专利名称：肽脱甲酰基酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的抗菌化合物的用途，以及含有作为肽脱甲酰基酶抑制剂的这些化合物的药物组合物。
背景技术：
细菌引发物甲硫氨酰tRNA可以被甲硫氨酰tRNA转甲酰基酶(FMT)修饰，产生甲酰基-甲硫氨酰tRNA。然后将甲酰基甲硫氨酸(f-met)结合到新合成的多肽的N-末端。然后，多肽脱甲酰基酶(PDF或Def)将初级转移产物脱甲酰基化，生成N-甲硫氨酰基多肽。大多数的细胞内蛋白质被甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)进一步处理，产生成熟的肽和游离的甲硫氨酸，所述游离的甲硫氨酸是可循环的。PDF和MAP都是细菌生长必需的，而PDF是MAP活性所需的。该反应系列称为甲硫氨酸循环(
图1)。 图1.甲硫氨酸循环迄今为止，在细菌中、在含叶绿体的植物中、在小鼠和人体中已发现多肽脱甲酰基酶的同源基因。植物蛋白是核编码，但显示携带有叶绿体定位信号。这与观察到的叶绿体RNA和蛋白质合成过程与真细菌的合成过程高度相似是一致的。迄今为止，尚没有任何信息证明哺乳动物PDF基因同系物的蛋白质表达或这种蛋白质的功能性作用(Meinnel T.2000，ParasitologyToday，16(4)，165-168)。
在所有真细菌中都发现了多肽脱甲酰基酶，而且其对于高覆盖基因组序列信息是有效的。PDF同源物中的序列差异很大，在较远的相关序列中仅仅20％一致。但是，活性位点周围的保留很高，有几个完全保留的残基，包括配位活性位点金属所需的一个半胱苷酸和两个组氨酸(Meinnel，T.等，1997，Journal of Molecular Biology，267,749-761)。
PDF被认为是有吸引力的抗细菌靶，因为已经证明这种酶是细菌体外生长所必需的(Mazel，D.等，EMBO J.13(4)，914-923，1994)，但不参与真核细胞的蛋白质合成(Rajagopalan等，J.Am.Chem.Soc.119，12418-12419，1997)，并且在原核生物中普遍存在(Kozak，M.Microbiol.Rev.47，1-45，1983)。所以，PDF抑制剂可能作为广谱抗菌剂。
发明概述本发明涉及下式(I)所示的新颖抗菌化合物，及其作为PDF抑制剂的用途。
本发明进一步提供了在动物，包括人体中抑制PDF的方法，包括按照下文所说明的，向需要治疗的受治疗者给药有效量的式(I)化合物。
发明的详细说明用于本发明方法的化合物选自下式(I) 其中X＝O；Ar1是任选取代的苯基，其中所述取代基分别是一个、两个或三个选自下列的取代基任选取代的1到9个碳原子的烷基或环烷基、卤素、1到9个碳原子的烷氧基、羟基、1到9个碳原子的羟烷基、烷氧基烷基，其中烷基和亚烷基分别具有1到9个碳原子；
Y选自共价键、氧、2到4个碳原子的亚烷基、2个碳原子的亚烯基、2个碳原子的亚炔基、S(O)p、C(O)、其中p是0-2。
Ar2是选自苯基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、噻唑基和异噻唑基的芳基；所述Ar2可以任选被一个、两个或三个选自下列的取代基取代任选取代的1到9个碳原子的烷基或环烷基、卤素、1到9个碳原子的烷氧基、羟基、1到9个碳原子的羟烷基、烷氧基烷基，其中烷基和亚烷基分别具有1到9个碳原子，和氰基。
此处使用的“烷基”是指通过C-C单键相连在一起的任选取代的烃基。烷基烃基可以是直链、支链或环状的、饱和或不饱和的。优选基团是直链的。优选基团是未取代的。优选基团是饱和的。烷基部分优选是C1-4烷基，更优选甲基。
