专利名称：免疫调节性多核苷酸及其使用方法
技术领域：
本发明涉及包含免疫刺激性寡核苷酸序列(ISS)的免疫调节性多核苷酸。本发明也涉及施用该多核苷酸来调节免疫应答。
背景技术：
针对感染或其它抗原性攻击所产生的免疫应答的类型通常可通过参与该应答的T辅助(Th)细胞亚群而区分。Th1亚群负责经典的细胞介导功能，如迟发型超敏反应和细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活化，而Th2亚群作为B细胞活化的辅助细胞更为有效。针对抗原的免疫反应类型通常受细胞因子影响，其中所述细胞因子由细胞响应抗原而产生。Th1和Th2细胞所分泌的细胞因子的不同被认为可以反映这两种亚群的不同生物功能。参见如Romagnani(2000)Ann.Allergy Asthma Immunol.859-18。
Th1亚群尤其适于响应病毒感染、胞内病原体和肿瘤细胞，因为该亚群分泌可活化CTL的IL-2和IFN-γ。Th2亚群更适于响应自由生活的细菌和肠道寄生虫并可介导变态反应，因为IL-4和IL-5已知可分别诱导IgE产生和嗜酸性粒细胞活化。总之，Th1和Th2细胞有不同的细胞因子分泌模式，故一类反应可调节另一类反应的活性。例如，Th1/Th2平衡的迁移可导致变态反应，或导致增强的CTL反应。
对于许多感染性疾病如结核病和疟疾，Th2-类反应几乎无针对感染的保护作用。提议使用衍生自靶抗原和其它目前所使用的抗原剂的小肽作为疫苗可避免使用具潜在感染性的完整病毒粒子，但这不总能引起达到治疗效果所需的免疫反应。缺乏有效治疗人免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗是这种失败的一个不幸例子。基于蛋白质的疫苗一般诱导Th2-类免疫反应，其特征在于高滴度的中和抗体但无显著的细胞介导的免疫。
而且，一些类型的抗体反应在某些适应征中是不合适的，最明显的是在变态反应中IgE抗体反应可导致过敏性休克。通常变态反应也涉及到Th2-类免疫反应。变态反应(包括变应性哮喘)的特征在于早期反应和晚期反应，其中早期反应发生在暴露变应原后的数秒至数分钟内且特征在于细胞脱粒，晚期反应发生在4至24小时后且特征在于嗜酸性粒细胞浸润变应原暴露位点。具体而言，在变态反应的早期，变应原与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的IgE抗体交联，结果引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒和接下来的组胺和其它炎症介质释放。在晚期反应期间，嗜酸性粒细胞浸润变应原暴露位点(在此处导致组织损伤和功能障碍)。
变应性疾病的抗原免疫治疗包括皮下注射小量，但渐增量的抗原。此类免疫治疗存在诱发IgE-介导的过敏反应的危险性并且不能有效解决晚期变应反应中细胞因子-介导的事件。因此至今，该方法只取得了有限的成功。
某些DNA序列(通常称作免疫刺激性序列或＂ISS＂)的施用可诱导偏向于Th1-类的免疫反应，这一点可通过Th1-相关细胞因子的分泌而说明。免疫刺激性多核苷酸与抗原一起施用能导致针对所施用抗原的Th1-类免疫反应。Roman等人(1997)自然医药(Nature Med.)3849-854。例如，皮内注射于盐水或佐剂明矾中的大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(β-Gal)的小鼠产生特异性IgG1和IgE抗体以及分泌IL-4和IL-5而非IFN-γ的CD4+细胞进行反应，表明这些T细胞主要为Th2亚群的。但是，皮内注射(或使用齿状皮肤抓涂器施与)编码β-Gal并含有ISS的质粒DNA(在盐水中)的小鼠产生IgG2a抗体和分泌IFN-γ而非IL-4和IL-5的CD4+细胞，表明这些T细胞主要为Th1亚群的。而且，注射质粒DNA的小鼠的特异性IgE产生降低66-75％。Raz等人(1996)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)935141-5145。总之，针对裸DNA的免疫反应的特征在于抗原刺激的CD4+T细胞产生IL-2、TNF-α和IFN-γ，这表明为Th1-类反应。在治疗变态反应和哮喘时这尤其重要，这一点通过减少的IgE产生即可证实。免疫刺激性多核苷酸刺激Th1-类免疫反应的能力已通过细菌抗原、病毒抗原和变应原得以证明(参见如WO 98/55495)。
其它描述ISS的参考文献包括Krieg等人(1989)免疫学杂志(J.Immunol.)1432448-2451；Tokunaga等人(1992)微生物免疫(Microbiol.Immunol.)3655-66；Kataoka等人(1992)日本癌研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)83244-247；Yamamoto等人(1992)免疫学杂志(JImmunol.)1484072-4076；Mojcik等人(1993)临床免疫和免疫病理(Clin.Immuno.and Immunopathol.)67130-136；Branda等人(1993)Biochem.Pharmacol.452037-2043；Pisetsky等人(1994)生命科学(LifeSci.)54(2)101-107；Yamamoto等人(1994a)反义研究和进展(AntisenseResearch and Development.)4119-122；Yamamoto等人(1994b)日本癌研究杂志(Jpn.J Cancer Res.)85775-779；Raz等人(1994)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)919519-9523；Kimura等人(1994)生物化学杂志(J.Biochem.)(Tokyo)1 16991-994；Krieg等人(1995)自然(Nature)374546-549；Pisetsky等人(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.772152-163；Pisetsky(1996a)免疫学杂志(J.Immunol.)156421-423；Pisetsky(1996b)免疫学(Immunity)5303-310；Zhao等人(1996)Biochem.Pharmacol.51173-182；Yi等人(1996)免疫学杂志(J.Immunol.)156558-564；Krieg(1996)微生物学趋势(Trends Microbiol.)4(2)73-76；Krieg等人(1996)反义核酸药物进展(Antisense Nucleic Acid Drug Dev.)6133-139；Klinman等人(1996)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)932879-2883；Raz等人(1996)；Sato等人(1996)科学(Science)273352-354；Stacey等人(1996)免疫学杂志(J Immunol.)1572116-2122；Ballas等人(1996)免疫学杂志(J Immunol.)1571840-1845；Branda等人(1996)实验与临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)128329-338；Sonehara等人(1996)干扰素和细胞因子研究杂志(JInterferon and Cytokine Res.)16799-803；Klinman等人(1997)免疫学杂志(J Immunol.)1583635-3639；Sparwasser等人(1997)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)271671-1679；Roman等人(1997)；Carson等人(1997)实验医学杂志(J.Exp.Med.)1861621-1622；Chace等人(1997)临床免疫和免疫病理(Clin.Immunol.and Immunopathol.)84185-193；Chu等人(1997)实验医学杂志(J.Exp.Med.)1861623-1631；Lipford等人(1997a)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)272340-2344；Lipford等人(1997b)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)273420-3426；Weiner等人(1997)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9410833-10837；Macfarlane等人(1997)免疫学(Immunology)91586-593；Schwartz等人(1997)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)10068-73；Stein等人(1997)反义技术(Antisense Technology)第11章，241-264页，C.Lichtenstein和W.Nellen编辑，IRL Press；Wooldridge等人(1997)血液(Blood)892994-2998；Leclerc等人(1997)细胞免疫(Cell.Immunol.)17997-106；Kline等人(1997)J.Invest.Med.45(3)282A；Yi等人(1998a)免疫学杂志(J.Immunol.)1601240-1245；Yi等人(1998b)免疫学杂志(J Immunol.)1604755-4761；Yi等人(1998c)免疫学杂志(J.Immunol.)1605898-5906；Yi等人(1998d)免疫学杂志(J.Immunol.)1614493-4497；Krieg(1998)实用反义寡核苷酸技术(Applied AntisenseOligonucleotide Technology)第24章，431-448页，C.A.Stein和A.M.Krieg编辑，Wiley-Liss，Inc.；Krieg等人(1998a)微生物学趋势(TrendsMicrobiol.)623-27；Krieg等人(1998b)免疫学杂志(J.Immunol.)1612428-2434；Krieg等人(1998c)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9512631-12636；Spiegelberg等人(1998)变态反应(Allergy)53(45S)93-97；Horner等人(1998)细胞免疫(Cell Immunol.)19077-82；Jakob等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)1613042-3049；Redford等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)1613930-3935；Weeratna等人(1998)反义与核酸药物进展(Antisense & Nucleic Acid Drug Development)8351-356；McCluskie等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)161(9)4463-4466；Gramzinski等人(1998)分子医学(Mol.Med.)4109-118；Liu等人(1998)血液(Blood)923730-3736；Moldoveanu等人(1998)疫苗(Vaccine)161216-1224；Brazolot Milan等人(1998)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9515553-15558；Briode等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)1617054-7062；Briode等人(1999)Int.Arch.Allergy ImmunoL 118453-456；Kovarik等人(1999)免疫学杂志(J.Immunol.)1621611-1617；Spiegelberg等人(1999)Pediatr.Pulmonol.Suppl.18118-121；Martin-Orozco等人(1999)Int.Immunol.111111-1118；EP 468,520；WO 96/02555；WO 97/28259；WO 98/16247；WO98/18810；WO 98/37919；WO 98/40100；WO 98/52581；WO 98/55495；WO98/55609和WO 99/11275。也参见Elkins等人(1999)免疫学杂志(J.Immunol.)1622291-2298，WO 98/52962，WO 99/33488，WO 99/33868，WO 99/51259和WO 99/62923。也参见Zimmermann等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)1603627-3630；Krieg(1999)微生物学趋势(TrendsMicrobiol.)764-65以及美国专利号5,663,153、5,723,335和5,849,719。也参见Liang等人(1996)J.Clin.Invest.981119-1129；Bohle等人(1999)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)292344-2353和WO 99/56755。也参见WO 99/61056；WO 00/06588；WO 00/16804；WO 00/21556；WO00/54803；WO 00/61151；WO 00/67023；WO 00/67787和美国专利号6,090,791。也参见Manzel等人(1999)反义核酸药物进展(Antisense Nucl.Acid Drug Dev.)9459-464；Verthelyi等人(2001)免疫学杂志(J.Immunol.)1662372-2377；WO 01/15726；WO 01/12223；WO 01/22972；WO 01/22990；WO 01/35991；WO 01/51500；WO 01/54720；美国专利号6,174,872、6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116。
