肽基精氨酸脱亚氨酶6的制作方法

专利名称：肽基精氨酸脱亚氨酶6的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码肽基精氨酸脱亚氨酶(deiminase)6的多核苷酸、这些多核苷酸转染的细胞、这些细胞产生的蛋白，和一种产生这些蛋白及其调节剂的方法。
肽基精氨酸脱亚氨酶(PAD)是一个翻译后修饰酶家族，它以一种Ca2+-依赖性的方式将肽基精氨酸转化为瓜氨酸。在体外酶促脱亚胺改变了多种蛋白的功能特征并改变了它们的二级和三级结构。
迄今为止，已鉴定了5种表现出广泛组织分布的PAD同种型。小鼠PAD1在表皮和子宫中检测到(Rus′d，A.A.等1990，Eur.J.Biochem.259，660-669)；鼠PAD2广泛表达于各种组织例如脑、垂体、脊髓、唾液腺、胰腺、骨骼肌、子宫、脾、胃和胸腺(Takahara，H.等1989，J.Biol.Chem.264，13361-13368)；鼠PAD3表达于表皮和毛囊(Terakawa，H.等1991，J.Biochem.(Tokyo)110，661-666)；PAD4(大鼠)是一种普遍存在的酶，表达于胰腺、脾、卵巢、肝脏、肺、胃、肾、子宫、真皮、脑、心脏和表皮(Yamakoshi，A.等1998，Biochim.Biophys.Acta 1386，227-232)；人PAD5最终作为一个新的家族成员从髓细胞白血病细胞系中被分离出来，但是其组织分布还没有进一步确定(Nakashima，K.等1999，J.Biol.Chem.274，27786-27792)。
关于PAD的生理学功能所知甚少。在脑中，髓鞘碱性蛋白是它的一个天然底物，因此PAD在中枢神经系统中起着重要作用。此外，当失调时，PAD在多发性硬化症的病因学中起作用(Mastronardi，F.G.等1996，Clin.Invest.97，349-358)。表皮中的PAD似乎参与角质纤丝聚集蛋白的末端加工，这对于维持上角质层的水分具有间接的重要作用(Senshu，T.等1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.225，712-719)。这种PAD的失调还可能在类风湿性关节炎的病因学中扮演角色(Girbal-Neuhauser，E.等1999，J.Immunol.162，585-594)。最后在毛囊中，毛透明蛋白的溶解性似乎受PAD的影响；这一功能仍有待确定(Rogers，G.E.等1997，J.Invest.Dermatol.108，700-707)。
我们现已发现一种新的PAD，它被称作为PAD6。其转录物已在小鼠卵母细胞中发现。其人同源物也在本文描述。发现这种蛋白在卵母细胞/卵巢和睾丸中专一表达。
特异性表达于雄和/或雌配子中的基因可提供雄性和雌性避孕的新分子靶。对于睾丸，大量唯一表达于生殖细胞的的基因序列已被描述(Pawlak，A.等1995 Genomics 26，151-1588；Wolgemuth D.J.和Watrin F.1991 Mamm Genome 1，283-817)。相反，迄今为止只鉴定了少数特异性表达于卵母细胞中的基因。大多数已鉴定的配子特异性基因序列可能由于其在配子中的特异表达而具有重要功能。后者通过利用基因敲除动物的研究被证实，显示睾丸和卵母细胞特异性基因的基因失活通常导致雄性和/或雌性不育，但是并不导致其它器官和组织的额外病症(Dong，J.等1996，Nature 383，531-535；Nantel，F.等1996，Nature 380，159-162)。这些数据提供了这些基因在配子发生过程中特异及重要作用的进一步证据。这突出了组织特异性作为用于生育调控的分子靶的选择标准的重要性。
显然急需阐明与生育调控有关的基因，以解开这些基因可能在不育中起的各种不同角色。较好认识参与雌性和雄性生育不同阶段例如配子发生的基因及其活性和表达调控可能有助于更好理解不育症。这可最终导致鉴定用于体内或体外治疗方案的活性调节剂。
本发明提供了这样一种基因。更具体地，本发明提供了一种编码肽基精氨酸脱亚氨酶6(PAD6)的多核苷酸序列。优选该多核苷酸是哺乳动物来源的，优选小鼠，更优选人。其RNA在生殖器官中专一表达。
最优选的多核苷酸序列是那些编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的序列。
本发明还包括如SEQ ID NO2中所示的完整的小鼠mRNA序列，而且更具体的是对应于SEQ ID NO2第6-2051位核苷酸序列的可读框。该序列编码一个具有682个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO1)。另外，本发明包括如SEQ ID NO4中所示的完整的人mRNA序列以及对应于SEQ ID NO4第20-2077位核苷酸序列的可读框。该序列编码一个具有686个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO3)。为适应密码子变异性，本发明还包括编码与本文所公开的序列相同的氨基酸序列的多核苷酸序列。本文所提供的序列信息不应狭窄理解为需要排除错误鉴定的碱基。本文所公开的特定序列可容易地用于分离若干其它物种的完整基因或等位基因变异体。该序列可以例如用于制备探针或者作为来源制备合成寡核苷酸以在DNA扩增反应中用作引物，允许分离和鉴定完整的变异体基因。特别地，在严格冲洗条件下，与利用SEQ ID NO14和SEQ ID NO15，以来源于哺乳动物优选人或小鼠的cDNA作为模板，在标准条件下用PCR所制备的探针杂交的多核苷酸是本发明的一部分。这样一种探针(及其互补序列)是例如通过SEQ ID NO4的第464-1052位核苷酸鉴定的。
完整的遗传序列可用于制备在合适的宿主细胞中表达该蛋白的载体分子。
从而，在一个方面，本发明提供了编码新的PAD6蛋白的分离的多核苷酸。优选该PAD6是人源的，但直向同源物也构成本发明的一部分。
根据本发明的DNA可从cDNA获得。组织优选来源于哺乳动物，更优选来源于人。优选地，核糖核酸是从卵母细胞或睾丸中分离的。作为选择，编码序列可以是基因组DNA，或者是利用DNA合成技术制备的。多核苷酸还可以是RNA的形式。如果多核苷酸是DNA，它可以是单链或双链形式。单链可以是编码链或非编码(反义)链。
根据本发明的DNA将会对在体内或体外以足够量和以基本上纯的形式表达根据本发明的新蛋白非常有用。
本发明进一步涉及具有轻微变异或具有多态性位点的多核苷酸。具有轻微变异的多核苷酸可编码保持与天然成熟蛋白相同的生物功能或活性的变异体多肽。多态性位点可用于诊断目的。
在另一个方面，本发明提供了一种分离多核苷酸的方法，包含步骤a)在严格条件下，使根据本发明的多核苷酸、或其互补序列与核酸杂交，所述核酸是(基因组)DNA、RNA、或者cDNA，优选分离自高表达所感兴趣多核苷酸的组织，以及b)用本领域技术人员公知的方法分离所述核酸。组织优选来源于人。优选核糖核酸是从卵母细胞、卵巢或睾丸中分离的。杂交条件优选是高度严格的。