此处使用的“芳基”是指带有至少一个具有共轭π电子体系的环的任选取代的芳基，其包含最多两个共轭或稠合的环系。“芳基”包括碳环芳基、杂环芳基和二芳基，所有这些基团均可任选取代。优选芳基部分是未取代的、单取代的、二取代的或三取代的苯基或萘基。
用于本发明的优选化合物选自N-甲酰基-N-羟基-2-(间-联苯氧基)乙胺；N-甲酰基-N-羟基-2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙胺；和N-甲酰基-N-羟基-2-(3-苯甲酰基苯氧基)乙胺。
本发明还包括药物可接受盐和配合物。优选是盐酸盐、氢溴酸盐和三氟乙酸盐。本发明的化合物可以含有一个或多个不对称碳原子，并可以外消旋体和旋光体存在。所有这些化合物和非对映异构体都在本发明考虑范围内。
可以通过结合下面的合成方案更好地理解本发明的化合物和方法，所述方案仅用于阐述制备本发明化合物所使用的方法，但并不是用来限制在附加的权利要求中限定的本发明的范围。代表性的方法在下面的方案1和2中概述。
在以下方案和实施例的描述中使用的缩略语是THF，四氢呋喃，和DMF，N，N-二甲基甲酰胺。
方案1 如方案1所示，在优选碳酸钾的碱存在下，在优选DMF的极性溶剂中，可以用溴乙酸乙酯(2-方案-1)完成苯酚1a-方案1或芳基硫醇1b-方案1的烷基化，得到3-方案2，随后可以在优选水和二噁烷的溶剂混合物中，通过用优选氢氧化锂的碱水溶液处理，以进行水解，得到4-方案1。可以通过用优选双(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦(BOP-C1)的偶联剂，将N，O-二甲基羟基胺盐酸盐偶联到4-方案1上，制备酰胺5-方案1。在优选THF的惰性溶剂中，用还原剂，优选过量的氢化锂铝或氢化二异丁基铝处理5-方案1，得到醛6-方案1。在带有优选催化量的碱，优选吡啶的羟基溶剂，优选乙醇中，通过用羟基胺盐酸盐处理，使得该醛转化为相应的肟7-方案1。在优选乙醇的羟基溶剂中，用优选硼烷-吡啶配合物的还原剂处理7-方案1，并加入过量的盐酸水溶液，得到相应的羟基胺8-方案1，在诸如THF或二氯甲烷的溶剂中，用优选甲酸乙酸酐(formicacetyl anhydride)的甲酰化试剂处理羟基胺，得到异羟肟酸9-方案1。其中X＝S的化合物可以通过使用合适的氧化剂，诸如间-氯过苯甲酸或过硫酸氢钾制剂进行氧化，转化为砜10-方案1。
由于Ar1和Ar2的取代基的特性，可能需要将其它反应性基团进行保护和随后去保护，以成功地完成所述的合成方法。常用的保护基团公开在Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis，”(John Wiley & Sons，NewYork(1981))中，在此引作参考。
方案2 方案2说明砜6-方案2的另一种合成方法。用例如LDA的碱，将砜2-方案2去质子化，然后加入甲醛1-方案2，得到醇3-方案2。所述醇可以通过与例如甲苯磺酸的酸进行反应，或通过逐步的2步方法(首先用甲磺酰氯和三乙胺处理将醇转化为例如甲磺酸的离去基团，然后用优选1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯的碱消去)进行脱水。烯烃4-方案2与优选O-苄基的O-保护的羟基胺反应，得到加合物5-方案2。砜5-方案2也可以通过用例如n-BuLi的碱将砜2-方案2去质子化，然后优选在醚合三氟化硼的存在下加成到O-保护的肟7-方案2上的方法直接制备。如上方案1中所述，甲酰基化5-方案2，随后优选在P是苄基的化合物所使用的氢化条件下除去保护基团，得到砜6-方案2。