ISS通常包括CG序列。ISS中CG侧翼的核苷酸也似乎在该多核苷酸的免疫调节活性中起作用。仍需要继续鉴定ISS以用于免疫调节性多核苷酸中。
此处引用的所有专利、专利申请和出版物全部并入本文作为参考。
本发明的公开本发明涉及免疫刺激性序列(ISS)、包含ISS的免疫调节性多核苷酸以及使用这些多核苷酸调节个体尤其是人的免疫反应的方法。
在一个方面，本发明提供了包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫调节性多核苷酸。在某些实施方案中，本发明包括含有本发明的免疫调节性多核苷酸和可药用赋形剂的组合物。
在一个方面，本发明的免疫调节性多核苷酸包含含有式5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)的序列的ISS，式中X1为T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2为T、G、A或U，X3为T、A或C，X4为T、G或U且该式不为5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
在另一方面，本发明的免疫调节性多核苷酸包含含有式5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)的序列的ISS，式中Z为5-溴胞嘧啶，X1为T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2为T、G、A或U，X3为T、A或C，X4为T、G或U且该式不为5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66；Z＝5溴胞嘧啶)。
在另一方面，本发明的免疫调节性多核苷酸包含至少一个如下序列TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)，GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)，CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)，ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)和GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，其中Z为5-溴胞嘧啶。
在另一方面，相对于此处公开的任何ISS，本发明的免疫调节性多核苷酸还可包含一个或多个TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，优选地位于ISS的5′(或上游)。
在另一方面，相对于此处公开的任何ISS，本发明的免疫调节性多核苷酸还可包含一个或多个TCGA和/或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
在另一方面，本发明的免疫调节性多核苷酸是经稳定化处理的。
在另一方面，本发明提供了免疫调节性多核苷酸/微载体复合体，其包含本发明的免疫调节性多核苷酸和与之连接的微载体，特别是尺寸小于10μm的微载体。
在另一方面，本发明提供了包含此处描述的任何免疫调节性多核苷酸(包括与微载体复合的免疫调节性多核苷酸)的组合物。组合物也可包含如可药用赋形剂或许多其它组分中的任一种，如抗原。
在另一方面，本发明提供了调节个体免疫反应的方法，包括将本发明的免疫调节性多核苷酸以足以调节所述个体的免疫反应的量施与该个体。根据本发明方法的免疫调节可在个体身上应用，其中所述个体包括那些患有Th2-类免疫反应相关疾病(如变态反应或变态反应-诱导的哮喘)的个体，接受疫苗如治疗性疫苗(如包含变态反应表位、分枝杆菌(mycobacterial)表位或肿瘤相关表位的疫苗)或预防性疫苗的个体，患有癌症的个体，以及患有感染性疾病的个体。
在再一方面，本发明提供了增加个体的γ-干扰素(IFN-γ)(或刺激个体的IFN-γ水平(或量))的方法，包括将有效量的本发明免疫调节性多核苷酸施与个体。本发明免疫调节性多核苷酸的施用可提高个体的IFN-γ。这些方法的合适受试者包括那些可从IFN-γ升高而受益的个体，或患有特发性肺纤维化(IPF)、硬皮病、辐射引发的皮肤纤维化、肝纤维化(包括血吸虫病引发的肝纤维化)、肾纤维化以及其它可通过施用IFN-γ而改善的疾病的个体。
在再一方面，本发明提供了提高个体的α-干扰素(IFN-α)(或刺激个体的IFN-α水平(或量))的方法，包括将有效量的本发明免疫调节性多核苷酸施与个体。本发明免疫调节性多核苷酸的施用可提高个体的IFN-α。这些方法的合适受试者包括那些患有病毒感染以及其它可通过施用IFN-α或提高IFN-α的量而改善的疾病的个体。
在另一方面，本发明提供了改善感染性疾病的一种或多种症状的方法，其包括将有效量的本发明免疫调节性多核苷酸施与患有感染性疾病的个体。本发明免疫调节性多核苷酸的施用可改善感染性疾病的一种或多种症状。可根据本发明治疗的感染性疾病包括由于细胞病原体引起的感染性疾病(如分枝杆菌病、疟疾、利什曼病、弓形体病、血吸虫病或支睾吸虫病)，并且可包括或不包括病毒性疾病。
本发明还涉及试剂盒，优选地用于实施本发明方法的试剂盒。本发明的试剂盒通常包含本发明的免疫调节性多核苷酸(通常在合适的容器中)，并且还可包含例如当个体患有Th2-类免疫反应相关疾病(如变态反应或变态反应-诱导的哮喘)，当个体接受疫苗如治疗性疫苗(如包含变态反应表位、分枝杆菌表位或肿瘤相关表位的疫苗)或预防性疫苗，当个体患有癌症或患有感染性疾病时使用免疫调节性多核苷酸对个体进行免疫调节的说明书。还可提供其它合适的说明。
实施本发明的方式我们发现了包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫调节性多核苷酸以及使用这些免疫调节性多核苷酸调节个体尤其是人的免疫反应的方法。本发明的组合物包含含有此处所述的ISS的免疫调节性多核苷酸。本发明的某些免疫调节性多核苷酸还包括至少一个TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列。在一些免疫调节性多核苷酸中，该额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列通过将T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而产生。我们发现包含特异性ISS的免疫调节性多核苷酸可以有效地调节免疫细胞，包括人细胞。我们的发现尤其令人感兴趣，因为人细胞对免疫调节性多核苷酸的免疫调节作用较来自常用实验动物如小鼠的细胞更具抵抗性。我们也观察到本发明的一些多核苷酸能有效地刺激IFN-α，甚至在人细胞中也是如此。
本发明也提供了通过向个体施用本发明的免疫调节性多核苷酸来调节个体免疫反应的方法。
本发明还提供了包含本发明的含有ISS的多核苷酸的试剂盒。这些试剂盒还可包含施用本发明免疫调节性多核苷酸对个体进行免疫调节的说明书和免疫调节性多核苷酸。
一般技术本发明的实践除非另有说明，均采用本领域内常规的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在文献中有充分的说明，如分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编辑1984)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编辑，1987)；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir&C.C.Blackwell编辑)；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene TransferVectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987)；分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；PCR聚合酶链反应(PCRThe PolymeraseChain Reaction)，(Mullis等人编辑，1994)；免疫学最新技术(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等人编辑，1991)；免疫试验手册(The Immunoassay Handbook)(D.Wild编辑，Stockton Press NY，1994)；生物结合技术(Bioconjugate Techniques)(Greg T.Hermanson编辑，Academic Press，1996)；以及免疫学分析方法(Methods of ImmunologicalAnalysis)(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines编辑，WeinheimVCH Verlags gesellschaft mbH，1993)。
定义本文中，除非另外指出，单数形式的＂a＂，＂an＂和＂the＂包括复数形式。如＂an＂ISS包括一个或多个ISS。
本文中可互换使用的术语＂多核苷酸＂和＂寡核苷酸＂包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)、修饰的寡核苷酸和寡核苷或其组合。寡核苷酸可为线形或环状构型，或寡核苷酸可同时包含线形和环状区段。寡核苷酸为核苷的聚合物，其中核苷通常通过磷酸二酯键连接，但在寡核苷酸中也可使用其它的键接如硫代磷酸酯。核苷由与糖键接的嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或它们的衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或它们的衍生物)碱基组成。在DNA中这四种核苷单元(或碱基)称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。核苷酸为核苷的磷酸酯。
术语＂ISS＂如此处所用是指实现体外、体内和/或离体测定中可测量的免疫反应和/或对其有贡献的多核苷酸序列。可测量的免疫反应的实例包括但不限于抗原特异性抗体的产生、细胞因子分泌、淋巴细胞群如NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞等的活化或扩增。优选地，ISS序列优先活化Th1-类反应。本发明中使用的多核苷酸包含至少一个ISS。如此处所用，＂ISS＂也是含有ISS的多核苷酸，包括本发明的含有ISS的免疫调节性多核苷酸的缩写术语。
术语＂3通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一个区域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的3′(下游)。
术语＂5通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一个区域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的5′(上游)。
＂邻近＂另一序列的区域、部分或序列直接与那个区域、部分或序列毗连。例如，免疫调节性多核苷酸中邻近ISS部分的其它多核苷酸序列直接与那个区域毗连。
术语＂免疫调节性多核苷酸＂或＂IMP＂或＂含有ISS的多核苷酸＂如此处所用，是指包含至少一个ISS的多核苷酸。在某些实施方案中，IMP为ISS。
术语＂免疫调节的＂或＂调节免疫反应的＂如此处所用包括免疫刺激和免疫抑制作用。免疫调节主要是在总体免疫反应中质的改变，虽然量的改变也可与免疫调节相连而发生。根据本发明受到免疫调节的免疫反应将朝向＂Th1-类＂免疫反应转移而背离＂Th2-类＂免疫反应。Th1-类反应一般被认为是细胞免疫体系的(如细胞毒淋巴细胞)反应，而Th2-类反应通常为＂体液的＂，或基于抗体的反应。Th1-类免疫反应通常的特征在于对抗原的＂迟发型超敏＂反应，并可在生物化学水平通过Th1-相关细胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-12、TNF-β及IL-6水平的上升而检测到，虽然IL-6也可与Th2-类反应相关。Th1-类免疫反应通常与细胞毒淋巴细胞(CTL)的产生和低水平或短暂的抗体产生相关。Th2-类免疫反应通常与较高水平的抗体产生(包括IgE产生)、无或极少的CTL产生和Th2相关细胞因子如IL-4的表达有关。因此，本发明的免疫调节作用可通过例如本发明方法治疗的个体与未治疗的个体相比IFN-γ的升高和/或IgE产生的降低而认知。
术语＂偶联物＂是指含有ISS的多核苷酸与抗原连接的复合体。此类偶联物的连接包括共价和/或非共价连接。
术语＂抗原＂是指被抗体或被T细胞抗原受体特异性识别并结合的物质。抗原可包括肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合糖、糖类、神经节苷脂、脂类和磷脂；其部分和其组合。抗原可为自然中存在的抗原或可为合成的。适于与ISS一起施用的抗原包括任何可引发B细胞或T细胞抗原特异性反应的分子。优选地，抗原引发特异针对该抗原的抗体反应。半抗原包括在＂抗原＂的范围内。半抗原为本身无免疫原性的低分子量化合物，但当它与含抗原决定簇的免疫原性分子偶联时产生免疫原性。小分子可能需要被半抗原化以产生抗原性。优选地，本发明的抗原包括肽、脂类(如固醇类、脂肪酸和磷脂)、多糖(如在流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)疫苗中使用的多糖)、神经节苷脂和糖蛋白。