根据本发明，术语“严格”意味着1×SSC，0.1％SDS在温度为65℃的冲洗条件；高度严格条件指SSC降低至0.3×SSC，更优选降至0.1×SSC。优选地，前两种冲洗相继进行两次各15-30分钟。如需在高度严格条件下冲洗，则进行一次额外的0.1×SSC冲洗15分钟。杂交可例如在0.5M磷酸缓冲液pH7.5/7％SDS中于65℃过夜进行。
作为选择，分离基因的方法可以包含利用来源于根据本发明的核酸的引物的基因扩增方法。完整的cDNA也可以通过合并克隆而获得，所述克隆通过例如与如RACE cDNA克隆杂交而得到。
编码功能性多肽的编码序列的部分及其等位基因和种变异体也是本发明的一部分。有时，一个基因在某个组织中表达为剪接变异体，结果产生改变了的5′或3′mRNA或者包含或排除一个或多个外显子序列。这些序列同这些序列编码的蛋白都预期表现出相同或相似的功能，而且也构成本发明的一部分。
本发明还提供了肽基精氨酸脱亚氨酶6(PAD6)。优选该蛋白具有哺乳动物的氨基酸序列，更优选是人的序列。最优选的是如SEQ IDNO1或3中所描述的序列。可通过将包含编码PAD6的多核苷酸的载体分子引入合适的宿主细胞而获得表达。可通过本领域熟练技术人员所公知的方法培养细胞和分离蛋白。
在本发明的另一个方面，提供了功能性等同物，即编码PAD6活性并包含基本上同样的SEQ ID NO1或3序列或其部分的多肽，其具有序列变异而仍然保持功能特征。
发生于一个序列中的变异可通过总序列中的(一个)氨基酸差异，或者通过所述序列中的缺失、置换、插入、倒置或添加(一个)氨基酸来证实。预期基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸置换已被描述。相关氨基酸之间的氨基酸替换或者进化中频繁发生的替换特别有Ser/Ala，Ser/Gly，Asp/Gly，Asp/Asn，Ile/Val(参见Dayhof，M.D.，Atlas of protein sequence and structure，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，vol.5，suppl.3)。基于此信息，Lipman和Pearson开发了一种快速和灵敏的蛋白质比较方法(Science，1985227，1435-1441)，并确定同源多肽之间的功能相似性。显然同样编码这种变异体的多核苷酸也是本发明的一部分。
从而，在本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的多肽，或者还有具有80％，优选90％，更优选95％相似性的多肽。
这里所用的术语相似性如NCBI-BLAST 2.0.10[Aug-26-1999]中所定义(Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alej andro A.Schaffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，和David J.Lipman(1997)″Gapped BLAST and PSI BLASTa new generation ofprotein database search programs″，Nucleic Acids Res.25，3389-3402)。该程序利用缺省设置用于查找序列对比。关于氨基酸对比，BLOSUM62矩阵用作为缺省值，而相似性以阳性的数目表示。不包括低组成复杂度的滤除。
还包括仍能赋予生物学效应的这种多肽的部分。特别是仍然能够将精氨酸转化成瓜氨酸的部分构成了本发明的一部分。这样的蛋白或其功能性部分可能本身是功能性的，例如以一种溶解的形式，或者它们可以连接于其它多肽(例如以使其定向于特定的亚细胞区室，以增加其稳定性或易化其纯化)，通过已知的生物技术途径或者通过化学合成来获得嵌合蛋白。
显然编码这种变异体多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
广泛种类的宿主细胞和克隆载体组合可有效地用来克隆编码根据本发明的多肽的核酸序列。
合适的表达载体有，举例来说，细菌或酵母质粒、广谱宿主范围的质粒、以及来源于质粒和噬菌体或病毒DNA组合的载体。还包括来源于染色体DNA的载体。此外，复制起点和/或显性选择标记可存在于根据本发明的载体中。根据本发明的载体适于转化宿主细胞。
用于表达本发明的蛋白或其部分的载体可进一步包含调控序列，其可操作地连接于编码该蛋白的核酸序列。这样的调控序列通常包含启动子序列以及调控和/或增强表达水平的序列。当然，调控和其它序列可取决于所选择的宿主细胞而变化。
包含本发明的DNA的重组表达载体和用所述DNA或所述表达载体瞬时或者稳定转染的细胞也构成了本发明的一部分。
根据本发明的合适的宿主细胞为细菌宿主细胞、酵母和其它真菌、植物或动物宿主例如中国仓鼠卵巢细胞、猴细胞或人细胞。从而，包含根据本发明的DNA或表达载体的宿主细胞也落在本发明的范围内。经改造的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述培养基可被修饰例如用于适当的选择、扩增或诱导转录。培养条件例如温度、pH、营养等等是所属领域的普通技术人员所熟知的。
用于制备根据本发明的DNA或载体的技术以及用所述DNA或载体对宿主细胞的转化或转染是标准的并且是本技术领域所公知的，参见例如Sambrook等，《分子克隆实验室手册》，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989。
根据本发明的蛋白可以利用普通的生物化学纯化方法从重组细胞培养物中回收和纯化(如Guide to Protein purification中所述。MurrayP.Deutscher编辑。(1990)Methods in Enzymology.Vol 182.AcademicPress，inc.San Diego CA 92101.Harcourt Brace Jovanovich，Publishers)，包括硫酸胺沉淀、提取、层析例如疏水作用层析、阳离子或阴离子交换层析或亲合层析以及高效液相色谱。如果必要，还可包括蛋白重折叠步骤。可选择地，蛋白可作为包含可用于亲合纯化的(″标记″)的融合蛋白来表达和纯化。
根据本发明的蛋白活性的调节在体内对于控制卵泡募集还有卵母细胞和/或卵泡的生长和成熟有用。在体内抑制这些过程可用于延迟(过早的)绝经和/或作为避孕。另外，该蛋白可用来在体外使例如来自冷冻的卵巢组织的卵泡成熟和生长。
根据本发明的PAD基因产物可用于在体内或体外鉴定新的底物或其类似物。为达到这个目的，可利用由根据本发明的DNA或者包含根据本发明的DNA的表达载体所转化的细胞进行例如肽基精氨酸脱亚氨酶测定研究，所述细胞表达根据本发明的PAD6基因产物。可选择地，PAD6蛋白本身或其底物结合结构域也可用于鉴定功能性底物或类似物的试验。
在体内和体外分析中测定所表达的基因产物的肽基精氨酸脱亚氨酶活性以测定基因产物的生物学活性的方法是公知的。参见例如Lamensa，F.E.W.和Moscarello，M.A.1993 J.Neurochem.61，987-996。在这种分析中，α-N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)中的精氨酸被转化为瓜氨酸，其用高氯酸沉淀后可被容易地检测到。