方案3说明要求保护化合物的另一种新颖的合成方法。可以在例如嘧啶的溶剂中，用羟基胺乙酸盐处理醛1-方案3，制备肟2-方案3。在酸性条件下，使用氰基硼氢化钠还原肟，得到羟基胺3-方案3，并用甲酸和乙酸酐制备的混合酐进行甲酰化，得到N-甲酰基-N-羟基胺4-方案3。然后在例如二氯甲烷的溶剂中，用例如三乙胺的碱将N-甲酰基-N-羟基胺4-方案3加载到2-氯-三苯甲基树脂上。然后在四氢呋喃中，用氟化四丁基铵将树脂结合的5-方案3去保护，得到6-方案3。在Mitsunobu条件下，用芳香醇处理游离羟基，随后从树脂上分离(5％TFA/二氯甲烷)，得到芳基N-甲酰基-N-羟基胺8-方案3。
方案3 另外，式I化合物可以如方案4所述制备。在例如吡啶的溶剂中，通过用O-苄基羟基胺盐酸盐处理醛1-方案4，制备肟2-方案4。在酸性条件下，使用氰基硼氢化钠将肟还原，得到O-苄氧基胺3-方案4，并使用甲酸和乙酸酐制备的混合酐进行甲酰化，得到N-甲酰基-N-(O-苄氧基)胺4-方案4。然后在四氢呋喃中，用氯化四丁基铵将N-甲酰基-N-(O-苄氧基)胺4-方案4去保护，得到5-方案4。在Mitsunobu条件下，用芳香醇处理游离羟基，随后使用Pd/C催化氢化，得到芳基N-甲酰基-N-羟基胺7-方案4。
方案4 可以通过参考以下描述本发明化合物制备方法的实施例更好地理解上述内容，但并不用来对附加权利要求所定限的本发明的范围进行限制。
实施例1N-甲酰基-N-羟基-2-(间-联苯氧基)乙胺，1a.用O-苄基羟基胺盐酸盐(551mg)处理叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙醛(500mg)的吡啶(5mL)溶液并搅拌90分钟。用二氯甲烷稀释并用1MHCl萃取反应溶液。干燥并浓缩有机物，得到无色油状的顺式和反式异构体1∶1的混合物肟(784mg)。
1c.向0℃的上述肟(784mg)的甲醇(14mL)溶液中加入甲基橙。在搅拌下缓慢加入氰基硼氢化钠(230mg)并同时滴加保持甲基橙指示剂为粉红色所需的6MHCl/甲醇(1/1)。在0℃搅拌1小时后，用6MNaOH将反应液调节至pH9，并用二氯甲烷萃取反应液。干燥并浓缩有机物，得到无色油状的还原胺(780mg)。
1d.用溶于二氯甲烷(8mL)的三乙胺(280mg)和由甲酸(127mg)和乙酸酐(283mg)制备的混合酐处理O-苄氧基胺(460mg)，然后用1MHCl萃取处理，得到N-甲酰基-N-苄氧基胺(490mg)。
1e.向上述N-甲酰基-N-苯氧基胺(490mg)的THF(7mL)溶液中加入TBAF(1.67mL的1MTHF溶液)。搅拌45分钟后，反应液在乙酸乙酯和水之间分配，并分层。干燥并浓缩有机层，得到醇(300mg)。
1f.向上述醇(70mg)和间-苯基苯酚(61mg)的THF(2mL)溶液中加入偶氮二甲酸二异丙酯(80mg)，然后加入三苯基膦(94mg)。搅拌过夜后，反应混合物通过硅胶柱纯化(用25％乙酸乙酯/己烷洗脱)。浓缩适当的收集部分，得到芳基醚(115mg)。
1g.在氢气氛围下搅拌上述芳基醚(115mg)和Pd/C(20mg)的甲醇(6mL)悬浮液90分钟。将反应混合物通过塞利特硅藻土填料过滤并浓缩滤液，得到粗N-甲酰基-N-羟基胺。通过反相HPLC纯化，得到白色固体的N-甲酰基-N-羟基-2-(间-联苯氧基)乙胺。
合成N-甲酰基-N-羟基胺醚的一般方法1a.用羟基胺盐酸盐处理叔丁基二甲基甲硅烷氧基-乙醛的吡啶溶液并搅拌过夜。用二氯甲烷稀释反应溶液并用1MHCl萃取。干燥并浓缩有机物，得到无色油状的顺式和反式异构体为1∶1的肟混合物。
1b.向0℃的上述肟的甲醇溶液中加入2mg甲基橙。搅拌下缓慢加入氰基硼氢化钠并同时滴加保持甲基橙指示剂为粉红色所需的6MHCl/甲醇(1/1)溶液。在0℃搅拌1小时后，用6MNaOH将反应液调节至pH9，并用二氯甲烷萃取。干燥并浓缩有机物，得到无色油状的羟基胺。
