专利名称：ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统筛选抗心血管病药的方法
技术领域：
本发明涉及细胞靶标筛药系统筛选药物方法，具体涉及ApoAI的ELISA测定方法及ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统筛选第三代升HDL抗动脉粥样硬化心血管病药的方法。
ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统是筛选新一代抗动脉粥样硬化心脑血管病升高密度脂蛋白(HDL)药中的核心技术工具，包括筛药用细胞株的选择，细胞培养系统，ApoAI ELISA测定方法和高通量筛药方法等部分。我们已建立的筛选抗动脉粥样硬化升HDL药系统是根据动脉粥样硬化心脑血管疾病的发病机理，找出并以控制该疾病发生，发展和治疗的关键蛋白ApoAI为靶标，选择以与ApoAI产生和代谢密切有关的细胞株HepG2为筛选细胞株，建立测定灵敏度高，测定浓度范围大，操作简单，便宜的ApoAI ELISA间接测定法。再以ApoAI ELISA测定法为主体，建立高通量升HDL药筛药方法。通过测定被筛选化合物激发细胞产生ApoAI蛋白的程度来筛选新一代抗动脉粥样硬化升HDL药。
动脉粥样硬化心脑血管疾病(如冠心病，中风)是中国和西方国家致死疾病中的主要杀手。其主要病因是高血清总胆固醇(Gordon et al.1981；Stamleret al.1986；Pooling Project Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病学调查揭示，血清总胆固醇每增加1％，冠心病危险因素增加2％(NCEPR1991)。临床研究发现，降低血清胆固醇水平可以减少冠心病的发病率，阻滞动脉粥样硬化的发展(LPCP 1984；Frick 1987)。胆固醇不溶于水，不能在血液里转运。它们必需与脂蛋白结合才能在血液里运转。人血液里有四种脂蛋白负责胆固醇的运载。它们是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的总胆固醇由LDL运载。LDL携带内源或外源胆固醇，穿过血管壁，进入内皮下(subendothelium)。在内皮下，LDL胆固醇被氧化成氧化型LDL胆固醇，并通过清道夫受体被巨噬细胞以胆固醇酯的形式在细胞内积聚。大量胆固醇酯积聚在巨噬细胞内形成了泡沫细胞。积聚了大量胆固醇酯的泡沫细胞沉积在血管内皮下，形成了动脉粥样硬化斑块核心。资料表明，由LDL运载的胆固醇是导致动脉粥样硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL胆固醇被称为坏胆固醇。胆固醇引起的动脉粥样硬化不但是冠心病的主要根源，同时也是脑血管疾病，如脑血栓形成，中风的重要病因。此外人脑细胞内积聚的高胆固醇酯还可能和老年性痴呆症的形成有关。体内胆固醇来源有内源和外源。外源胆固醇来自于饮食，内源胆固醇是自体合成的结果。内源胆固醇合成亢进和家族性高胆固醇血症在西方国家较为普遍。这种疾病必须通过药物控制。在美国，40％以上的成年人的LDL胆固醇(坏胆固醇)含量超过正常水平。由于胆固醇在形成心脑血管疾病中的重要作用，近十多年来，美国及欧洲药厂都把其抗动脉粥样硬化药的研究和开发放到降低血清总胆固醇及LDL胆固醇上。这些药中疗效最显著的有Merck药厂的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。这些药的作用机理都是抑制人体胆固醇合成的关键酶HMG-CoA-还原酶。虽然HMG-CoA-还原酶抑制药能显著的降低血清总胆固醇，防止、阻止及降低动脉粥样硬化和冠心病发病，发展和死亡，但它只能减少内源性胆固醇合成及降低家族性高胆固醇血症引起的冠心病的发展或恶化。对于治疗外源性胆固醇增多引起的动脉粥样硬化，对于消除已进入巨噬细胞内的胆固醇和抑制由此导致的动脉粥样硬化形成，对于去除动脉粥样硬化斑块中积聚的胆固醇，使动脉粥样硬化血管回复正常，则作用不大或无能为力。换句话说，目前欧美市场流行的抑制内源性胆固醇生成药物不能从根本上治疗广义的动脉粥样硬化心脑血管疾病。