＂佐剂＂是指这样的物质，当其加入免疫原性剂如抗原中时可非特异增强或加强受者宿主暴露于该混合物后对该免疫原性剂的免疫反应。
术语＂肽＂为具有足以实现生物反应如抗体产生或细胞因子活性的长度和组成的多肽，而不管该肽是否为半抗原。一般，肽长至少为6个氨基酸残基。术语＂肽＂还包括修饰的氨基酸(天然或非天然存在的)，此类修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化(pegylation)、脂化和甲基化。
＂抗原肽＂可包括纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、粗蛋白提取物、减毒或灭活病毒、细胞、微生物、或此类肽的片段。＂抗原肽＂或＂抗原多肽＂因此指显示出一种或多种抗原特性的全部或部分多肽。这样，如＂Amba1抗原多肽＂或＂Amba1多肽抗原＂为来自Amba1的显示抗原特性(即特异性结合抗体或T细胞受体)的氨基酸序列，不管其是否为全长序列、序列的一部分和/或序列的修饰物。
＂递送分子＂或＂递送载体＂为利于、允许和/或增加免疫调节性多核苷酸递送至特定位点和/或在特定时间递送的化学部份。递送载体可以或不可以额外刺激免疫反应。
＂针对抗原的变态反应＂是指这样的免疫反应，其通常的特征在于产生嗜酸性粒细胞和/或抗原特异性IgE以及它们所导致的作用。如本领域熟知的那样，IgE结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受体。当随后暴露于IgE所识别的抗原时，该抗原将与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE交联，引起这些细胞脱粒，包括但不限于释放组胺。应了解并认识到在本发明一些方法的应用中，术语＂针对抗原的变态反应＂、＂变态反应＂和＂变应性疾病＂同等地适用。而且，应了解并认识到本发明的方法包括那些同样适用于防止变态反应及治疗已存在的变应性疾病的方法。
如此处所用，术语＂变应原＂是指暴露于受试者后可引起变态反应的抗原或分子的抗原性部分，通常为蛋白质。一般地受试者如通过水疱和潮红试验或任一本领域已知的方法所指出的那样对变应原具变应性。即使受试者中只有少数亚群在暴露于分子后显示出变应性(例如IgE)免疫反应，该分子也被称为变应原。许多分离的变应原为本领域公知。它们包括但不限于此处表1中所提供的变应原。
术语＂脱敏＂是指给显示出敏感性的受试者施用渐增剂量的变应原的方法。用于脱敏的变应原剂量的实例为本领域公知，参见如Fornadley(1998)Otolaryngol.Clin.North Am.31111-127。
＂抗原特异的免疫治疗＂是指涉及到抗原并可对免疫反应产生抗原特异性调节的任何免疫治疗形式。在变态反应中，抗原特异性免疫治疗包括但不限于脱敏治疗。
术语＂微载体＂是指不溶于水的微粒组合物，其尺寸小于约150、120或100μm，优选地小于约50-60μm，优选地小于约10μm，优选地小于约5、2.5、2或1.5μm。微载体包括＂毫微载体＂，其为尺寸小于约1μm，优选地小于约500nm的微载体。微载体包括固相粒子如由生物相容的天然聚合物、合成聚合物或合成共聚物形成的粒子，但此处定义的微载体及其它本领域公知的可生物降解材料可包括或不包括由琼脂糖或交联琼脂糖形成的微载体。用于本发明的微载体可以为可生物降解的或不可生物降解的。不可生物降解的固相微载体由在哺乳动物生理条件下不易蚀的和/或不可降解的聚合物或其它材料形成，如聚苯乙烯、聚丙烯、硅石、陶瓷、聚丙烯酰胺、金、胶乳、羟基磷灰石、葡聚糖以及铁磁性和顺磁性材料。可生物降解的固相微载体可由在哺乳动物生理条件下可降解的聚合物(如聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)及其共聚物)或易蚀的聚合物(例如，聚(原酸酯如3，9-二亚乙基-2，4，8，10-四氧杂螺[5.5]十一烷(DETOSU))，或聚(酐类)如癸二酸的聚(酐类))形成。微载体也可为液相(例如，基于油或酯的液相)，如脂质体、无抗原的iscom(免疫刺激复合体，其为胆固醇、磷脂和具有佐剂活性的皂甙的稳定复合体)或在水包油或油包水乳液中的微滴或微胶粒。可生物降解的液相微载体通常掺入可生物降解的油，它们中的一些为本领域公知，包括鲨烯和植物油。微载体一般为球状，但偏离球状的微载体也是可接受的(如椭圆形、棒状等)。鉴于微载体的不可溶性(相对于水)，它们可从水和基于水的(含水的)溶液中过滤出来。
术语＂不可生物降解的＂如此处所用是指在正常的哺乳动物生理条件下不被降解或腐蚀的微载体。通常，如果微载体在正常的人血清中37℃孵育72小时后不被降解(即其质量或平均聚合物长度的损失小于5％)，则认为它不可生物降解。
如果微载体在正常的哺乳动物生理条件下可降解或易蚀，则认为它是＂生物可降解的＂。通常，如果微载体在正常的人血清中37℃孵育72小时后被降解(即其质量或平均聚合物长度至少损失5％)，则认为它可生物降解。
微载体的＂尺寸＂通常为厂商所陈述的粒子的＂设计尺寸＂或预期尺寸。尺寸可直接测定如测定平均或最大直径，或通过间接试验如过滤筛选试验测定。微载体尺寸的直接测定一般通过显微镜及与已知大小的粒子比较或参照测微计而实施，其中所述显微镜通常为光学显微镜或扫描电镜(SEM)。由于微载体在生产过程中在尺寸上可产生小的差异，因此当实测值显示为声明的测量值的约±5-10％时，认为微载体具有所述大小。尺寸特征也可通过动态光散射或暗化技术测定。另外，微载体的尺寸也可通过过滤筛选试验测定。如果至少97％的粒子能通过具有所述大小的＂筛式＂滤器(即滞留粒子位于滤器表面的滤器，如聚碳酸酯或聚醚砜滤器，它们不同于将滞留粒子容纳于滤器内的＂深度滤器＂)，则微载体小于所述大小。如果至少约97％的微载体粒子被具有所述大小的筛式滤器滞留，则微载体大于所述大小。这样，至少约97％的尺寸为约10μm至约10nm的微载体能通过10μm孔的筛式滤器而被10nm筛式滤器滞留。
如上述讨论中所指出的，谈到微载体尺寸或尺寸范围时隐含包括所述尺寸和/或尺寸范围的近似变异值和近似值。当谈及尺寸和/或尺寸范围时，术语“约”的使用反应了这一点，并且当谈及尺寸或尺寸范围时没提及“约”并不指该尺寸和/或尺寸范围是精确的。
术语＂免疫调节性多核苷酸/微载体复合体＂或＂IMP/MC复合体＂是指含有ISS的多核苷酸和微载体的复合体。复合体的组分可共价或非共价连接。非共价连接可通过任何非共价结合力介导，包括疏水作用、离子(静电)键、氢键和/或范德华引力。当为疏水连接时，该连接通常通过与IMP共价连接的疏水部分(如胆固醇)来实现。
＂个体＂为脊椎动物，如鸟，并优选为哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于人、灵长类、农畜、体育用动物、啮齿动物和宠物。
物质的＂有效量＂或＂足够量＂是足以实现有益或所需结果(包括临床结果)的量，因而＂有效量＂取决于应用它的上下文。在施用可调节针对共施用抗原的免疫反应的组合物的上下文中，免疫调节性多核苷酸和抗原的有效量为足以实现调节的量，其中所述调节是与单独施用抗原时所达到的免疫反应相比而言的。有效量可在一次施用或多次施用中施与。
术语＂共施用＂如此处所用是指在足够接近的时间内施用至少两种不同的物质以调节免疫反应。优选地，共施用是指同时施用至少两种不同的物质。
＂刺激＂反应或参数包括引起和/或增强该反应或参数。例如＂刺激＂免疫反应如Th1反应是指增强该反应，这可通过引发该反应和/或增强该反应产生。同样地，＂刺激＂细胞因子或细胞类型(如CTL)是指细胞因子或细胞类型的量或水平的升高。
＂与IgE相关的疾病＂为生理学疾病，其特征部分在于升高的IgE水平，这可为持续性的或可为非持续性的。IgE相关疾病包括但不限于变态反应和变应性反应、变态反应相关疾病(如下所述)、哮喘、鼻炎、结膜炎、风疹、休克、膜翅目昆虫叮咬引起的变态反应和药物变态反应、以及寄生虫感染。该术语也包括这些疾病的相关表现。通常，在此类疾病中IgE为抗原特异的。
＂变态反应相关疾病＂是指由抗原特异性IgE免疫反应的结果导致的疾病。此类结果可包括但不限于低血压和休克。过敏反应是变态反应相关疾病的一个例子，在过敏反应期间，组胺释放入循环，引起血管舒张及毛细血管通透性增加，结果导致循环中血浆的显著丢失。过敏反应可为全身性发生，整个身体都经历相关的影响，也可为局部发生，反应局限于特异的靶组织或器官。
术语＂病毒性疾病＂如此处所用是指病毒作为致病因子的疾病。病毒性疾病的实例包括乙型肝炎、丙型肝炎、流感、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和带状疱疹。
如此处所用及本领域所熟知的，＂治疗＂为用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。为了本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定(即不加重)疾病的状态、防止疾病的扩散、延迟或减慢疾病进程、改善或缓和疾病状态、以及缓解(部分或全部)疾病，无论其是可检测的或是不可检测的。＂治疗＂也可指与不接受该治疗时的预期存活期相比延长存活。
疾病的＂减轻＂是指与不治疗该疾病相比，疾病或病状的程度和/或不想要的临床表现得以减轻和/或疾病进展的时程减慢或延长。尤其在变态反应中，正如本领域技术人员熟知的，减轻可在调节针对变应原的免疫反应后发生。而且，减轻不一定会在施用一剂后发生，它往往在施用一连串的剂量后产生。因此，足以减轻反应或疾病的量可一次或多次施用。
通过施用免疫调节性多核苷酸和抗原“引发”的＂抗体效价＂或＂抗体量＂是指施用免疫调节性多核苷酸和抗原后在某一时间点测定到的特定抗体的量。
＂Th1相关抗体＂为其产生和/或增高与Th1免疫反应相关的抗体。如IgG2a为小鼠Th1相关抗体。为了本发明目的，Th1相关抗体的测定可为对一种或多种此类抗体的测定。如对人而言，Th1相关抗体的测定可能需要对IgG1和/或IgG3进行测定。
＂Th2相关抗体＂为其产生和/或增高与Th2免疫反应相关的抗体。如IgG1为小鼠Th2相关抗体。为了本发明目的，Th2相关抗体的测定可为对一种或多种此类抗体的测定。如对人而言，Th2相关抗体的测定可能需要对IgG2和/或IgG4进行测定。
＂抑制＂或＂阻止＂功能或活性如细胞因子产生、抗体产生或组胺释放是指与除了目标条件或参数外的其它相同条件比较或备选地与另一条件比较时功能或活性的降低。例如，与如仅用抗原时诱导的组胺释放相比，抑制组胺释放的包含免疫调节性多核苷酸和抗原的组合物可减少组胺释放。作为另一实例，与如仅用抗原时产生的抗体的程度和/或水平相比，抑制抗体产生的包含免疫调节性多核苷酸和抗原的组合物可降低抗体的程度和/或水平。
如此处所用，术语＂包含＂及其同族术语取它们包括在内的意思，即等同于术语＂包括＂及其相应的同族词。
本发明的组合物本发明提供了用于调节个体免疫反应的免疫刺激性序列(ISS)和免疫调节性多核苷酸(IMP)。每一免疫调节性多核苷酸包含至少一个免疫刺激性序列(ISS)。
本发明的组合物可以仅包含免疫调节性多核苷酸(或两种或多种免疫调节性多核苷酸的组合)，或可以包含免疫调节性多核苷酸与另一免疫调节剂如肽、抗原(见下述)和/或其它佐剂的联合。本发明的组合物可包含免疫调节性多核苷酸和可药用赋形剂。可药用赋形剂，包括缓冲剂，为本领域熟知。RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，MackPublishing(2000)。
包含抗原、本发明的免疫调节性多核苷酸和任选地佐剂的组合物在施用后，可导致针对抗原的免疫反应增强，并由此较仅包含ISS和抗原的组合物导致增强的免疫反应。佐剂为本领域公知，其包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、明矾(铝盐)、脂质体和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合适的佐剂还包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝杆菌细胞壁制品、单磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、QuilA、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈及衍生物、及免疫刺激复合物(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344873-875中描述的那些免疫刺激复合物、以及基于脂的佐剂和此处描述的其它佐剂。对于兽用及在动物体内产生抗体，可使用弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)的促有丝分裂成分。
本发明含有ISS的多核苷酸可与其它的治疗结合来治疗特定的适应征。例如，除了包含含有ISS的多核苷酸外，本发明的组合物也可包含抗疟疾药如氯喹用于疟疾患者、包含杀利什曼原虫药如戊烷脒和/或别嘌呤醇用于利什曼病患者、包含抗分枝杆菌药如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇用于结核病患者、包含变应原脱敏剂用于特应性(变态反应)患者。
如此处所述，本发明的组合物可包括含有ISS的多核苷酸并还可包括一种或多种其它的免疫治疗剂(即通过免疫系统起作用的试剂和/或来自免疫系统的试剂)，其中所述免疫治疗剂包括但不限于细胞因子、佐剂和抗体。治疗性抗体的实例包括在癌症中使用的抗体(如抗肿瘤抗体)，如下所述。
免疫调节性多核苷酸根据本发明，免疫调节性多核苷酸包含至少一个ISS，并可包含多个ISS。在多核苷酸中多个ISS可相互邻近，或被其它核苷酸碱基分开，或相重叠。在某些实施方案中，免疫调节性多核苷酸由ISS组成。
ISS在本领域已有描述，且ISS易于用指示免疫反应各方面(如细胞因子分泌、抗体产生、NK细胞活化和T细胞增殖)的标准试验来鉴定。参见如WO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Krieg等人(1995)自然(Nature)374546-549；Yamamoto等人(1992a)；Ballas等人(1996)；Klinman等人(1997)；Sato等人(1996)；Pisetsky(1996a)；Shimada等人(1986)日本癌研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)77808-816；Cowdery等人(1996)免疫学杂志(J.Immunol.)1564570-4575；Roman等人(1997)；Lipford等人(1997a)；WO 98/55495和WO 00/61151。因此，这些及其它方法可用于鉴定、试验和/或证实含有ISS的免疫调节性多核苷酸。