测定PAD6酶活性的另外一个例子利用了蛋白的失活，例如大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)(Takahara，H.等1985，J.Biol.Chem.260，8378-8383)。当STI中的一个必需精氨酸转化成瓜氨酸时，它不能再抑制胰蛋白酶的蛋白水解酶活性。这可用作测定PAD活性的两步分析法的基础。该分析包括两个步骤。在第一个反应中，PAD将STI中的精氨酸(63位)转化成瓜氨酸从而使STI失活。在第二个反应中，加入胰蛋白酶和荧光底物并检测胰蛋白酶的活性。
作为选择，PAD6活性的调节还可以通过该蛋白的表达水平的下调而获得，例如利用反义核酸通过形成三股螺旋(Cooney et al.，1988，Science 241，456-459)或通过结合mRNA，或者通过小分子影响mRNA稳定性或蛋白相互作用。这本身还可以引起生育的调节，即避孕或治疗不育。
从而，本发明提供了一种方法用于鉴定影响根据本发明的蛋白的酶功能的化合物。该方法包含步骤a)使PAD6蛋白与含精氨酸的底物接触b)使所述混合物与测试化合物接触c)测量精氨酸到瓜氨酸的转化以及d)将所述转化与不存在测试化合物时的肽基精氨酸脱亚氨酶活性进行比较。
精氨酸到瓜氨酸的转化可被容易地检测，例如通过分析方法象HPLC、肽对蛋白水解敏感性的改变、肽活性特征的变化或者特异性抗体识别。包含精氨酸的肽或蛋白可用作底物，也可利用合成化合物例如α-N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯。不过，氨基和羧基必须被取代或者必须以一种肽键合形式。
作为选择的，本发明提供了一种方法用于鉴定调节PAD6 mRNA稳定性或PAD6表达水平的化合物。
本发明因此提供了一种快速和经济的方法用以筛选用于涉及PAD6活性的生育调控的治疗剂。根据本发明的方法此外还提供了对可区分不同肽基精氨酸脱亚氨酶的选择性治疗剂的选择，从而得到更为有效的治疗剂和/或减小副作用。该方法特别适于用来进行对众多潜在的靶化合物的高产量筛选。
调节肽基精氨酸脱亚氨酶6功能的化合物可通过调节本发明的PAD用于治疗。
本发明还提供了一种配制药物组合物的方法，包含将鉴定的调节剂化合物与药学上可接受的载体混合。
药学上可接受的载体是本领域熟练技术人员所公知的，并且包括，例如无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。
此外，该药物组合物可包含一种或多种稳定剂诸如，举例来说，碳水化合物包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖糊精和葡萄糖，蛋白例如白蛋白或酪蛋白，以及缓冲液象碱性磷酸盐。制备制剂和静脉内混合物的方法公开在Remingtons′s Pharmaceutical Sciences，pp.1463-1497(16th ed.1980，Mack Publ.Co of Easton，Pa，美国)中。
因此，通过利用根据本发明的肽基精氨酸脱亚氨酶所鉴定的调节剂化合物可用于制备药物。该药物用于调控生育障碍。
以下的实施例用于解释本发明，并且不应理解为限制本发明的范围。


图1小鼠PAD6在小鼠各组织中表达的RT-PCR分析(30个循环)(上图)。在下图中显示了不存在和存在RT时的GAPDH对照。
图2利用克隆1B11作为探针对来自青年(7日)和成年小鼠的卵巢的ISH(原位杂交)分析。
S＝次级卵泡 A＝近成熟卵泡(antral follicle)图3人PAD6在人各组织中表达的RT-PCR分析(30个循环)(上图)。在下图中显示了不存在和存在RT时的GAPDH对照。
图4与hPAD6探针杂交的人多组织RNA印迹(Clontech)。
图5确定PAD活性的荧光检测。STI(0.17μg)分别在不存在(实心正方形)或存在0.5μg GST-PAD6(实心三角形)、1.0μg GST-PAD6(空心三角形)、或0.1μg兔肌PAD(空心正方形；Sigma cat.No P1584)的条件下预温育。随后，加入N-α-苯甲酰-L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素(100μM；Sigma cat.No.B7260)和胰蛋白酶(0.25μg)，并测定荧光。
实施例实施例1小鼠cDNA克隆的制备卵母细胞cDNA文库的产生总RNA分离自2172个裸露的小鼠卵母细胞，根据RNAzol BTMRNA分离方案(Campro scientific)在体外用50μM FF-MAS处理15小时。直接向各含有大约100个卵母细胞的冷冻细胞沉淀物中加入RNAzol B。收集合并匀浆并用0.1倍体积的氯仿抽提，震荡15秒并置于冰上保温10分钟。于4℃在14000rpm离心15分钟后收集水相。通过加入等体积的异丙醇随后于4℃o/n保温而沉淀总RNA。RNA在14000rpm于4℃离心45分钟，沉淀物用700μl 70％乙醇洗涤一次，接着在14000rpm于4℃离心30分钟。风干的沉淀物最后重悬于7.5μl无RNA酶的水(Ambion)中。运用该步骤所分离的RNA的总量利用RibogreenTMRNA定量试剂盒(Molecular Probes)来测定。
至于cDNA合成，利用SMARTTMPCR文库构建试剂盒(Clontech)。引入了以下的改进。具有EcoR I限制性酶切位点的寡聚dT(18)引物(Pharmacia)退火至mRNA的3′端，而延伸有EcoR I限制性酶切位点的SMARTTMoligo退火至mRNA的5′端。第一链cDNA合成反应在含有50mM Tris(pH 8.3)，75mM KCl，6mM MgCl2，2mM DTT，1mM dNTP混合物和200单位Superscript 11 RNase H反转录酶(Gibco BRL)的反应缓冲液中于42℃进行1小时。随后第一链cDNA利用Perkin Elmer thermocycler(9600)通过PCR扩增。PCR在总体积为100μl含有1×Klen Taq PCR缓冲液(Clontech)，0.2mMdNTP混合物(Clontech)，0.2mM 5′EcoR I-SMART引物，0.2mM NotI-EcoR I-dT(18)引物(Pharmacia)和1×Advantage Klen Taq聚合酶Mix(Clontech)的反应缓冲液中进行，以95℃变性1分钟起始，接着是28个循环的95℃15秒以及68℃5分钟。
用Qiaquickspin column(QIAGEN)纯化后，cDNA以EcoR I(Phannacia)在37℃消化，随之在70℃热灭活10分钟。cDNA用两个相继的Qiaquickspin column纯化两次并最终重悬于50μl 10mMTris-CL(pH 8.5)中。DNA浓度利用Genequant分光光度计通过测量260nm处的吸光度而测定。