医学研究证明，巨噬细胞吞噬和积聚胆固醇，转换成泡沫细胞，沉积在血管壁内皮下是动脉粥样硬化斑块形成的基础。清除积聚在血管壁巨噬细胞/泡沫细胞内的胆固醇，将其转运到肝脏分解，是治疗单纯降血清胆固醇所不能达到的，根治动脉粥样硬化心脑血管疾病的最新的有效手段，清除巨噬细胞/泡沫细胞及动脉粥样硬化斑块内胆固醇的唯一的有效武器是HDL。近年来，西方心血管疾病研究人员及制药公司开始把研究方向放到新一类抗动脉粥样硬化药，升高密度脂蛋白(HDL)药上来。高密度脂蛋白(HDL)是一重要的胆固醇载体，它在运载胆固醇方面的功能与LDL截然相反。HDL可以刺激血管内皮下巨噬细胞内胆固醇酯水解，并将水解的非酯化胆固醇从巨噬细胞内转运至肝脏分解。更为重要的是，HDL能刺激沉积于血管壁和血管壁动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞/泡沫细胞内胆固醇酯水解。非酯化胆固醇被HDL从泡沫细胞转运至肝脏分解(Alan et al.1996)。从而去除了动脉粥样硬化赖以形成的基础。所以HDL的重要功能被称为胆固醇逆相转运(Reverse Cholesterol Transportation)。胆固醇逆相转运的结果是①抑制胆固醇酯在巨噬细胞内累积，阻止其转化为泡沫细胞，从而防止了动脉粥样硬化的形成；②因为HDL具有独特的转运动脉粥样硬化斑块内泡沫细胞里胆固醇至肝脏分解的作用，从而使动脉粥样硬化血管壁逐步回复正常。HDL的此二项功能一直是西方医学界在治疗动脉粥样硬化病中梦寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬细胞吞噬，产生泡沫细胞。HDL还可以刺激内皮细胞释放前列环素(PI)增加胆固醇酯水解和胆固醇转运出细胞。HDL的作用对象不分内源或外源胆固醇。基础及临床研究证实，每增加1mg/dl HDL胆固醇，冠心病死亡危险即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血浆HDL是比高血浆胆固醇更重要的致动脉粥样硬化及冠心病的危险因子(Alan et al.1996)。
提高血浆HDL含量的机理是什么呢？简单地说是激活合成HDL活性成份的有关基因及HDL合成过程中有关酶的基因，使其表达和合成HDL，同时抑制不利HDL合成的因素的活性。与HDL合成及其转运胆固醇功能密切有关的活性成份和酶有载脂蛋白A-I(ApoAI)，卵磷脂乙酰胆固醇转移酶(LCAT)，脂蛋白脂酶(LPL)，胆固醇酯转移蛋白(CETP)，载脂蛋白C-III(apoC-III)。ApoAI的主要功能是①组成HDL最重要的结构成份(Chapman etal.1980；Sastry et al.1988)；②激活HDL合成关键酶，LCAT(Fielding et al.1972；Soutar et al.1975)；③促进细胞内胆固醇外流(Glomset et al.1968；Scampfer et al.1991)。从人ApoAI流动率和灵长类HDL水平的研究认为，ApoAI的合成速率决定了血浆HDL水平(Schaefer et al.1978，1982；Sorci-Thomas et al.1988)。LPL的功能是催化血浆VLDL和乳糜微粒脂解，产生胆固醇和磷脂供合成HDL的关键酶LCAT合成HDL的中心成份，胆固醇酯所用。apo C-III会抑制LPL活力，导致HDL合成原料馈乏。而CETP则催化胆固醇酯从HDL转移到VLDL，并将三酸甘油酯从VLDL转至HDL，使HDL分解，同时导致ApoAI在转移中流失。apo C-III和CETP是HDL合成中的二个负性因子，所以要提高血浆HDL含量，必需升高①ApoAI，②激活LPL和③LCAT，④减少apo C-III和⑤抑制CETP活力。以上五项因素中，最重要一项是ApoAI水平。
流行病和转基因动物实验研究结果证实，血浆ApoAI可以抑制动脉粥样硬化的形成和发展(Castelli et al.1977；Rutin et al.1991)。ApoAI含量降低，动脉粥样硬化发病率升高(Castelli et al.1986；Rutin et al.1991)。升高ApoAI本身对消除动脉粥样硬化斑块，治疗动脉粥样硬化作用显著。所以ApoAI成为一个重要的筛药靶标。
本发明目的是提供了建立一种全新的ApoAI ELISA测定方法。
本发明的另一目的是提供ApoAI ELISA细胞靶标筛药系统筛选第三代升HDL抗动脉粥样硬化心血管病药的方法。