ISS可为大于10个碱基或碱基对的任何长度，优选地长度大于15个碱基或碱基对，更优选地长度大于20个碱基或碱基对，且通常包含5′-胞嘧啶、鸟嘌呤-3′序列。
如此处所清楚表达的，应理解对于此处描述的式子，任何和所有参数都是独立地选择的。例如，如果x＝0-2，则可独立地选择y，而不用管x(或式中任何其它可选择的参数)的值。
在一些实施方案中，ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)其中X1为T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2为T、G、A或U，X3为T、A或C，X4为T、G或U且其中ISS不为5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
在一些实施方案中，ISS包括如下任一序列TGAACGUTCG(SEQ IDNO67)；TGACCGTTCG(SEQ ID NO68)；TGATCGGTCG(SEQ IDNO69)；TGATCGTTCG(SEQ ID NO70)；TGAACGGTCG(SEQ IDNO71)；GTAACGTTCG(SEQ ID NO72)；GTATCGGTCG(SEQ IDNO73)；GTACCGTTCG(SEQ ID NO74)；GAACCGTTCG(SEQ IDNO75)；ZGACCGTTCG(SEQ ID NO76)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)；CGACCGTTCG(SEQ ID NO78)；ZGAACGTTCG(SEQ ID NO79)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；TTAACGUTCG(SEQ ID NO80)；TUAACGUTCG(SEQ ID NO81)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO82)。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含序列5′-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO1)。
在其它实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含如下任一序列5′-TGACTGTGAACGUTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO2)；5′-TCGTCGAUCGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO3)；5′-TCGTCGAUCGTTCGTUAACGUTCG-3′(SEQ ID NO4)；5′-TCGTCGUACGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO5)；5′-TCGTCGAXCGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO6)，其中X＝2-氨基-腺嘌呤；5′-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO7)；5′-TGACTGTGAACGUTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO8)；5′-TGACTGTGACCGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO9)；5′-TGACTGTGATCGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO10)；5′-TCGTCGAACGTTCGTT-3′(SEQ ID NO11)；
5′-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO12)；5′-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO13)；5′-CTTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO14)；5′-CTGTGATCGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO15)；5′-TGACTGTGAACGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO16)；5′-TCGTCGGTACCGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO17)；5′-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO18)；5′-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO19)；5′-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO20)；5′-TGACTGTGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO21)；5′-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO22)；5′-TZGTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO23)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO24)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTCGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO25)；5′-TZGTZGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO26)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTZGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO27)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO28)；5′-CTTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO29)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；.
5′-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO30)；5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3′(SEQ ID NO132)。
在一些实施方案中，本发明免疫调节性多核苷酸的ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)其中Z为5-溴胞嘧啶，X1为T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2为T、G、A或U，X3为T、A或C，X4为T、G或U且其中ISS不为5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66；Z＝5-溴胞嘧啶)。
在一些实施方案中，ISS包括如下任一序列(其中Z为5-溴胞嘧啶)TGAAZGUTCG(SEQ ID NO83)，TGACZGTTCG(SEQ ID NO84)，TGATZGGTCG(SEQ ID NO85)，GTATZGGTCG(SEQ ID NO86)，GTACZGTTCG(SEQ ID NO87)，GAACZGTTCG(SEQ ID NO88)，GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，ZGACZGTTCG(SEQ ID NO90)，CGAAZGTTCG(SEQ ID NO91)，ZGAAZGTTCG(SEQ ID NO92)，ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)，TTAAZGUTCG(SEQ ID NO94)，TUAAZGUTCG(SEQ ID NO95)和TTAAZGTTCG(SEQ ID NO96)。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含如下任一序列(其中Z为5-溴胞嘧啶)5′-TGACTGTGAAZGUTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO31)；5′-TCGTCGAAZGTTCGTTAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO32)；5′-TGACTGTGAAZGUTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO33)；5′-TGACTGTGAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO34)；5′-TCGTCGGAAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO35)；5′-TCGTZGAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO36)。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸的ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO133)其中X1为T、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2为T、G、A或U，X3为T、A或C，X4为T、G或U且其中该式不为5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)。
在其它实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含如下任一序列(其中Z为5-溴胞嘧啶)5′-TGACTGTGAAZGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO37)；5′-TGACTGTGAAZGTTZGAGATGA-3′(SEQ ID NO38)；5′-TGACTGTGAAZGTTCCAGATGA-3′(SEQ ID NO39)；
5′-TGACTGTGAACGTUCGAGATGA-3′(SEQ ID NO40)；5′-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO41)，其中X＝5-溴尿嘧啶；5′-TGACTGTGAAZGTTCGTUATGA-3′(SEQ ID NO42)；5′-TGACTGTGAAZGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO43)；5′-CTGTGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO44)；5′-TZGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO45)；5′-TCGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO46)；5′-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO47)，其中X＝4-硫代胸腺嘧啶；5′-TGACTGTGAACXTTCXAGATGA-3′(SEQ ID NO48)；其中X＝6-硫代鸟嘌呤；5 ′-TGACTGTGAACGTTCGTUATGA-3′(SEQ ID NO49)；5′-TGACTGTGAACGTTCGTTATGA-3′(SEQ ID NO50)；5′-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO51)；5′-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO52)；5′-CTGTCAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO53)；5′-TCGTCGGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO55)；5′-TCGTCGGACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO56)；5′-TCGTCGTACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO57)；5′-TCGTCGTTCGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO58)。