cDNA的大小分级cDNA利用琼脂糖凝胶电泳进行大小分级，并利用QiaexII琼脂糖凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶基质中提取。DNA用20μl H2O洗脱，以Qiaquickspin column(Qiagen)纯化并洗脱在50μl H2O中。通过加入0.1倍体积的3M醋酸钠、10μg糖原和2.5倍体积的乙醇(96％v/v)随后在-20℃保温而沉淀样品。通过在14.000rpm于4℃离心20分钟收集大小分级的cDNA。DNA沉淀物用70％乙醇洗涤并风干，之后溶于MQ。DNA浓度利用PicoGreenTMdsDNA定量试剂盒(MolecularProbes)测定。
在用EcoR I消化后，200ng卵母细胞cDNA在含有50mM Tris-ClpH 7.8、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP和750单位/ml T4连接酶(Pharmacia)的缓冲液中连接于500ng预消化并且脱磷酸的λGT11噬菌体臂中。该反应于16℃o/n保温。最后，完成的连接反应如产品信息单中所述被包装于Max PlaxTMpackagingextract(Epicentre)。
实施例2小鼠PAD6的分离和表征噬菌体克隆的PCR扩增单个噬菌斑在100μlλ噬菌体缓冲液(10mM Tris-HCL pH 8.3，100mM NaCl2和10mM MgCl2)中保温至少1小时。来自每个洗脱的噬菌斑的2.5μl利用λGT11引物(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)进行PCR扩增。PCR反应在PE9700(9600型，Perlcin Elmer)中进行，94℃5分钟1个循环；94℃30秒、55℃30秒、以及72℃3分钟，30个循环；接着是72℃5分钟1个循环。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析并基于大小、纯度和浓度进行选择。只选择500bp或更大的单一条带测序。
DNA序列分析来自小鼠卵母细胞cDNA文库的750个克隆在插入物PCR扩增之后通过DNA测序予以分析。序列分析利用Big Dye DNA测序ready反应方案(Perkin Einer)进行，并且样品利用ABI377自动DNA测序仪(Perlcin Elmer)分析。序列利用BLASTN或TBLASTN在数个记录在册的数据库gb111rod，genpept，EMrodESTs59和EMhumanESTs59等数据库中以自动程序进行Blast查找，并基于与已知功能基因的同源性加以注释。
PAD6的鉴定和表征得到的一个序列表现出与肽基精氨酸脱亚氨酶III强烈的同源性。以同源性查找为基础，确定该克隆1B 11编码一种命名为PAD6的新的肽基精氨酸脱亚氨酶。
小鼠PAD6 cDNA的5′-端可从小鼠卵巢cDNA文库中扩增。该文库的cDNA已被定向克隆入pSPORT载体(Life Technologies)的NotI-Sal I(5′-3′)位点。该载体在Not I位点5′端含有M13正向和SP6启动子序列，其联合两个PAD6特异的反向引物被用于5′ RACE PCR。第一个PCR利用M13F引物(SEQ ID NO7)和基因特异的反向引物(SEQ ID NO8)进行。这个PCR产物被稀释50倍，并取1微升稀释液作为模板和SP6引物(SEQ ID NO9)以及嵌套基因特异性反向引物(SEQ ID NO10)一起用于嵌套式PCR。两个PCR反应都在总体积为50μl含有1×Klen Taq PCR缓冲液(Clontech)、0.2mM dNTP混合物(Clontech)和1×Advantage Klen Taq聚合酶Mix(Clontech)的反应缓冲液中进行，以94℃变性5分钟起始；接着是94℃30秒、56℃30秒、72℃3分钟，30个循环；以及最后72℃5分钟的延伸。
嵌套式PCR产物中的条带按照产品信息单被克隆到TA TopoPCR2.1载体(Invitrogen)中并测序。发现一个1800bp的5′RACE片段完成了小鼠PAD6克隆。全长小鼠cDNA序列在SEQ ID NO2中给出。
以所得到的DNA序列信息为基础，设计了基因特异性PCR引物组合并用于RT-PCR实验以证实组织特异性表达分布型。所得到的数据(图1)证实了小鼠PAD6的卵母细胞/卵巢-(和睾丸-)特异性表达。(SEQ ID NO8和SEQ ID NO13被用作引物)。
原位杂交(ISH)为进一步研究PAD6在生殖腺中的表达，对小鼠卵巢和睾丸切片进行原位杂交(ISH)。
7日龄和成年小鼠的卵巢在4％缓冲的福尔马林中于室温固定24小时。组织包埋于石蜡中。切割石蜡切片(5μm)、封固在Superfrost plus显微镜载玻片上，并在37℃过夜干燥。该载玻片于60℃烘烤2小时。
组织切片在二甲苯中脱蜡，并在递减浓度的乙醇中再水合。载玻片在0.2M HCl中振荡洗涤20分钟，接着在DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的Milli Q中洗涤两次。切片用蛋白酶K(1μg/ml)在消化缓冲液(100mM Tris，50mM EDTA pH 8)中于37℃处理30分钟。在预冷的溶于PBS的0.2％甘氨酸中室温下(RT)振荡10分钟终止消化。载玻片用0.25％乙酸酐在0.1M三乙醇胺缓冲液中乙酰化5分钟，随后在DEPC处理过的Milli Q中洗涤两次。切片于杂交温度下在湿盒中用预杂交混合物预杂交，所述预杂交混合物含52％甲酰胺、21mM Tris、1mM EDTA、0.33M NaCl、10％硫酸葡聚糖、1×Denhardt′s溶液、100μg/ml鲑精DNA、100μg/ml tRNA和250μg/ml酵母总RNA。载玻片用玻璃盖玻片覆盖。2小时后，盖玻片替换为盛有100μl探针杂交混合物的盖玻片，所述探针杂交混合物含具有下列添加物的预杂交混合物0.1mM DTT、0.1％硫代硫酸钠、0.1％SDS和200ng/ml DIG-标记的探针。
DIG-标记的探针通过从线性DNA模板体外转录产生，利用DIG-dUTP和DNA-依赖性RNA聚合酶(SP6和T7)。每个RNA聚合酶的启动子部位连到基因特异性序列，以产生在5′含有SP6启动子位点并且在3′位点含有T7启动子的PCR片段。总的说来，制备了大约250-500个核苷酸的、位于SEQ ID NO2的5′端的探针。在体外转录后，少量的探针在1.5％的琼脂糖凝胶上分析以确定体外转录的成功。通过将系列稀释物(包括对照DIG-RNA(100ng/μl))点样到Hybond N+膜上、然后通过抗-DIG碱性磷酸酶Fab′片段(抗-DIG-AP)和NBT/BCIP显色底物温育来估计探针浓度。
杂交于42℃或50℃在湿盒中过夜进行(16小时)。载玻片随之用2×SSC洗涤，震荡15分钟，然后用2×SSC、1×SSC和0.1×SSC在杂交温度下震荡洗涤15分钟。切片以核糖核酸酶A(20μg/ml)在RNA酶缓冲液(0.6M NaCl，20mM Tris，10mM EDTA)中于37℃消化1小时。用预冷的PBS洗涤两次(室温震荡5分钟)以及缓冲液1(100mM马来酸、150mM NaCl)洗涤一次后，切片与封闭溶液(1g/ml封闭试剂在缓冲溶液1中)温育30分钟。然后切片与按1∶500稀释于封闭溶液的抗-DIG-AP室温温育1小时。用缓冲液1洗涤(室温震荡15分钟)两次后，将载玻片小心地沿组织四周擦干，并用DAKO-笔环绕切片划圈。切片用NBT/BCIP显色试剂覆盖，并在湿盒中室温温育。两小时后在显微镜下观察切片。如果没有或仅观察到微弱的染色，则在4℃温育过夜并且次日在室温下继续温育。最后，载玻片用水漂洗，并且可选地，用Mayer′s苏木精1∶5复染3秒钟。载玻片封固于Kaisers甘油明胶中。