1c.用1当量由酸甲和乙酸酐(1∶1)制备的混合酐和1当量溶于二氯甲烷的三乙胺处理羟基胺，然后用二氯甲烷和1MHCl萃取处理，得到4-方案-3所示的N-甲酰基-N-羟基胺。将2-氯三苯甲基树脂、N-甲酰基-N-羟基胺和三乙胺的二氯甲烷溶液摇动过夜，将N-甲酰基-N-羟基胺加载到树脂上。然后用二氯甲烷、四氢呋喃、再用二氯甲烷清洗树脂。用溶于THF的TBAF处理加载的树脂并摇动3小时，然后用四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、再用二氯甲烷清洗，得到树脂上的游离醇。在Mitsunobu条件(DIAD，pph3，THF)下，用适合的芳香醇处理醇过夜，然后用四氢呋喃(3次)、二氯甲烷、DMF、四氢呋喃和二氯甲烷清洗，得到7-方案3的芳香醚。用5％TFA甲醇溶液处理树脂15分钟，使产物从载体上分离，然后用二氯甲烷和甲醇清洗。随后浓缩滤液并用高通过量的反相HPLC纯化，得到如8-方案3的醚。
按照这个方法，制备以下化合物N-甲酰基-N-羟基-2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙胺，白色固体。
N-甲酰基-N-羟基-2-(3-苯甲酰基苯氧基)乙胺，白色固体。
对任何化学官能团的适当处理和保护，其它式(I)化合物的合成可以通过与上述和实验部分所述的类似方法完成。
为了将式(I)化合物或其药物可接受盐用于人和其他哺乳类动物的治疗，通常按照标准制药方法将其配制为药物组合物。
本发明化合物用于细菌感染的治疗，包括但并不限于呼吸道感染和/或格兰氏阳性感染。
式(I)化合物及其药物可接受盐可以以抗生素的标准方式给药，例如，口服、非肠道、舌下、皮肤、经皮肤、直肠、经由吸入或经由面颊给药。
在口服时具有活性的式(I)化合物及其药物可接受盐可以配制成糖浆、片剂、胶囊、乳剂和锭剂。糖浆制剂一般由化合物或盐在液态载体，例如乙醇、花生油、橄榄油、甘油或水中的悬浮液或溶液以及调味剂或着色剂组成。当组合物是药片形式时，可以使用常规用于制备固体制剂的任何药物载体。所述载体的例子包括硬脂酸镁、石膏粉、滑石、明胶、阿拉伯树胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。当组合物是胶囊形式时，任何常规的包胶囊法都是合适的，例如在硬的明胶胶囊壳中使用上述载体。当组合物是软明胶壳胶囊时，可以考虑常规用于制备分散液或悬浮液的任何药物载体，例如含水树胶、纤维素、硅酸盐或油，并且混合到软明胶胶囊壳中。
典型的非肠道用组合物由化合物或盐的灭菌含水或非水载体的溶液或悬浮液组成，所述载体任选地含有非肠道用的油，例如聚乙二醇、聚乙亚烷基吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油。
典型的吸入组合物是溶液、悬浮液或乳液的形式，可以以干粉末给药，或使用常规的推进剂，例如二氯二氟甲烷或三氯氟代甲烷，以气雾剂形式给药。
典型的栓剂含有当以这种方式给药时具有活性的式(I)化合物或其药物可接受盐，以及粘合剂和/或润滑剂，例如聚乙二醇、明胶、可可脂或其他低熔点的植物蜡或脂肪，或其合成的类似物。
典型的皮肤和经皮肤制剂含有常规的含水或非水赋形剂，例如，乳油、软膏、洗剂或糊剂，或者以膏药、贴片或膜的形式。
优选组合物是单位剂量形式，例如片剂、胶囊或计量的气雾剂，这样病人能够以单个剂量使用。
口服的各剂量单位适合含有0.1mg到500mg/Kg，优选1mg到100mg/Kg，非肠道给药用的各剂量单位适合含有0.1mg到100mg/Kg的以游离酸计的式(I)化合物或其药物可接受盐。鼻内给药的各单位剂量适合含有每人1-400mg和优选10到200mg。局部制剂适合含有0.01到5.0％的式(I)化合物。