在一些实施方案中，相对于此处公开的任何ISS，免疫调节性多核苷酸还可包含一个或多个TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，优选地位于ISS的5′，例如，一个或多个TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′；两个或多个TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′；或三个或更多个TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′。TCG(一个或多个)和/或T，5-溴胞嘧啶，G(一个或多个)可直接或不直接邻近ISS。这些序列的实例已在本文中提供。如在一些实施方案中，本发明的免疫调节性多核苷酸可包括如下任一序列5′-TCGCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO97)；5′-TCGTCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO98)；5′-TZGCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO99；其中Z＝5-溴胞嘧啶)；5′-TZGTZGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO100；其中Z＝5-溴胞嘧啶)；5′-TCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO101)。
在一些实施方案中，额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一个或多个)位于ISS的5′并紧邻ISS。即TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列与ISS之间有0个碱基的间隔，例如5′-T，C，G，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，ISS-3′。对于这些实施方案，ISS可为此处描述的任何10-mer式子。包含此类序列的免疫调节性多核苷酸包括如SEQ ID NO.12、18和46。
在其它实施方案中，额外的5′TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列与ISS之间有1个碱基的间隔，例如5′-T，C，G，N，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，N，ISS-3′(其中N＝任何碱基)。包含此类序列的免疫调节性多核苷酸包括如SEQ ID NO 19、26和27。在其它实施方案中，额外的5′TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一个或多个)与ISS之间有2个碱基的间隔，例为5′-T，C，G，N，N，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，N，N，ISS-3′(其中N＝任何碱基)。对于这些实施方案，ISS可为此处描述的任何10-mer式子。
在免疫调节性多核苷酸的一些实施方案中，额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一个或多个)通过将T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而产生。例如在SEQ ID NO14中，额外的TCG中的CG为10mer ISS的前两个碱基(5′-CTTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO14))在另一例子中，TCG中的G为SEQ ID NO20中10mer ISS的第一个碱基(5′-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3 ′ (SEQ ID NO20))。对于诸如此类的实施方案，ISS可为此处描述的任一10-mer式子(如SEQ ID NO62，SEQID NO65或SEQ ID NO133)。包含此类序列的免疫调节性多核苷酸包括如SEQ ID NO.14，19，20，36和55。
因此，例如在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含一个邻近于ISS 10-mer序列SEQ ID NO62的5′端的T，其中X1为C且X2为G。参见如SEQ ID NO19。例如在其它实施方案中，免疫调节性多核苷酸包含邻近于ISS 10-mer序列SEQ ID NO62的5′端的TC，其中X1为G。参见如SEQ ID NO55。
在额外的TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列通过将T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5’端而产生的某些实施方案中，此额外的序列可与ISS一起产生TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。例如在SEQ ID NO19中，额外的TCGA中的CGA为10-mer ISS的前三个碱基(5′-5′-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO19))。在另一例子中，T，5-溴胞嘧啶，G，A序列中的5-溴胞嘧啶，G，A为SEQ ID NO36中10-mer ISS的前三个碱基(5′TCGTZGAAZGUTCGGAATG A-3′(SEQ IDNO36))。因此，本发明包括含有ISS和位于ISS 5’端的TCGA序列或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列的免疫调节性多核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的免疫调节性多核苷酸的ISS可包括下式5′-(TCG)wNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO126)其中w为1-2，y为0-2，N为任何碱基，X3为T、A或C，X4为T、G或U。包含此类ISS序列的免疫调节性多核苷酸包括但不限于SEQ ID No.1.11，12，13，17，18，14，19，55，20，22，25，28和30。
在一些实施方案中，ISS包含任一如下序列TCGAACGTTCG(SEQ ID NO102)，TCGTCGAACGTTCG(SEQ IDNO98)，TCGTGAACGTTCG(SEQ ID NO103)，TCGGTATCGGTCG(SEQ ID NO104)，TCGGTACCGTTCG(SEQ ID NO105)，TCGGAACCGTTCG(SEQ ID NO106)，TCGGAACGTTCG(SEQ IDNO107)，TCGTCGGAACGTTCG(SEQ ID NO108)，TCGTAACGTTCG(SEQ ID NO109)，TCGTCGGAACGTTCG(SEQ IDNO108)，TCGACCGTTCG(SEQ ID NO110)，TCGTCGACCGTTCG(SEQ ID NO111)，TCGTTAACGTTCG(SEQ ID NO101)。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TXG)zNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO127)其中z为1-2，y为0-2，X为5-溴胞嘧啶，N为任何碱基，X3为T、A或C，X4为T、G或U。包含此类ISS序列的免疫调节性多核苷酸包括但不限于SEQ ID No.45，23，26和29。
在一些实施方案中，ISS包含如下任一序列(其中X为5-溴胞嘧啶)TXCTGAACGTTCG(SEQ ID NO112)，TXCTXCTGAACGTTCG(SEQID NO113)，TXCAACGTTCG(SEQ ID NO114)，TXCTXCAACGTTCG(SEQ ID NO115)，TXGACCGTTCG(SEQ IDNO116)，TXCTXCACCGTTCG(SEQ ID NO54)。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸的ISS可包含下式5′-TCGTXGNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO128)其中y为0-2，X为5-溴胞嘧啶，N为任何碱基，X3为T、A或C，X4为T、G或U。包含此类ISS序列的免疫调节性多核苷酸包括但不限于SEQ IDNO.46，24和27。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸的ISS包含任一如下序列(其中X为5-溴胞嘧啶)TCGTXGTGAACGTTCG(SEQ ID NO117)，TCGTXGAACGTTCG(SEQ ID NO118)，TCGTXGACCGTTCG(SEQID NO119)。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TCG)wNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO129)其中w为1-2，y为0-2，N为任何碱基，X3为T、A或C，X为5-溴胞嘧啶，X4为T、G或U。包含此类ISS的免疫调节性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO35。在一些实施方案中，ISS包含序列TCGGAAAXGTTCG(SEQ ID NO120)或TCGAAXGTTCG(SEQ ID NO121)，其中X为5-溴胞嘧啶。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TXG)zNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO130)其中z为1-2，y为0-2，X为5-溴胞嘧啶，N为任何碱基，X3为T、A或C，X4为T、G或U。在一些实施方案中，ISS包括序列TXGAAXGUTCG(SEQ ID NO122)或TXGAAXGTTCG(SEQ ID NO123)，其中X为5-溴胞嘧啶。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸的ISS可包含下式5′-TCGTXGNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO131)其中y为0-2，X为5-溴胞嘧啶，N为任何碱基，X3为T、A或C，X4为T、G或U。包含此类ISS序列的免疫调节性多核苷酸包括但不限于SEQ IDNO36。在一些实施方案中，ISS包含序列TCGTXGAAXGUTCG(SEQ IDNO124)或TCGTXGAAXGTTCG(SEQ ID NO125)，其中X为5-溴胞嘧啶。
ISS和/或免疫调节性多核苷酸可含有修饰。ISS的修饰包括本领域公知的任何修饰，但不限于对3′OH或5′OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组分的修饰和磷酸酯基团的修饰。多种此类修饰如下所述。
ISS和/或免疫调节性多核苷酸可为单链或双链DNA，以及单链或双链RNA或其它修饰的多核苷酸。ISS可包括或不包括一个或多个回文序列区域，其中所述回文序列区域可存在于上述的10聚体基序中或可延伸至该基序外。ISS可包含额外的侧翼序列，它们中的一些于文中描述。ISS可包含天然存在的或修饰的、非天然存在的碱基，并可包含修饰的糖、磷酸酯和/或末端。例如，磷酸酯的修饰包括但不限于膦酸甲基酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并且可以任意组合使用。也可使用其它非磷酸酯连接。优选地，本发明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯主链。也可制备本领域公知的糖修饰如2′-烷氧基-RNA类似物、2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体及此处描述的其它修饰并与任意磷酸酯修饰组合。碱基修饰的实例(以下进一步讨论)包括但不限于向ISS的胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子部分(如5-溴胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-碘胞嘧啶)和向ISS的尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子部分(如5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-碘尿嘧啶)。参见如国际专利申请号WO 99/62923。
ISS和/或免疫调节性多核苷酸可用本领域熟知的技术和核酸合成设备合成，包括但不限于酶法、化学法和降解较大的寡核苷酸序列。参见如Ausubel等人(1987)；和Sambrook等人(1989)。当用酶促方式组装时，可用如连接酶将各单元连接起来，其中所述连接酶如T4 DNA或RNA连接酶。美国专利号5,124,246。寡核苷酸的降解可通过将寡核苷酸暴露于核酸酶而实现，如在美国专利号4,650,675中所示例的。
ISS和/或免疫调节性多核苷酸也可用常规的多核苷酸分离法分离。此类方法包括但不限于用探针与基因组或cDNA文库杂交来检测共有的核苷酸序列、用抗体筛选表达文库来检测共同的结构特征和通过聚合酶链反应合成特定的天然序列。
可分离、通过重组法合成或化学合成环状免疫调节性多核苷酸。当环状IMP通过分离或通过重组法获得时，IMP优选为质粒。可用文献中描述的任一方法化学合成较小的环状寡核苷酸。参见如Gao等人(1995)核酸研究(Nucleic Acids Res.)232025-2029；和Wang等人(1994)核酸研究(Nucleic Acids Res.)222326-2333。