如图2所示，PAD6在卵巢中专一性在卵母细胞中表达。
PAD6 mRNA在初级、次级和近成熟卵泡的卵母细胞中具有高表达水平，但也表达于原始卵泡的卵母细胞中。基于迄今为止所获得的数据，PAD6 mRNA在近成熟卵泡的卵母细胞中的表达水平降低提示很可能在卵子发生早期阶段需要PAD6的功能。尽管RT-PCR数据揭示睾丸表达PAD6，用ISH分析未检测到高于背景水平的PAD6 mRNA表达，意味着PAD6在睾丸中低水平的表达。
实施例3人PAD6的分离和表征利用全长小鼠PAD6 cDNA作为查询对象在EM63hsGeno(新)数据库中进行的BLAST查找鉴定了PAD6的人同源物。该查找仅鉴定了人PAD6编码序列的C-末端区域。为沿5′方向延伸该序列，设计引物并利用Marathon ReadyTMcDNA用户指南对人卵巢Marathon ReadycDNA(Clontech)进行5′RACE PCR。第一个PCR在下列条件下进行94℃变性30秒；94℃5秒和72℃3分钟，5个循环；94℃5秒和70℃3分钟，5个循环；以及94℃5秒和68℃3分钟，25个循环。该第一个PCR产物的50-倍稀释液作为模板，利用相同的PCR条件进行第二个嵌套式PCR反应。预期的≈650bp的条带被克隆到TA TopoPCR2.1载体(Invitrogen)中并测序。该克隆包含(通过同源性)人PAD6编码序列的5′最初的500个碱基对，从而完成了人PAD6的编码序列。
选择PCR引物由人卵巢RNA扩增全长的人PAD6 cDNA。至于人PAD6 cDNA的分离，对Marathon Ready卵巢cDNA(Clontech)利用引物SEQ ID NO11和SEQ ID NO12。PCR条件为94℃变性5分钟；然后是94℃30秒和68℃3分钟，5个循环；94℃30秒、62℃30秒和72℃3分钟，28个循环；最后在72℃延伸7分钟。
3个独立PCR反应的全长扩增物被克隆到PCR2.1 Topo载体中(Invitrogen)并测序以确定共有的核苷酸序列。其序列显示于SEQ IDNO4中。
设计了基因特异性PCR引物组合(SEQ ID NO14和SEQ ID NO15)并用于RT-PCR实验以确定人PAD6的表达分布型。对于来自人睾丸、子宫、肾、胸腺、肝脏、脑、心脏、肺和脾的RNA的RT-PCR揭示PAD6只在睾丸中表达(图3)。
人组织的多组织RNA印迹(Clontech)与人PAD6的PCR片段(大约590bp；引物SEQ ID No14和SEQ ID NO15的PCR产物从SEQID NO4的第464-1052位核苷酸延伸)杂交。探针用[32P]dCTP和Ready to Go标记珠(AP Biotech)根据制造商的说明在37℃温育60分钟而标记。未掺入的dNTP用置于1ml注射器中的Sephadex G50spincolumn除去。
印迹在Express hybmix(Clontech)中于65℃预杂交至少1小时。向预杂交混合物中加入4-8×107cpm的变性探针用于杂交。印迹于65℃杂交过夜，并用2×SSC、0.1％SDS室温洗涤一次，用1×SSC，0.1％SDS于65℃洗涤两次并用0.1×SSC、0.1％SDS于65℃洗涤一次。杂交的印迹用STORM 840 Phosphor imager(Molecular Dynamics)分析，在200微米扫描，并在Kodak storage phosphor screens GP(Moleculardynamics)曝光3天后以0-50的范围打印。
在图4中可以看出卵巢中估计长度约3kB的单一单带仅在卵巢中出现。在睾丸中检测不到信号，很可能是因为睾丸中的PAD6表达水平太低以至于无法在RNA印迹上检测。原位杂交分析确证了这些结果PAD6表达可以在所有类型的人卵泡和猴卵巢中检测到，并在这方面与小鼠中的原位杂交数据相似。通过原位杂交在睾丸中未检测到表达(数据未显示)。
实施例4人PAD6的表达和PAD6活性的测定克隆利用快速DNA连接试剂盒(Boehringer)将全长人PAD6克隆到细菌表达载体pGEX4T1(AP Biotech)中。重组构建体(pGEXhpPAD6)通过限制性内切酶消化来表征。
转化了pGEXhPAD6的大肠杆菌BL-21细胞在25℃生长于2×YT培养基中，直到细胞密度在650nm处达到1.0。加入0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷后，培养物在25℃再生长5小时。将细胞离心并重悬在0.1倍于原始培养液体积的20mM Tris-HCl，pH 7.6，1mMEDTA，并放置在冰上超声裂解。该超声裂解物在15000×g于4℃离心30分钟(Sorvall，SS34转头)并向上清中加入1M NaCl、0.1％TritonX-100和50％溶于PBS的谷胱甘肽-Sepharose 4B珠(PhannaciaBiotech，1ml相当于250ml原始培养液)，然后在4℃温和搅动下温育60分钟。该珠随之用10倍床体积的、含有20mM Tris-HCl pH 7.6，1mM EDTA，0.1％Triton X-100和0.1M NaCl的缓冲液室温下温和搅动5分钟洗涤3次。分几步利用溶于50mM Tris-Cl pH 8.0，0.1M NaCl和0.1％Triton X-100中的10-100mM还原谷胱甘肽在4℃温和搅动下洗脱30分钟将重组hPAD6-gst融合蛋白从珠中洗脱出来。洗脱液与10％甘油储存于-20℃用于测定酶活性。根据SDS PAGE分析，蛋白的纯度估计为90％。
PAD6酶活性的测定PAD的活性以大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)作为底物通过瓜氨酸的形成来测定。与原始STI相比，瓜氨酸化的STI不能抑制胰蛋白酶活性。所以，如用荧光胰蛋白酶底物所检测到的胰蛋白酶活性的增加指示了PAD活性。
为测PAD活性，终体积为20μl的反应混合物由100mM HEPES(pH 7.5)，5mM CaCl2，2mM DTT，0.17μg STI和一等份纯化的酶溶液[或者是GST-PAD6或者是商购的PAD(Sigma)，来源于兔肌]组成。该分析混合物37℃温育30分钟之后，相继加入10μl荧光底物N-α-苯甲酰-L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素[400μM，溶于100mMHEPES(pH 7.5)，50mM EDTA]和10μl胰蛋白酶溶液
。室温下在Victor V中直接开始荧光测量(激发360mn，发射460nm)，并持续1小时。
如图5中可看到的，PAD6活性能够被检测。
序列表<110>Akzo Nobel N.V.