待测抗原(ApoAI)与过量抗体混合孵育，反应平衡时抗体以两种形式存在抗原-抗体复合物及游离抗体；将此平衡混合物加入预先经抗原包被的酶标板中，混合物中的游离抗体被板上的抗原捕获，抗原-抗体复合物则经洗板除去；最后加入辣根过氧化物酶底物，经显色反应检测板上抗体的浓度，由此可推知待测抗原浓度。
HrpAb2+Ab+Ag→HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab↓进板HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓洗板HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓底物(OPD)酶标仪492nm检测HrpAb2—辣根过氧化物酶标记二抗Ab —一抗Ag —抗原Plate —酶标板步骤1)抗原包板ApoAI稀释至200ng/ml，加入Nunc酶标板中，每孔50μl，置湿盒中，包板条件为37℃ 2小时或4℃ 16小时，蒸馏水洗板3次，每孔加入封闭液100μl，室温放置1小时以上，用前再洗板3次。
2)孵育在普通96孔板中，混合一抗，二抗和待测培液或标准标准浓度配制ApoAI等比梯度稀释，最终浓度为400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.12ng/ml；抗体稀释一抗1∶50000，二抗1∶20000；空白孔100μl缓冲液；最大结合孔50μl抗体混合液，50μl缓冲液；标准/样品孔每孔加入抗体混合液50μl，ApoAI标准或待测培液50μl；振荡混匀，37℃ 2小时或4℃ 16小时孵育以上。
3)抗体捕获将96孔板中的孵育液转移至包被好的Nunc酶标板中，室温反应30分钟，其间缓缓摇动。
4)检测以蒸馏水洗板3次，每孔加入100μl新配制的底物显色液，避光放应30分钟，加入25μl终止液终止反应，与酶标仪波长492nm处测定吸光值。
数据处理1)标准曲线(见
图1)标准浓度读数减去空白值后，按以下公式计算x=lnB/Bmax1-B/Bmax]]>B-标准浓度吸光值Bmax-最大结合吸光值y＝lg CONCCONC标准浓度(ng/ml)Y对X作线性回归，标准曲线如图1。
回归方程y＝-0.478x+1.628(R2＝0.9964)(注实验条件变化时，斜率和截距会有变化)2)样品浓度计算样品读数与标准作同样处理，根据以上回归方程计算样品中ApoAI抗原浓度。
以下罗列了本发明与目前正在使用的ELISA法测定ApoAI的方法比较及其优势分析。
1.双抗夹心法双抗夹心法以其灵敏度高(可达10-12g)(Anderson N，Chalatow KM，Castelli WP，Levy DL.(1987)Zentralbl Allg Pathol Pathol Anat 241-9.及Chiba H，Mitamura T，Matsuno K，and Kobayashi K，A sensitive sandwichenzyme-linked immunosorgent assay of rat apoliprotein A-1.Biochem MedMetabol Biol，1991；46380-390)而被广泛使用，主要过程为抗体包板→加入待测液，待测抗原与包被抗体结合→加入第二种酶标抗体，形成夹心复合物→加入酶底物检测此法要求使用两种不同的抗体，成本较高。在测定如ApoAI这样的小分子量蛋白时(28kD)，双抗夹心法对两种抗体抗原识别簇(epitope)的空间位置有较严格的要求，二者之间必须有足够的空间距离，否则由于位阻效应无法得到结果。另外，双抗夹心法线性范围较小，一般不超过一个数量级。
2.直接竞争法直接竞争法简单快速，应用也较广泛，主要过程为抗原包板→待测液与标记抗体同时加入→板上包被抗原与待测液中游离抗原竞争标记抗体→平衡后，洗板除去未结合抗原→加入酶底物检测此法使用的酶标抗体需根据不同抗原分别标记，制备成本高。此外，直接竞争法灵敏度不高，线性范围一般也只有一个数量级(10-100ng)(Gaver A，Weedy NK，Maldonado BR et al，Procedure for developmet of an enzyme-linkedimmunosorbent assay.Development of an assay for human apolipoprotein AI.Clinica Chimica Acta，1992；20823-27及Galban B，Macri J and Adeli K，Anamplified enzyme-linked immunosorbent assay for rapid and sensitivedetermination of apolipoprotein AI in plasma and tissue culture media.Ann ClinBiochem，1993；30404-406)。