制备寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的技术为本领域公知。包含磷酸二酯键的天然存在DNA或RNA一般通过将合适的核苷亚磷酰胺依次偶联至3′-端固定在固相载体上的、正在生长的寡核苷酸的5′-羟基上，然后将中间体亚磷酸三酯氧化为磷酸三酯而合成。一旦已合成目标寡核苷酸序列，即可从载体上除下寡核苷酸，将磷酸三酯基团去保护成磷酸二酯，并用氨水或其它碱对核苷碱基去保护。参见如用于寡核苷酸和类似物的方法、合成和特性(Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis andProperties)(Agrawal编辑)Humana Press，Totowa，NJ一书中的Beaucage(1993)“寡脱氧核糖核苷酸的合成”(＂OligodeoxyribonucleotideSynthesis＂)；Warner等人(1984)DNA 3401和美国专利号4,458,066。
ISS和/或免疫调节性多核苷酸也可包含修饰了磷酸酯的寡核苷酸，它们中的一些公知可稳定该多核苷酸。因此，一些实施方案包括稳定的免疫调节性多核苷酸。包含修饰的磷酸酯键或非磷酸酯键的多核苷酸的合成也为本领域公知。综述参见作为治疗剂的寡核苷酸(Oligonucleotides asTherapeutic Agents)(D.J.Chadwick和G.Cardew编辑)John Wiley andSons，New York，NY一书中的Matteucci(1997)“寡核苷酸类似物总览”(＂Oligonucleotide Analogsan Overview＂)。可与本发明寡核苷酸中的糖或糖类似物部分连接的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基)可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备及将它们掺入核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中本身也是公知的并无需在此详述。Peyrottes等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)241841-1848；Chaturvedi等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)242318-2323；和Schultz等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)242966-2973。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸的合成类似于上述天然存在寡核苷酸的合成，除了氧化步骤用硫化步骤替换外(用于寡核苷酸和类似物的方法、合成和特性(Protocols for Oligonucleotidesand Analogs，Synthesis and Properties)(Agrawal编辑)Humana Press一书中的Zon(1993)“寡核苷硫代磷酸酯”(＂OligonucleosidePhosphorothioates＂)165-190页)。同样，其它磷酸酯类似物的合成如磷酸三酯的合成(Miller等人(1971)JACS 936657-6665)、非桥接氨基磷酸酯的合成(Jager等人(1988)生物化学(Biochem.)277247-7246)、N3′至P5′phosphoramidiates的合成(Nelson等人(1997)JOC 627278-7287)和二硫代磷酸酯的合成(美国专利号5,453,496)也已有描述。也可使用其它基于非磷的修饰的寡核苷酸(Stirchak等人(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)176129-6141)。具硫代磷酸酯键主链的寡核苷酸较具磷酸二酯键主链的寡核苷酸更具免疫原性并在注射入宿主后似乎更抗降解。Braun等人(1988)免疫学杂志(J.Immunol.)1412084-2089；和Latimer等人(1995)分子免疫学(Mol.Immunol.)321057-1064。
用于本发明的ISS和/或免疫调节性多核苷酸可包含一个或多个核糖核苷酸(包含核糖作为唯一或主要的糖组分)、脱氧核糖核苷酸(包含脱氧核糖作为主要的糖组分)，或如本领域公知的那样，可以在ISS和/或免疫调节性多核苷酸中可掺入修饰的糖或糖类似物。因此，糖部分除了核糖和脱氧核糖外，还可为戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖＂类似物＂环戊基基团。糖可为吡喃型或呋喃型。在ISS和/或IMP中，糖部分优选为呋喃型的核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2′-O-烷基核糖，且糖可以以α或β端基异构构型和各杂环碱基连接。糖的修饰包括但不限于2′-烷氧基-RNA类似物、2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如在ISS和/或免疫调节性多核苷酸中的糖修饰包括但不限于2-氨基脱氧腺苷。这些糖或糖类似物以及各＂核苷＂(其中此类糖或类似物与杂环碱基(核酸碱基)连接)的制备本身是公知的，并无需在此描述，除非此类制备可能涉及到任何具体的实施例。在ISS和/或免疫调节性多核苷酸制备物中也可进行糖修饰并与任何磷酸酯修饰结合。
掺入ISS和/或免疫调节性多核苷酸中的杂环碱基或核酸碱基可为天然存在的主要嘌呤和嘧啶碱基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤，如上所述)，以及所述主要碱基的天然和合成的修饰物。
本领域技术人员将认识到包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似物)的大量＂合成的＂非天然核苷在本领域中是现成的，并且只要满足本发明的其它要求，ISS和/或免疫调节性多核苷酸可包括不属于此主要五种天然核酸碱基成分的一种或几种杂环碱基。但优选地，ISS和/或IMP中的杂环碱基包括但不限于尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤通过9-位、嘧啶通过1-位、吡咯并嘧啶通过7-位而吡唑并嘧啶通过1-位与ISS和/或IMP的糖部分连接。
ISS和/或免疫调节性多核苷酸可包含至少一种修饰碱基。如此处所用，术语＂修饰的碱基＂与＂碱基类似物＂同义，如＂修饰的胞嘧啶＂与＂胞嘧啶类似物＂同义。类似地，＂修饰的＂核苷或核苷酸此处定义为与核苷或核苷酸＂类似物＂同义。碱基修饰的实例包括但不限于向ISS和/或IMP的胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子部分。优选地，该吸电子部分为卤素。此类修饰的胞嘧啶可包括但不限于氮杂胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、环胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5，6--二氢胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羟基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、尿嘧啶和任何其它嘧啶类似物或修饰的嘧啶的。碱基修饰的其它实例包括但不限于向ISS和/或免疫调节性多核苷酸的尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子部分。优选地，该吸电子部分为卤素。此类修饰的尿嘧啶可包括但不限于5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶。
碱基修饰的其它实例包括添加一个或多个硫代基团至碱基上，包括，但不限于6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶和4-硫代尿嘧啶。
虽然可进行其它修饰和/或添加，但优选存在于ISS中的CG基序的胞嘧啶不发生甲基化。但在某些实施方案中，ISS可包含一个或多个甲基化的胞嘧啶。在此类实施方案中，优选10mer ISS序列中的胞嘧啶(即此处描述的式子如SEQ ID NO62，65，126，127，128，129，130，131和133的CG和/或TCG部分中的C)在位置C5处不被甲基化。但在位置N4处的甲基化可考虑存在于包含甲基化胞嘧啶的ISS中。
具有修饰碱基的核苷的制备和使用所述具有修饰碱基的核苷作为前体进行的修饰寡核苷酸的合成已在例如美国专利4,910,300、4,948,882和5,093,232中描述。这些具有修饰碱基的核苷经设计以致可通过化学合成掺入寡核苷酸的末端或内部。此类存在于寡核苷酸末端或内部的具有修饰碱基的核苷可作为连接肽或其它抗原的位点。糖部分被修饰的核苷也已有描述(包括但不限于例如，美国专利4,849,513、5,015,733、5,118,800、5,118,802)并可类似使用。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸小于约任何以下长度(以碱基或碱基对表示)10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；10。在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸大于约任何以下长度(以碱基或碱基对表示)10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000。或者，免疫调节性多核苷酸的长度可在如下任何范围内，其上限为10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；或10，而独立选择的下限为10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500，其中下限小于上限。
本发明也提供了制备此处描述的免疫调节性多核苷酸的方法。此方法可为此处描述的任一方法。例如，此方法可为合成含有ISS的多核苷酸(例如用固相合成)且可进一步包括任何纯化步骤。纯化方法为本领域公知。其它制备方法包括组合免疫调节性多核苷酸和抗原。
抗原任何抗原都可与免疫调节性多核苷酸共施用，和/或用于包含免疫调节性多核苷酸和抗原的组合物(以及这些组合物的制品)中。
在一些实施方案中，抗原为变应原。重组变应原的实例在表1中提供。许多变应原的制备在本领域是熟知的，包括但不限于豚草花粉变应原Antigen E(Amb a I)(Rafnar等人(1991)生物化学杂志(J Biol.Chem.)2661229-1236)、草变应原Lol p1(Tamborini等人(1997)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)249886-894)、主要尘螨变应原Der pI和Der PII(Chua等人(1988)实验医学杂志(J.Exp.Med.)167175-182；Chua等人(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91124-129)、家猫变应原FeldI(Rogers等人(1993)分子免疫学(Mol.Immunol.)30559-568)、白桦花粉Betvl(Breiteneder等人(1989)EMBO J 81935-1938)、柳杉变应原Cryj1和Cryj2(Kingetsu等人(2000)免疫学(Immunology)99625-629)和来自其它树木花粉的蛋白质抗原(Elsayed等人(1991)Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.20417-31)的制备。如所述的那样，来自树的变应原是公知的，包括来自桦树、杜松和柳杉的变应原。已报导了用于体内施用的来自草花粉的蛋白质抗原制品。
在一些实施方案中，变应原为食物变应原，包括但不限于花生变应原如ArahI(Stanley等人(1996)Adv.Exp.Med.Biol.409213-216)；胡桃变应原如JugrI(Tueber等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.101807-814)；巴西坚果变应原如白蛋白(Pastorello等人(1998)J Allergy Clin.Immunol.1021021-1027)；虾变应原如PenaI(Reese等人(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.113240-242)；卵变应原如类卵粘蛋白(Crooke等人(1997)免疫学杂志(J.Immunol.)1592026-2032)；奶变应原如牛β-乳球蛋白(Selot等(1999)临床与实验变态反应(Clin.Exp.Allergy)291055-1063)；鱼变应原如小白蛋白(Van Do等人(1999)Scand.J Immunol.50619-625；Galland等人(1998)J Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.70663-71.)。在一些实施方案中，变应原为胶乳变应原，包括但不限于Hevb7(Sowka等人(1998)欧洲生物化学杂志(Eur.J Biochem.)255213-219)。表1列出了可使用的变应原的示例。
表1重组变应原
在一些实施方案中，抗原来自感染物，包括原生动物、细菌、真菌(包括单细胞和多细胞)和病毒感染物。合适的病毒抗原的实例于文中描述并为本领域公知。细菌包括流感嗜血杆菌、分枝结核杆菌和百日咳杆菌(Bordetella pertussis)。原生动物感染物包括疟原虫、利什曼原虫、锥虫和血吸虫。真菌包括白色念珠菌(Candida albicans)。