<120>肽基精氨酸脱亚氨酶6<130>
<140>
<141>
<160>15<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>682<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>1Met Ser Phe Gln Asn Ser Leu Ser Leu Ser Leu Val Asn Pro Thr His1 5 10 15Ala Leu Cys Met Val Gly Met Glu Ile Thr Leu Asp Ile Ser Lys Cys20 25 30Ala Pro Asp Lys Cys Lys Ser Phe Thr Ile Arg Gly Ser Pro Arg Ile35 40 45Leu Ile His Ile Ser Ser Ser Val Ile Ala Gly Lys Glu Asp Thr Val50 55 60Val Trp Arg Ser Met Asn His Pro Thr Val Ala Leu Val Arg Met Val65 70 75 80Ala Pro Ser Pro Thr Val Asp Glu Asp Lys Val Leu Val Ser Tyr Phe85 90 95Cys Pro Asp Gln Glu Val Pro Tnr Ala Thr Ala Val Leu Phe Leu Thr100 105 110Gly Ile Glu Ile Ser Leu Glu Ala Asp Ile Tyr Arg Asp Gly Gln Leu115 120 125Asp Met Pro Ser Asp Lys Gln Ala Lys Lys Lys Trp Met Trp Gly Met130 135 140Asn Gly Trp Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Ser Pro Asn Ala Val
145 150 155 160Gly Gln Pro Asp Glu Gln Ser Phe Gln Glu Gly Pro Arg Glu Ile Gln165 170 175Asn Leu Ser Gln Met Asn Val Thr Val Glu Gly Pro Thr Ser Ile Leu180 185 190Gln Asn Tyr Gln Leu Ile Leu His Thr Ser Glu Glu Glu Ala Lys Lys195 200 205Thr Arg Val Tyr Trp Ser Gln Arg Gly Ser Ser Ala Tyr Glu Leu Val210 215 220Val Gly Pro Asn Lys Pro Val Tyr Leu Leu Pro Thr Phe Glu Asn Arg225 230 235 240Arg Lys Glu Ala Phe Tyr Val Glu Ala Thr Glu Phe Pro Ser Pro Ser245 250 255Phe Ser Gly Leu Ile Ser Leu Ser Leu Ser Leu Val Glu Lys Ala His260 265 270Asp Glu Cys Ile Pro Glu Ile Pro Leu Tyr Lys Asp Thr Val Met Phe275 280 285Arg Val Ala Pro Tyr Ile Phe Met Pro Ser Thr Gln Met Pro Leu Glu290 295 300Val Tyr Leu Cys Arg Glu Leu Gln Leu Gln Gly Phe Val Asp Ser Val305 310 315 320Thr Lys Leu Ser Glu Lys Ser Lys Val Gln Val Val Lys Val Tyr Glu325 330 335Asp Pro Asn Arg Gln Ser Lys Trp Leu Gln Asp Glu Met Ala Phe Cys340 345 350Tyr Thr Gln Ala Pro His Lys Thr Val Ser Leu Ile Leu Asp Thr Pro355 360 365Arg Val Ser Lys Leu Glu Asp Phe Pro Met Lys Tyr Thr Leu Thr Pro370 375 380Gly Ser Gly Tyr Leu Ile Arg Gln Thr Glu Asp His Arg Val Ala Ser385 390 395 400Leu Asp Ser Ile Gly Asn Leu Met Val Ser Pro Pro Val Lys Ala Gln405 410 415
Gly Lys Asp Tyr Pro Leu Gly Arg Val Leu Ile Gly Gly Ser Pha Tyr420 425 430Pro Ser Ser Glu Gly Arg Asp Met Asn Lys Gly Leu Arg Glu Phe Val435 440 445Tyr Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Glu Leu Phe Ser Asp Trp Leu450 455 460Met Thr Gly His Met Asp Gln Phe Met Cys Phe Val Pro Thr Asn Asp465 470 475 480Lys Asn Asn Asp Gln Lys Asp Phe Arg Leu Leu Leu Ala Ser Pro Ser485 490 495Ala Cys Phe Glu Leu Phe Glu Gln Lys Gln Lys Glu Gly Tyr Gly Asn500 505 510Val Thr Leu Phe Glu Asp Ile Gly Ala Glu Gln Leu Leu Ser Asn Gly515 520 525Arg Glu Ser Lys Thr Ile Ser Gln Ile Leu Ala Asp Lys Ser Phe Arg530 535 540Glu Gln Asn Thr Tyr Val Glu Lys Cys Ile Ser Leu Asn Arg Thr Leu545 550 555 560Leu Lys Thr Glu Leu Gly Leu Glu Asp Lys Asp Ile Ile Leu Ile Pro565 570 575Gln Leu Phe Cys Leu Glu Gln Leu Thr Asn Val Pro Ser Asn Gln Gln580 585 590Ser Thr Lys Leu Phe Ala Arg Pro Tyr Phe Pro Asp Met Leu Gln Ile595 600 605Ile Val Leu Gly Lys Asn Leu Gly Ile Pro Lys Pro Phe Gly Pro Lys610 615 620Ile Asn Gly Thr Cys Cys Leu Glu Glu Lys Val Cys Gly Leu Leu Glu625 630 635 640Pro Leu Gly Leu Lys Cys Thr Phe Ile Asp Asp Phe Asp Cys Tyr Leu645 650 655Ala Asn Ile Gly Asp Val Cys Ala Ser Ala Ile Ile Asn Arg Val Pro660 665 670
Phe Ala Phe Lys Trp Trp Lys Met Thr Pro675 680<210>2<211>2055<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>2cagccatgtc ttttcagaac tcactcagcc tgtctctggt caatcccacc catgccctct 60gcatggtagg catggaaatc accttggaca tcagcaagtg tgcaccagac aagtgcaagt 120ctttcaccat ccgtggttcc cccaggatct tgatccacat ctctagctcc gtcatcgctg 180gcaaagagga cactgtggtc tggaggtcaa tgaaccatcc cacagtggca ttggtgagga 240tggtggcgcc cagccccact gtggatgaag acaaggtgct ggtctcctac ttctgtcctg 300accaagaagt ccccacggcc acagctgtgc tgtttctcac cggcatcgag atctccctgg 360aggcagacat ctatcgagat ggacaactgg acatgccaag tgataagcaa gctaagaaaa 420aatggatgtg gggtatgaac ggctggggag ccatcctgct tgtgaattgt agccctaatg 480ctgtgggcca gcctgatgaa cagtcctttc aggagggccc cagagaaata cagaacctgt 540ctcagatgaa tgtaactgtg gagggcccca ccagcatcct acagaattac cagttgatcc 600tacatacctc cgaagaagag gcgaagaaga caagagtcta ctggtctcag agaggctcct 660ctgcgtatga actggtggtg ggacccaaca agcctgtcta tctcctgcct acctttgaga 720accgtaggaa agaggctttc tacgtagaag ccacggaatt cccatctccc agcttctcgg 780gcctgatctc cttgtcactc tccctagtag aaaaggctca cgacgagtgc atcccagaga 840ttccgctcta taaggataca gtgatgttcc gggtggcacc ttatatcttc atgcccagca 