3.相比之下，本方法有如下优点(1)成本低。只使用一种一抗，且一抗不需标记；酶标二抗相对价格低廉，容易制备。大规模、高通量筛选时成本降低显著。
(2)灵敏度高。本方法引入放射免疫法中的数学模型，改善了标准曲线低浓度区域的先行，灵敏度达3ng，最低可至1.5ng，比常规直接竞争法高3倍以上。
(3)线性范围大。标准曲线从3ng到400ng都有很好的线性(R2＝0.996)，适于进行高通量药物筛选等样品浓度变化较大的工作。
ApoAI细胞靶标用于药物筛选方法(1)取5×104HepG2细胞(ATCC公司)接种于48孔培养板中，每孔含0.5ml成分为10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的MEM培液，于37℃，5％CO2细胞培养条件下培养24小时。
(2)加被筛选物质(不同来源的化合物或混合物溶于DMSO中)于细胞培养液内和细胞共同培养60小时。
(3)取50μl培养液测定ApoAI含量。测定方法见上述间接竞争ELISA法测定细胞培液中ApoAI浓度。
(4)中选化合物的选择通过与40μg/ml Gemfibrozil培养后产生ApoAI量进行比较来达到。被筛化合物所激发ApoAI蛋白产生超过Gemfibrozil激发产生量的50％以上者则为中选化合物。
应用ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统筛选抗动脉粥样硬化升HDL的药物。
本发明的ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统可用于筛选单个或复合的合成化合物，可用于筛选植物提取的单个化合物或混合物及可用于筛选各种微生物代谢产物中的升高ApoAI的物质，最终用于筛选升HDL药之目的。
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
图1是ApoAI标准曲线图。
图2是已知ApoAI激发剂Gemfibrozil激发HepG2细胞产生ApoAI蛋白图。
图3是已知ApoAI激发剂Finofibrate激发HepG2细胞产生ApoAI蛋白图。
实施例1材料与试剂(1)Ultra Pure Human Apolipoprotein AI蛋白，(Cat #11P-UP108，AcademyBio-Medical Company，Inc.)(2)Goat anti-human ApoAI，(Cat.#11A-G2-2b，Academy Bio-MedicalCompany，Inc.)(3)Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)，(Cat.#305-035-003，Jackson ImmunoResearch)
(4)96-well Nunc-ImmunoTMPlates，MaxiSorpTM，(Cat.#439454，NalgeNunc International)(5)普通96孔板(6)邻苯二胺(O-Phenylenedimine，OPD)(7)牛血清白蛋白(BSA)(8)抗体稀释和封闭缓冲液10mM磷酸盐缓冲液，含1％(w/v)BSA，pH7.4；(9)底物缓冲液0.1mol/L柠檬酸，0.2mol/LNa2HPO4，用前每100ml加入30％ H2O20.15ml，OPD 60mg。
(10)显色终止液2mol/L H2SO4。
(11)自动洗板机Wellwash Ascent，Labsystem，Finland(12)酶标仪318-Microplate Reader，SANCO，Shanghai，China1)5×104HepG2细胞(ATCC公司)接种于48孔培养板中，每孔含0.5ml成分为10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的MEM培液，于37℃，5％CO2细胞培养条件下培养24小时。