在一些实施方案中，抗原为病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不限于HIV蛋白如HIV gag蛋白(包括但不限于膜锚定(MA)蛋白、核心壳(CA)蛋白和核衣壳(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基质(M)蛋白和流感病毒核衣壳(NP)蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、肝炎e蛋白(HBeAg)、乙肝DNA聚合酶、丙肝抗原等。讨论流感接种的文献包括Scherle和Gerhard(1988)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)854446-4450；Scherle和Gerhard(1986)，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1641114-1128；Granoff等(1993)，疫苗(Vaceine)11S46-51；Kodihalli等人(1997)，病毒学杂志(J.Virol.)713391-3396；Ahmeida等人(1993)，疫苗(Vaccine)111302-1309；Chen等人(1999)，疫苗(Vaccine)17653-659；Govorkova和Smirnov(1997)Acta Virol.(1997)41251-257；Koide等人(1995)，疫苗(Vaccine)133-5；Mbawuike等人(1994)，疫苗(Vaccine)121340-1348；Tamura等人(1994)，疫苗(Vaccine)12310-316；Tamura等人(1992)欧洲免疫学杂志(Eur.J Immunol.)22477-481；Hirabayashi等人(1990)，疫苗(Vaccine)8595-599。抗原多肽的其它实例为组或亚组特异性抗原，它们公知存在于许多感染物中，其中所述感染物包括但不限于腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、乳头状瘤病毒(papilloma virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)和痘病毒(poxviruse)。
如以下实施例3中所示，在灵长类中，含有ISS的多核苷酸与肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原(HBsAg))的联合施用导致抗HBsAg抗体效价较单独施用HBsAg时升高。
许多抗原性肽和蛋白质是公知的，并在本领域中是现成的；其它的可用常规技术鉴定。对于通过免疫抵抗肿瘤形成或治疗已存在的肿瘤，免疫调节性肽可包括肿瘤细胞(活的或辐射过的)、肿瘤细胞提取物或肿瘤抗原如Her-2/neu、Mart1、癌胚抗原(CEA)的蛋白质亚单位、神经节苷酯、人乳脂肪球(HMFG)、粘蛋白(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特异抗原(PSA)和酪氨酸酶。基于免疫的避孕疫苗可通过包括精子蛋白与ISS而形成。Lea等人(1996)Biochim.Biophys.Acta1307263。
减毒和灭活病毒适用于本文中用作抗原。这些病毒的制备为本领域熟知并且许多可通过商业途径获得(参见如Physicians′Desk Reference(1998)第52版，Medical Economics Company，Inc.)。例如，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)可以以1POL(Pasteur Merieux Connaught)和ORIMUNE(LederleLaboratories)获得，甲肝病毒可以以VAQTA(Merck)获得，麻疹病毒(measles virus)可以以ATTENUVAX(Merck)获得，腮腺炎病毒(mumps virus)可以以MUMPSVAX(Merck)获得，及风疹病毒(rubellavirus)可以以MERUVAXII(Merck)获得。此外，如HIV-1、HIV-2、单纯疱疹病毒、乙肝病毒、轮状病毒(rotavirus)、人和非人乳头状瘤病毒和脑慢病毒(slow brain virus)的减毒和灭活病毒可提供肽抗原。
在一些实施方案中，抗原包含病毒载体，如痘苗病毒、腺病毒和金丝雀痘病毒载体。
抗原可从它们的来源中用本领域公知的纯化技术分离，或更方便地，可用重组方法产生。
抗原性肽可包括纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、粗蛋白提取物、减毒或灭活病毒、细胞、微生物或此类肽的片段。，免疫调节性肽可为天然肽，或为化学或酶法合成的肽。本领域公知的任何化学合成法均适用。液相肽合成可用于构建中等大小的肽，或肽的化学构建可采用固相合成来进行。Atherton等人(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362833-839。也可使用蛋白水解酶来偶联氨基酸而产生肽。Kullmann(1987)EnzymaticPeptide Synthesis，CRC Press，Inc。另外，可通过使用细胞的生物化学机器或通过从生物源分离来获得肽。可采用重组DNA技术产生肽。Hames等人(1987)，转录和翻译实用方法(Transcription and TranslationAPractical Approach)，IRL Press。也可用标准技术如亲和层析分离肽。
优选地，抗原为肽、脂类(如除胆固醇外的固醇类、脂肪酸和磷脂)、多糖(如那些用于流感嗜血杆菌疫苗中的多糖)、神经节苷脂和糖蛋白。它们可通过本领域公知的几种方法获得，包括使用化学和酶法分离和合成。在某些情况下，例如对于许多固醇类、脂肪酸和磷脂，分子的抗原性部分可通过商业途径得到。
用于本发明组合物和使用该组合物的方法中的病毒抗原的实例包括但不限于HIV抗原。此类抗原包括但不限于那些来自HIV包膜糖蛋白的抗原，其中所述HIV包膜糖蛋白包括但不限于gpl60、gpl20和gp41。许多HIV基因和抗原的序列是公知的。例如Los Alamos National LaboratoryHIV Sequence Database收集、管理和注释HIV核苷酸和氨基酸序列。该数据库通过互联网网址http//hiv-web.lanl.gov/可进入，并且在每年公布中，参见Human Retroviruses and AIDS Compendium(如2000版)。
来自感染物的抗原可用本领域公知的方法获得，如从天然病毒或细菌提取物获得、从感染物感染的细胞获得、从纯化的多肽获得、从重组产生的多肽获得和/或以合成肽的形式获得。
ISS-抗原当与抗原一起使用时，ISS可以以多种方式与抗原一起施用。在一些实施方案中，含有ISS的多核苷酸和抗原可以以相互空间接近的方式施用，或以混合物(即在溶液中)施用。如下所述，可以以多种方式实行空间接近，包括偶联(连接)、包囊、通过添加至平台或吸附至表面上。通常且最优选地，与ISS和抗原作为混合物施用所产生的免疫反应相比，含有ISS的多核苷酸和抗原以有效增强该免疫反应的距离相邻连接。
在一些实施方案中，含有ISS的多核苷酸与抗原偶联。ISS部分可以以多种方式与偶联物的抗原部分偶联，包括共价和/或非共价相互作用。
这些部分间的连接可在ISS的3′或5′末端，或在ISS中间位置的适当修饰的碱基处进行。如果抗原为肽并包含合适的活性基团(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)，则它可直接与胞嘧啶残基的N4氨基反。根据ISS中胞嘧啶残基的数量和位置，可在一个或多个残基处实现特异性偶联。
或者，可将本领域所公知的修饰寡核苷掺入ISS的末端或内部位置。它们可包含被封闭的官能团，当去封闭后，这些官能团可与多种存在于或连接在目的抗原上的官能团反应。
当抗原为肽或多肽时，偶联物的该部分可通过固相载体化学连接至ISS的3′-端。例如，可将ISS部分添加至已在载体上预合成的多肽部分上。Haralambidis等人(1990a)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18493-499；和Haralambidis等人(1990b)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18501-505。另外，可这样合成ISS以使其通过从3′-端延伸出的可切割接头连接固相载体。当ISS从载体上化学切割下来后，在寡核苷酸的3’-端留下一个末端巯基(Zuckermann等人(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)155305-5321；和Corey等人(1987)科学(Science)2381401-1403)或在寡核苷酸的3’-端留下一个末端氨基基团(Nelson等人(1989)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)171781-1794)。氨基修饰的ISS与肽的氨基的偶联可如Benoit等人(1987)Neuromethods 643-72中所述进行。巯基修饰的ISS与肽的羧基的偶联可如Sinah等人(1991)，寡核苷酸类似物实用方法(OligonucleotideAnaloguesA Practical Approach)，IRL Press中所述进行。携带有附加的马来酰亚胺的寡核苷酸与肽的半胱氨酸残基的巯基侧链的偶联也已有描述。Tung等人(1991)Bioconjug Chem.2464-465。
偶联物的肽或多肽部分可通过在ISS合成过程中掺入该寡核苷酸的胺、巯基或羧基基团连接至ISS的5’-端。优选地，当寡核苷酸固定于固相载体时，一端包含被保护的胺、巯基或羧基且另一端包含亚磷酰胺的连接基团可与5′-羟基共价结合。Agrawal等人(1986)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)146227-6245；Connolly(1985)核酸研究(Nucleic Acids Res.)134485-4502；Kremsky等人(1987)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)152891-2909；Connolly(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)153131-3139；Bischoff等人(1987)Anal.Biochem.164336-344；Blanks等人(1988)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)1610283-10299；以及美国专利号4,849,513、5,015,733、5,118,800和5,118,802。去保护后，这些胺、巯基和羧基官能团可用于使寡核苷酸与肽共价连接。Benoit等人(1987)；和Sinah等人(1991)。
ISS-抗原偶联物也可通过非共价相互作用如离子键、疏水相互作用、氢键和/或范德华引力而形成。
非共价连接的偶联物可包括非共价相互作用，如生物素-链亲和素复合体。生物素基团可例如连接至ISS的修饰碱基上。Roget等人(1989)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)177643-7651。将链亲和素部分掺入肽部分使得链亲和素偶联的肽和生物素化寡核苷酸可以形成非共价结合复合体。
也可通过涉及到ISS和抗原内的残基如带电荷氨基酸的离子相互作用，或通过使用包含有可与寡核苷酸和抗原相互作用的带电荷残基的接头部分来产生非共价连接。例如，非共价偶联可以在通常带负电的ISS和肽中带正电的氨基酸残基如多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚组氨酸残基之间发生。
ISS和抗原间的非共价偶联可通过与DNA相互作用的分子中的DNA结合基序而产生，其中DNA为该分子的天然配体。例如，此类DNA结合基序可在转录因子和抗DNA抗体中找到。
ISS与脂的连接可通过标准方法形成。这些方法包括但不限于合成寡核苷酸-磷脂偶联物(Yanagawa等人(1988)Nucleic Acids Symp.Ser.19189-192)、寡核苷酸-脂肪酸偶联物(Grabarek等人(1990)生物化学年鉴(Anal.Biochem.)185131-135；和Staros等人(1986)生物化学年鉴(Anal.Biochem.)156220-222)、和寡核苷酸-固醇偶联物。Boujrad等人(1993)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905728-5731。
寡核苷酸与寡糖的连接可通过标准的已知方法形成。这些方法包括但不限于合成寡核苷酸-寡糖偶联物，其中寡糖为免疫球蛋白的一部分。O′Shannessy等人(1985)，应用生物化学杂志(J.Applied Biochem.)7347-355。
环状ISS与肽或抗原的连接可以以几种方式形成。当环状ISS是通过重组或化学法合成时，修饰核苷是合适的。参见Ruth(1991)在寡核苷酸和类似物实用方法(Oligonucleotides and AnaloguesA PracticalApproach)，IRL Press一书中的描述。然后可用标准的连接技术将环状ISS连接至抗原或其它肽上。Goodchild(1990)Bioconjug.Chem.1165。当环状ISS为分离的，或使用重组或化学法合成的时，可通过化学活化或光活化已掺入抗原或其它肽中的活性基团(如卡宾、自由基)来形成连接。
用于将肽和其它分子连接至寡核苷酸上的其它方法可在美国专利号5,391,723；Kricka(编辑)，非同位素DNA探针技术(Nonisotopic DNA ProbeTechniques)，Academic Press一书中的Kessler(1992)，“核酸的非放射性标记法”(＂Nonradioactive labeling methods for nucleic acids＂)；和Geoghegan等人(1992)Bioconjug.Chem.3138-146中找到。