900cccagatgcc tctagaggtt tacctgtgca gggagctaca gctgcaaggc tttgtggact 960cagtgaccaa gctgagcgag aagagcaaag tgcaggtggt aaaggtctat gaggacccca 1020accgccagag caagtggctc caggacgaga tggctttctg ctatactcag gctcctcaca 1080agacggtgtc attgatcctt gacaccccaa gggtttccaa gctggaagac ttccccatga 1140aatacacact gacccctggc tctggctacc tgatccgaca aactgaggac caccgggtgg 1200ctagcctgga ttccatcggg aacctgatgg tatctccgcc tgtcaaggct cagggcaaag 1260actaccctct agggagggtc ctcattggtg gcagctttta ccccagctct gagggccggg 1320acatgaacaa gggcctgcga gaattcgtgt atgcccagca ggtgcaggcc cctgtggaac 1380tcttctcgga ctggctgatg accggtcaca tggatcaatt catgtgcttt gtccctacca 1440atgataaaaa caacgaccag aaggacttcc gcctgctgct ggccagcccc agtgcctgct 1500ttgagctgtt cgaacagaag cagaaggaag gctatgggaa cgtgaccctg tttgaagaca 1560ttggagcaga acagctcctt tctaatggga gggagagcaa aactatttcc caaatcctgg 1620ctgacaagag ttttcgagag cagaacacct atgttgagaa gtgtatcagc ctgaaccgca 1680ccctcctgaa gacagaactg ggattggagg acaaggacat catcctgatc ccgcagctct 1740tctgcctgga gcagctgacg aatgtcccct ccaaccagca gagcaccaaa ctcttcgcga 1800ggccgtactt ccccgacatg ctgcagataa tcgtgttggg caagaacctt ggaatcccca 1860agccctttgg gcccaaaatc aatggcacct gctgcctaga agagaaagtg tgtggattac 1920tggagcccct gggtctcaag tgcaccttca ttgatgattt tgactgctac ctggccaaca 1980taggggacgt ctgtgccagt gccatcataa acagggtgcc atttgcattc aagtggtgga 2040agatgacccc ataaa 2055<210>3
<211>686<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Ser Phe Gln Ser Ile Ile His Leu Ser Leu Asp Ser Pro Val His1 5 10 15Ala Val Cys Val Leu Gly Thr Glu Ile Cys Leu Asp Leu Ser Gly Cys20 25 30Ala Pro Gln Lys Cys Gln Cys Phe Thr Ile His Gly Ser Gly Arg Val35 40 45Leu Ile Asp Val Ala Asn Thr Val Ile Ser Glu Lys Glu Asp Ala Thr50 55 60Ile Trp Trp Pro Leu Ser Asp Pro Thr Tyr Ala Thr Val Lys Met Thr65 70 75 80Ser Pro Ser Pro Ser Val Asp Ala Asp Lys Val Ser Val Thr Tyr Tyr85 90 95Gly Pro Asn Glu Asp Ala Pro Val Gly Thr Ala Val Leu Tyr Leu Thr100 105 110Gly Ile Glu Val Ser Leu Glu Val Asp Ile Tyr Arg Asn Gly Gln Val115 120 125Glu Met Ser Ser Asp Lys Gln Ala Lys Lys Lys Trp Ile Trp Gly Pro130 135 140Ser Gly Trp Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asn Pro Ala Asp Val145 150 155 160Gly Gln Gln Leu Glu Asp Lys Lys Thr Lys Lys Val Ile Phe Ser Glu165 170 175Glu Ile Thr Asn Leu Ser Gln Met Thr Leu Asn Val Gln Gly Pro Ser180 185 190Cys Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Leu Val Leu His Thr Ser Lys Glu Glu195 200 205Ser Lys Lys Ala Arg Val Tyr Trp Pro Gln Lys Asp Asn Ser Ser Thr210 215 220Phe Glu Leu Val Leu Gly Pro Asp Gln His Ala Tyr Thr Leu Ala Leu225 230 235 240
Leu Gly Asn His Leu Lys Glu Thr Phe Tyr Val Glu Ala Ile Ala Phe245 250 255Pro Ser Ala Glu Phe Ser Gly Leu Ile Ser Tyr Ser Val Ser Leu Val260 265 270Glu Glu Ser Gln Asp Pro Ser Ile Pro Glu Thr Val Leu Tyr Lys Asp275 280 285Thr Val Val Phe Arg Val Ala Pro Cys Val Phe Ile Pro Cys Thr Gln290 295 300Val Pro Leu Glu Val Tyr Leu Cys Arg Glu Leu Gln Leu Gln Gly Phe305 310 315 320Val Asp Thr Val Thr Lys Leu Ser Glu Lys Ser Asn Ser Gln Val Ala325 330 335Ser Val Tyr Glu Asp Pro Asn Arg Leu Gly Arg Trp Leu Gln Asp Glu340 345 350Met Ala Phe Cys Tyr Thr Gln Ala Pro His Lys Thr Thr Ser Leu Ile355 360 365Leu Asp Thr Pro Gln Ala Ala Asp Leu Asp Glu Phe Pro Met Lys Tyr370 375 380Ser Leu Ser Pro Gly Ile Gly Tyr Met Ile Gln Asp Thr Glu Asp His385 390 395 400Lys Val Ala Ser Met Asp Ser Ile Gly Asn Leu Met Val Ser Pro Pro405 410 415Val Lys Val Gln Gly Lys Glu Tyr Pro Leu Gly Arg Val Leu Ile Gly420 425 430Ser Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Glu Gly Arg Ala Met Ser Lys Thr Leu435 440 445Arg Asp Phe Leu Tyr Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Glu Leu Tyr450 455 460Ser Asp Trp Leu Met Thr Gly His Val Asp Glu Phe Met Cys Phe Ile465 470 475 480Pro Thr Asp Asp Lys Asn Glu Gly Lys Lys Gly Phe Leu Leu Leu Leu485 490 495
Ala Ser Pro Ser Ala Cys Tyr Lys Leu Phe Arg Glu Lys Gln Lys Glu500 505 510Gly Tyr Gly Asp Ala Leu Leu Phe Asp Glu Leu Arg Ala Asp Gln Leu515 520 525Leu Ser Asn Gly Arg Glu Ala Lys Thr Ile Asp Gln Leu Leu Ala Asp530 535 540Glu Ser Leu Lys Lys Gln Asn Glu Tyr Val Glu Lys Cys Ile His Leu545 550 555 560Asn Arg Asp Ile Leu Lys Thr Glu Leu Gly Leu Val Glu Gln Asp Ile565 570 575Ile Glu Ile Pro Gln Leu Phe Cys Leu Glu Lys Leu Thr Asn Ile Pro580 585 590Ser Asp Gln Gln Pro Lys Arg Ser Phe Ala Arg Pro Tyr Phe Pro Asp595 600 605Leu Leu Arg Met Ile Val Met Gly Lys Asn Leu Gly Ile Pro Lys Pro610 615 620Phe Gly Pro Gln Ile Lys Gly Thr Cys Cys Leu Glu Glu Lys Ile Cys625 630 635 640Cys Leu Leu Glu Pro Leu Gly Phe Lys Cys Thr Phe Ile Asn Asp Phe645 650 655Asp Cys Tyr Leu Thr Glu Val Gly Asp Ile Cys Ala Cys Ala Asn Ile660 665 670Arg Arg Val Pro Phe Ala Phe Lys Trp Trp Lys Met Val Pro675 680 685<210>4<211>2092<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4tagcgtggag ggccgagcca tgtccttcca gagtatcatc cacctgtccc tggacagccc 60tgtccatgcc gtttgtgtgt tgggcacaga aatctgcttg gatctcagcg ggtgtgcccc 120ccagaagtgc cagtgcttca ccatccatgg ctctgggagg gtcttgatcg atgtggccaa 180cacggtgatt tctgagaagg aggacgccac catctggtgg cccctgtctg atcccacgta 240cgccacagtg aagatgacat cgcccagccc ttccgtggat gcggataagg tctcggtcac 300