2)不同浓度的已知ApoAI激发剂Gemfibrozil和Fenofibrate溶于DMSO中，于细胞培养液内和细胞共同培养60小时。
3)取50μl培养液测定ApoAI含量。测定方法见上述间接竞争ELISA法测定细胞培液中ApoAI浓度。
4)测定结果见图2和3。表1、ApoAI回收率表1
组1细胞培液组2样品组1加入5μl 200ng/ml ApoAI纯品
权利要求
1.一种酶联免疫法(ELISA)，是间接竞争酶联免疫法测定ApoAI待测抗原ApoAI与过量抗体混合孵育，反应平衡时抗体以抗原-抗体复合物及游离抗体两种形式存在；将此平衡混合物加入预先经抗原包被的酶标板中，混合物中的游离抗体被板上的抗原捕获，抗原-抗体复合物则经洗板除去；最后加入辣根过氧化物酶底物，经显色反应检测板上抗体的浓度，由此可推知待测抗原浓度，HrpAb2+Ab+Ag→HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab↓进板HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓洗板HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓底物(OPD)酶标仪492nm检测HrpAb2—辣根过氧化物酶标记二抗Ab —一抗Ag —抗原Plate —酶标板。
2.根据权利要求1的酶联免疫法，具体方法如下1)抗原包板ApoAI稀释至200ng/ml，加入酶标板中，每孔50μl，置湿盒中，包板条件为37℃ 2小时或4℃ 16小时，蒸馏水洗板，每孔加入封闭液100μl，室温放置1小时以上，用前再洗板；2)孵育在普通96孔板中，混合一抗，二抗和待测培液或标准标准浓度配制ApoAI等比梯度稀释；抗体稀释一抗1∶50000，二抗1∶20000；空白孔100μl缓冲液；最大结合孔50μl抗体混合液，50μl缓冲液；标准/样品孔每孔加入抗体混合液50μl，ApoAI标准或待测培液50μl；振荡混匀，37℃ 2小时或4℃ 16小时孵育以上；3)抗体捕获将96孔板中的孵育液转移至包被好的酶标板中，室温反应30分钟，其间缓缓摇动；5)检测以蒸馏水洗板，每孔加入100μl新配制的底物显色液，避光放应30分钟，加入25μl终止液终止反应，与酶标仪波长492nm处测定吸光值。
3.根据权利要求1的酶联免疫法，其中检测后按以下公式分析计算(1)标准曲线标准浓度读数减去空白值后，按以下公式计算x=lnB/Bmax1-B/Bmax]]>B-标准浓度吸光值 Bmax-最大结合吸光值y＝lg CONCCONC 标准浓度(ng/ml)Y对X作线性回归，回归方程y＝-0.478x+1.628(R2＝0.9964)2)样品浓度计算样品读数与标准作同样处理，根据以上回归方程计算样品中ApoAI抗原浓度。
4.ApoAI细胞靶标ELISA筛药系统筛选药物的方法，(1)HepG2细胞接种培养，选择以与ApoAI产生和代谢密切有关的细胞株HepG2为供筛选细胞株；(2)溶于DMSO中的被筛选物质加于细胞培养液内和细胞共同培养60小时；(3)取50μl培养液测定ApoAI含量。按权利要求1至3之一的方法测定细胞培液中ApoAI浓度；(4)被筛化合物所激发ApoAI蛋白产生超过Gemfibrozil激发产生量的50％以上者则为中选化合物。
5.根据权利要求4的方法，其中被筛物质为单个或复合的合成化合物，植物提取的单个化合物或混合物及各种微生物代谢产物中的升高ApoAI的物质。
6.根据权利要求4或5的方法筛选升HDL药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种ApoAI ELISA间接测定法,该方法灵敏度高,测定浓度范围大,操作简单,便宜的ApoAI ELISA间接测定法。以该ApoAI ELISA测定法为主体,建立高通量升HDL药筛药系统。通过测定被筛选化合物激发细胞产生ApoAI蛋白的程度来筛选新一代升HDL抗动脉粥样硬化药。
文档编号A61P9/10GK1366182SQ0110523
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月17日 优先权日2001年1月17日
发明者龚邦强 申请人:龚邦强