适合的口服的日给药方案是约0.01mg/Kg到40mg/Kg以游离酸计的(I)化合物或其药物可接受盐。适合的非肠道给药的日剂量是约0.001mg/Kg到40mg/Kg以游离酸计的(I)化合物或其药物可接受盐。适合的鼻内给药和口腔吸入的日给药方案是约10到500mg/人。活性成分每日可给药1到6次，充分显示出所需的活性。
当按照本发明给药本发明的化合物时，没有不可接受的毒理学效果。
通过下面试验证明式(I)化合物的生物学活性生物试验使用Lazennec & Meinnel开发的连续酶联测定(1997)(“肽脱甲酰基酶的甲酸脱氢酶偶联的分光光度测定”Anal.Biochem.244，pp.180-182)，加以小小的改进，于25℃测量S.Aureus或E.Coli PDF活性。50μL反应混合物中含50mM磷酸钾缓冲液(pH7.6)，15mM NAD，0.25U甲酸脱氢酶。包含底物多肽，f-Met-Ala-Ser，浓度KM。加入10nMDef1酶引发反应，在340nm监测吸光度20分钟。
抗菌活性测定使用国际临床实验标准委员会(NCCLS)推荐的方法，文献M7-A4，“用于细菌有氧生长的稀释液敏感性试验方法”(在此引作参考)，通过肉汤微稀释测定全细胞抗菌活性。在从0.06到64mcg/ml范围内的连续二倍稀释液中测试化合物。在测定中评估12个菌种的面板。该面板含有下列实验室菌种金黄色葡萄球菌属、肺炎链球菌R6、化脓性链球菌CN10、粪肠球菌I、流感嗜血杆菌Q1、大肠杆菌DC0、大肠杆菌EES、大肠杆菌7623(AcrAB+)、大肠杆菌120(AcrAB-)、肺炎杆菌E70、铜绿假单胞杆菌K799wt和白念珠菌属GRI681。测定最小抑制浓度(MIC)作为抑制可见生长的化合物的最低浓度。使用反光镜读数器帮助测定MIC终点。
权利要求
1.通过向需要治疗的受治疗者给药式(I)化合物以治疗细菌感染的方法 其中X＝O；Ar1是任选取代的苯基，其中所述取代基分别是一个、两个或三个选自下列的取代基任选取代的1到9个碳原子的烷基或环烷基、卤素、1到9个碳原子的烷氧基、羟基、1到9个碳原子的羟烷基、烷氧基烷基，其中烷基和亚烷基分别具有1到9个碳原子；Y选自共价键、氧、2到4个碳原子的亚烷基、2个碳原子的亚烯基、2个碳原子的亚炔基、S(O)p、C(O)、其中p是0-2。Ar2是选自苯基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、噻唑基和异噻唑基的芳基；所述Ar2可以任选被一个、两个或三个选自下列的取代基取代任选取代的1到9个碳原子的烷基或环烷基、卤素、1到9个碳原子的烷氧基、羟基、1到9个碳原子的羟烷基、烷氧基烷基，其中烷基和亚烷基分别具有1到9个碳原子，和氰基。
2.权利要求1的方法，所述化合物选自N-甲酰基-N-羟基-2(间-联苯氧基)乙胺；N-甲酰基-N-羟基-2[(4-苯氧基)苯氧基]乙胺；和N-甲酰基-N-羟基-2(3-苯甲酰基苯氧基)乙胺。
3.权利要求1的治疗细菌感染(包括呼吸道感染(RTI)和/或格兰氏阳性TPP(葡萄球菌、链球菌、肠球菌))的方法。
全文摘要
本发明提供了PDF抑制剂和使用它们的新颖方法。
文档编号A61K31/16GK1431897SQ01808998
公开日2003年7月23日 申请日期2001年5月4日 优先权日2000年5月5日
发明者凯利·M·奥巴特, 西格弗里德·B·克里斯坦森第四, 雅克·布赖恩德, 马克斯韦尔·D·卡明斯 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司