DNA片段，用相应内切酶水解，与载体连接构建成pPICLA质粒，并在4℃和0.1M CaCl2存在情况下转化KM71及X33菌株，以MGYH培养基在30℃培养，培养至OD600＝2-6，离心分离细胞重悬于100倍的AIGYH中，培养至OD600＝2-6，每天加入甲醇至终浓度达0.5％，培养1-5天，离心收集细胞，破碎细胞，以2M尿素洗涤，离心沉淀，再以8M尿素溶解沉淀，PBS透析，聚乙二醇浓缩，进一步以8％PAGE(pH8.8)纯化和HPLC纯化，收集目的蛋白，经Western blot鉴定及MLR抑制试验和抗原特异性LTT抑制试验作活性测定。
实施例2以人工合成的特异性引物对中国人白细胞DNA的CTLA-4基因进行体外扩增，将扩增产物进行1.5％琼脂糖电泳，切胶纯化所要目的基因DNA片段，以0.3M醋酸钠(pH5.3)和80％乙醇沉淀目的基因DNA片段，用相应内切酶水解与载体连接构建成pPBCTLA质粒，在4℃和0.1M CaCl2存在情况下，转感受态DH 5α菌，转化阳性菌在LB培养基中于30℃培养至OD600＝0.5，迅速转至42离℃培养4hr，离心收集菌体，常规方法破菌，离心分离包涵体，以2M尿素洗涤离心测定，再以8M尿素溶解沉淀，PBS透析，聚乙二醇浓缩后，以8％PAGE(pH8.8)纯化或HPLC纯化，收集目的蛋白，经Western blot进行分子鉴定和MLR抑制试验及抗原特异性LTT抑制试验作活性测定。
权利要求
1.一种中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，通过基因分离、克隆、表达过程，其特征是分离中国人共刺激信号抑制因子基因并测序(图4)，设计克隆引物(图5、6、7)，构建转化质pPICLA、pPBCTLA、pETCTLA，转化宿主菌。
2.根据权利要求1所述的中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，其特征是上述质粒在真核中表达。
3.根据权利要求2所述的中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，其特征是上述质粒在真核酵母中表达。
4.根据权利要求1所述的中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，其特征是上述质粒在原核中表达。
5.根据权利要求4所述的中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，其特征是上述质粒在原核大肠杆菌中表达。
6.一种大肠杆菌中增殖的如权利要求1所述的质粒。
7.一种酵母菌中增殖的如权利要求1所述的质粒。
8.一种含有权利要求1所述质粒的菌株。
9.一种含有权利要求1所述质粒的蛋白。
10.根据权利要求1所述的中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，其特征是该基因工程产品用作免疫抑制剂。
11.根据权利要求1所述的中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，其特征是该基因工程产品用作免疫耐受诱导剂。
12.根据权利要求1所述的中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法，其特征是该基因工程产品用作相关基因分析探针。
全文摘要
一种中国人共刺激信号抑制因子的基因工程制备方法。目前有关共刺激信号抑制因子的生物学研究仅适合外国人,且是非自然产品。本发明分离了中国人共刺激信号抑制因子基因,对中国人基因密码子的DNA进行改造,采用宿主优势密码子,构建天然蛋白表达载体系列,适合在真核生物和原核生物中表达。经鉴定,上述表达产物具有中国人共刺激信号抑制因子基因的阳性菌株。该天然蛋白分子能大量生产,是一种前景广阔的生物工程免疫耐受剂。
文档编号A61P37/00GK1268563SQ00115408
公开日2000年10月4日 申请日期2000年4月18日 优先权日2000年4月18日
发明者朱乃硕 申请人:复旦大学