atactatggg cccaacgagg atgcccccgt gggcacagct gtgctgtacc tcactggcat 360tgaggtctct ctagaggtag acatctaccg caatgggcaa gttgagatgt caagtgacaa 420acaggctaag aaaaaatgga tctggggtcc cagcggttgg ggtgccatcc tgcttgtgaa 480ttgcaaccct gctgatgtgg gccagcaact tgaggacaag aaaaccaaga aagtgatctt 540ttcagaggaa ataacgaatc tgtcccagat gactctgaat gtccaaggcc ccagctgtat 600cttaaagaaa tatcggctag tcctccatac ctccaaggaa gagtcgaaga aggcgagagt 660ctactggccc caaaaagaca actccagtac ctttgagttg gtgctggggc ccgaccagca 720cgcctatacc ttggccctcc tcgggaacca cttgaaggag actttctacg ttgaagctat 780agcattccca tctgccgaat tctcaggcct catctcctac tctgtgtccc tggtggagga 840gtctcaagac ccgtcaattc cagagactgt gctgtacaaa gacacggtgg tgttccgggt 900ggctccctgt gtcttcattc cctgtaccca ggtgcctctg gaggtttacc tgtgcaggga 960gctgcagctg cagggttttg tggacacagt gacgaagctg agtgagaaga gcaacagcca 1020ggtggcatct gtctatgagg accccaaccg cctgggcagg tggctccagg atgagatggc 1080cttctgctac acccaggctc cccacaagac aacgtccttg atcctcgaca cacctcaggc 1140cgccgatctc gatgagttcc ccatgaagta ctcactgagc cctggtattg gctacatgat 1200ccaggacact gaggaccata aagtggccag catggattcc attgggaacc tgatggtgtc 1260cccacctgtc aaggtccaag ggaaagagta cccgctgggc agagtcctca ttggcagcag 1320cttttacccc agcgcagagg gccgggccat gagtaagacc ctccgagact tcctctatgc 1380ccagcaggtc caagcgccgg tggagctcta ctcagattgg ctaatgactg gccacgtgga 1440tgagttcatg tgcttcatcc ccacagatga caagaatgag ggcaaaaagg gcttcctgct 1500gctcctggcc agccccagtg cctgctataa actgttccga gagaaacaga aggaaggcta 1560tggcgacgct cttctgtttg atgagcttag agcagatcag ctcctgtcta atggaaggga 1620agccaaaacc atcgaccaac ttctggctga tgaaagcctg aagaagcaga atgaatacgt 1680ggagaagtgc attcacctga accgtgacat cctgaagacg gagctgggcc tggtggaaca 1740ggacatcatc gagattcccc agctgttctg cttggagaag ctgactaaca tcccctctga 1800ccagcagccc aagaggtcct ttgcgaggcc atacttccct gacctgttgc ggatgattgt 1860gatgggcaag aacctgggga tccccaagcc ttttgggccc caaatcaagg ggacctgctg 1920cctggaagaa aagatttgct gcttgctgga gcccctgggc ttcaagtgca ccttcatcaa 1980tgactttgac tgttacctga cagaggtcgg agacatctgt gcctgtgcca acatccgccg 2040ggtgcccttt gccttcaaat ggtggaagat ggtaccttag acccaggccc ta 2092<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>5ttgacaccag accaactggt aatg 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>6ggtggcgacg actcctggag cccg 24<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>7gttttcccag tcacgac 17<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>8cgtcagctgc tccagcagaa20<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>9gatttaggtg acactatag 19<210>10
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>10gtgcggttca ggctgataca20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>11agcgtggagg gccgagccat g 21<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>12agggcctggg tctaaggtac catc 24<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>13ctgatgaccg gcacatggat20
<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>14ggcggttggg gtcctcatag20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明合成引物<400>15gccatcctgc ttgtgaattg20
权利要求
1.一种多核苷酸，包含编码肽基精氨酸脱亚氨酶6的核苷酸序列。
2.权利要求1的多肽，其是哺乳动物来源的，优选是人源的。
3.根据权利要求2的多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO3。
4.根据权利要求3的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO2的第6-2051位核苷酸或SEQ ID NO4的第20-2077位核苷酸。
5.根据权利要求3的多核苷酸，所述多核苷酸由SEQ ID NO2的第6-2051位核苷酸或SEQ ID NO4的第20-2077位核苷酸组成。
6.一种重组表达载体，包含根据权利要求1-5的多核苷酸。
7.一种多肽，由根据权利要求1-5的多核苷酸或根据权利要求6的表达载体编码。
8.一种由根据权利要求1-5的多核苷酸或根据权利要求6的表达载体转染的细胞。
9.根据权利要求8的细胞，它是表达根据权利要求7的多肽的稳定转染的细胞。
10.一种产生权利要求7的多肽的方法，该方法包括在可产生所述蛋白的条件下培养权利要求8的细胞，并从培养物中回收所述蛋白。
11.一种鉴定影响肽基精氨酸脱亚氨酶6的酶功能的化合物的方法，该方法包括步骤a)使所述肽基精氨酸脱亚氨酶6与含精氨酸的底物接触b)使所述混合物与测试化合物接触c)测量精氨酸到瓜氨酸的转化以及d)将所述转化与不存在测试化合物时的肽基精氨酸脱亚氨酶活性进行比较。
全文摘要
本发明提供了编码肽基精氨酸脱亚氨酶6的核苷酸序列。发现该基因仅表达于生殖腺中，并且可用作为雄性或雌性避孕的靶。其编码蛋白可用以筛选小分子量的酶活性调节剂。
文档编号C12Q1/34GK1571842SQ02809207
公开日2005年1月26日 申请日期2002年4月25日 优先权日2001年5月3日
发明者J·A·谷森, P·范顿布伽特 申请人:阿克佐诺贝尔公司