ISS可以以其它方式与抗原紧邻连接。在一些实施方案中，ISS和抗原通过包囊而紧邻连接。在其它实施方案中，ISS和抗原通过与平台分子连接而紧邻连接。＂平台分子＂(也称为＂平台＂)为包含允许ISS和抗原连接的位点的分子。在其它实施方案中，ISS和抗原通过吸附在表面，优选载体粒子上而紧邻连接。
在一些实施方案中，本发明的方法使用了包囊剂(或包含此包囊剂的组合物)，其中所述包囊剂可维持ISS和第一抗原的紧邻连接，直至该复合体到达靶。优选地，包含ISS、抗原和包囊剂的组合物为佐剂水包油乳剂、微粒子和/或脂质体形式。更优选地，包裹有ISS-免疫调节分子的佐剂水包油乳剂、微粒子和/或脂质体为约0.04μm至约100μm大小的颗粒形式，优选地其大小为任一以下范围约0.1μm至约20μm；约0.15μm至约10μm；约0.05μm至约1.00μm；约0.05μm至约0.5μm。
胶体分散体系如微球、珠、大分子复合体、毫微胶囊和基于脂的体系如水包油乳剂、微胶粒、混合微胶粒和脂质体可有效地包囊含有ISS的组合物。
包囊组合物还可包含如下多种组分中的任何组分。这些组分包括但不限于明矾、脂类、磷脂、脂膜结构(LMS)、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物如多肽、糖肽和多糖。
适用作包囊组分的多肽包括本领域公知的任何多肽，并包括但不限于脂肪酸结合蛋白。修饰的多肽可包含如下多种修饰中的任何修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、磷酸化、肉豆蔻基化、硫酸化和羟化。如此处所用，合适的多肽为能保护含有ISS的组合物以保留其免疫调节活性的多肽。结合蛋白的实例包括但不限于白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白。
其它合适的聚合物可为制药领域公知的任何聚合物，其包括但不限于天然存在的聚合物(如葡聚糖、羟乙基淀粉和多糖)和合成的聚合物。天然存在的聚合物的实例包括蛋白质、糖肽、多糖、葡聚糖和脂类。其它聚合物可为合成的聚合物。适用于本发明的合成聚合物的实例包括但不限于聚烷基二醇(PAG)如PEG、聚氧乙基化多元醇(POP)如聚氧乙基化甘油(POG)、聚三亚甲基二醇(PTG)、聚丙二醇(PPG)、聚异丁烯酸羟乙基酯、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氨基酸、聚氨基甲酸酯和聚磷腈。合成的聚合物也可为直链或支链的、取代或未取代的均聚物、两种或多种不同的合成单体的共聚物或嵌段共聚物。
用于本发明包囊组合物中的PEG可购自化学供应商或用本领域公知的技术合成。
术语＂LMS＂如此处所用是指这样的层状脂粒子，其中极性脂的极性头部基团面向界面的水相排列以形成膜结构。LMS的实例包括脂质体、微胶粒、螺旋体(即通常的圆柱状脂质体)、微乳、单层脂质体、多层脂质体等。
本发明优选的胶体分散体系为脂质体。用脂质体包裹的抗原免疫小鼠，脂质体表现出可促进针对抗原的Th1-类免疫反应。Aramaki等人(1995)，疫苗(Vaccine)131809-1814。如此处所用，＂脂质体＂或＂脂质小泡＂为被至少一个且可能多于一个的双层脂膜包裹的小泡。可以从磷脂、糖脂、脂类、类固醇如胆固醇、相关分子或其组合通过本领域公知的任何技术人工制备脂质体，所述技术包括但不限于超声处理、挤压或从脂-去污剂复合体中去除去污剂。脂质体也可任选地包含其它组分如组织靶向组分。应理解＂脂膜＂或＂脂双层＂不一定仅由脂类组成，只要膜的总体结构为两个亲水表面夹着一个疏水核的片层，＂脂膜＂或＂脂双层＂还可包含任何合适的其它组分，所述组分包括但不限于胆固醇和其它类固醇、溶于脂的化学物质、任何长度的蛋白质以及其它两亲性分子。对膜结构的综合讨论参见J.Kendrew(1994)的分子生物学百科全书(The Encyclopedia of MolecularBiology)。合适的脂类参见如Lasic(1993)＂Liposomesfrom Physics toApplications＂Elsevier，Amsterdam。
用于制备含有ISS组合物的脂质体的方法为本领域公知。脂质小泡可通过本领域公知的任何合适技术制备。方法包括但不限于微囊化、微流化、LLC法、醇注射、氟利昂注射、＂发泡＂法、去污剂透析、水合作用、超声处理和反相蒸发。综述见Watwe等人(1995)Curr.Sci.68715-724。可组合多种技术以提供具最理想特性的小泡。
本发明包括含有组织或细胞靶向组分的LMS的用途。此类靶向组分为这样的LMS中的组分，当LMS施用于完整的动物、器官或细胞培养物时，该组分可促进LMS优先积聚在特定组织或细胞位点而非其它组织或细胞位点。靶向组分通常从脂质体外部来接近，因此其优选结合在外表面或插入外部的脂双层中。靶向组分尤其可为肽、较大肽的区域、细胞表面分子或标记物的特异性抗体或其抗原结合片段、核酸、糖类、复合糖的区域、特异的脂、或可与任一上述分子结合的小分子如药物、激素或半抗原。对细胞类型特异性细胞表面标记物具特异性的抗体为本领域公知，并易于通过本领域公知的方法制备。
可使LMS靶向治疗欲指向的任何细胞类型，如可调节和/或参与免疫反应的细胞类型。此类靶细胞和器官包括但不限于APC如巨噬细胞、树状突细胞和淋巴细胞、淋巴结构如淋巴结和脾、以及非淋巴结构，尤其是那些存在树状突细胞的非淋巴结构。
本发明的LMS组合物还可包含表面活性剂。表面活性剂可为阳离子的、阴离子的、两亲的或非离子的表面活性剂。表面活性剂的优选类型为非离子表面活性剂；尤其优选那些水溶性的。
在ISS和抗原通过与平台分子的连接而紧邻连接的实施方案中，平台可为蛋白质或非蛋白质平台(即有机的)。蛋白质平台的实例包括但不限于白蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵白蛋白。Borel等人(1990)，免疫学方法(Immunol.Methods)126159-168；Dumas等人(1995)Arch.Dematol.Res.287123-128；Borel等人(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107264-267；Borel等人(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.77880-87。平台为多价体(即包含多于一个的结合或连接位点)以满足与ISS和抗原两者的结合。聚合物平台的其它实例为葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚糖体、羧甲基纤维素、聚乙烯醇和聚D-谷氨酸/D-赖氨酸。
使用平台分子的原则在本领域是熟知的。通常，平台包含或经衍生后包含合适的ISS和抗原结合位点。此外或备选地，通过衍生ISS和/或抗原以提供合适的连接基团。例如，简单的平台为双功能接头(即具有两个结合位点)，如肽。在下文中讨论了其它的实例。
平台分子可为生物稳定的，即它们显示的体内排泄半衰期通常为数小时至数天至数月从而可赋予治疗功效，且平台分子优选由规定组合物的合成单链组成。它们通常具有的分子量为约200至约1,000,000，优选在如下任一范围内约200至约500,000；约200至约200,000；约200至约50,000(或更小，如30,000)。价平台分子的实例为聚合物(或由聚合物组成)，如聚乙二醇(PEG，优选地具有约200至约8000的分子量)、聚-D-赖氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-赖氨酸(比率为3∶2)。可使用的其它分子为白蛋白和IgG。
适用于本发明的其它平台分子为在美国专利5,552,391中公开的化学定义的非聚合价平台分子。适用于本发明的其它均质的化学定义的价平台分子为衍生的2，2′-亚乙二氧基二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。
其它合适的价平台分子包括但不限于四氨基苯、七氨基β-环糊精、四氨基季戊四醇、1，4，8，11-四氮杂环十四烷(Cyclam)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。
通常，这些平台分子通过标准的化学合成技术制备。PEG必须被衍生并制成多价的。这通过使用标准技术实现。适用于偶联物合成的一些物质如PEG、白蛋白和IgG可通过商业途径获得。
ISS和抗原与平台分子的偶联可以以多种方式实现，一般涉及到一种或多种交联剂、抗原和ISS及平台分子上的官能基。平台分子及ISS和抗原必须具有合适的连接基团。可以用标准的合成化学技术向平台分子添加连接基团。而可用标准的固相合成技术或重组技术将连接基团添加至多肽抗原和ISS上。重组方法可能需要翻译后修饰以连接接头，此类方法在本领域是公知的。
例如，多肽可包含含有官能团如氨基、羧基或巯基的氨基酸侧链部分，这些基团可作为将该多肽偶联至平台分子上的位点。如果多肽不包含这些基团，可将具有此类官能团的残基添加至该多肽。此类残基可通过固相合成技术或重组技术掺入，这两种技术为肽合成领域所熟知。当多肽具有糖侧链(或当抗原为糖)时，可通过常规化学向其中掺入官能团氨基、巯基和/或醛基。例如，通过氧化糖的反应在氰基硼氢化钠存在下使用乙二胺可掺入伯氨基基团，通过半胱胺二盐酸化物反应然后用标准的二硫化物还原剂还原可掺入巯基，而醛基可在高碘酸氧化后产生。如果平台分子不具有合适的官能团，也可以以类似方式衍生平台分子以包含官能团。
可变长度的亲水接头可用于将ISS和抗原连接至平台分子。合适的接头包括乙二醇的线性寡聚体或多聚体。此类接头包括具有下式的接头R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2，其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保护基如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基如4-硝基苯基酯。这些接头可用于将含有硫基反应基如haloaceyl、maleiamide等的分子(通过硫醚)和含有氨基的第二分子(通过酰胺键)连接。就连接的次序而言，这些接头具弹性，即硫醚可首先或最后形成。
在ISS和抗原通过吸附至表面而紧邻连接的实施方案中，表面可为用无机或有机核心制备的载体粒子(如毫微粒子)形式。此类毫微粒子的实例包括但不限于毫微结晶粒子、通过聚合氰基丙烯酸烷基酯而制备的毫微粒子和通过丙二酸亚甲酯聚合而制备的毫微粒子。可吸附ISS和抗原的其它表面包括但不限于活性碳粒子和蛋白质-陶瓷毫微板。本文提供了载体粒子的其它实例。
通过将多核苷酸和多肽吸附至表面来实现所吸附的分子向细胞的递送是本领域所熟知的。参见如Douglas等人(1 987)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.3233-261；Hagiwara等人(1987)In Vivo 1241-252；Bousquet等人(1999)Pharm.Res.16141-147；和Kossovsky等人，美国专利5,460,831。优选地，含有吸附表面的材料是可生物降解的。ISS和/或抗原可通过非共价相互作用(包括离子和/或疏水相互作用)吸附至表面。
总之，载体如毫微粒子的特征如表面电荷、粒子大小和分子量取决于聚合条件、单体浓度和在聚合过程中稳定剂的存在(Douglas等人，1987)。载体粒子的表面可通过如表面包被来修饰，以允许或促进ISS和/或抗原的吸附。吸附了ISS和/或抗原的载体粒子可进一步用其它物质包被。此类其它物质的添加如此处所述可例如在将粒子施用于受试者后延长粒子的半衰期，和/或可将粒子靶向特定的细胞类型或组织。
可吸附ISS和抗原的毫微结晶表面已有描述(参见如美国专利5,460,831)。毫微结晶核心粒子(直径为1μm或更小)用促进多肽、多核苷酸和/或其它药剂吸附的表面能量修饰层包被。如在美国专利5,460,831中所述，例如核心粒子可以用促进寡核苷酸吸附的表面包被，接下来用抗原制品包被，其中所述抗原制品为例如脂-抗原混合物形式。此类毫微粒子为毫微米大小粒子的自我组装复合体，一般为0.1μm级，其具有ISS内层和抗原外层。
另一吸附表面为通过聚合氰基丙烯酸烷基酯而制备的毫微粒子。氰基丙烯酸烷基酯可在酸化的水性介质中通过阴离子聚合法而聚合。根据聚合条件，这些小粒子趋向于具有20至3000nm的尺寸，并且可制备具有特定表面特征和特定表面电荷的毫微粒子(Douglas等人，1987)。例如，在存在疏水阳离子如氯化四苯鏻或季铵盐如溴化十六烷基三甲基铵时，寡核苷酸可被吸附至聚氰基丙烯酸异丁酯和聚氰基丙烯酸异己酯毫微粒子上。寡核苷酸吸附在这些毫微粒子上似乎是通过核酸链的带负电荷磷酸基团和疏水阳离子之间形成的离子对介导的。参见如Lambert等人(1998)，生物化学(Biochimie)80969-976，Chavany等人(1994)Pharm.Res.111370-1378；Chavany等人(1992)Pharm.Res.9441-449。多肽也可吸附在聚氰基丙烯酸烷基酯毫微粒子上。参见如Douglas等人，1987；Schroeder等人(1998)肽(Peptide s)19777-780。
另一吸附表面为通过丙二酸亚甲酯聚合而制备的毫微粒子。例如，如Bousquet等人，1999所述，多肽吸附至聚(丙二酸亚甲酯2.1.2)毫微粒子上似乎最初是通过静电力然后是通过疏水力稳定来实现的。
IMP/MC复合体含有ISS的多核苷酸可以以免疫调节性多核苷酸/微载体(IMP/MC)复合体的形式施用。因此，本发明提供了包含IMP/MC复合体的组合物。
用于本发明的微载体尺寸小于约150、120或100μm，较常见地为小于约50-60μm，优选小于约10μm，并且不可溶于纯水。用于本发明的微载体优选地为可生物降解的，但不可生物降解的微载体也是可接受的。微载体通常为固相，如＂珠＂或其它粒子，但液相微载体如包含可生物降解聚合物的水包油乳液或油也可考虑。可接受用作微载体的大量可生物降解和不可生物降解物质为本领域所公知。
用于本发明组合物或方法中的微载体通常小于约10μm(如具有的平均直径小于约10μm，或至少约97％的粒子能通过10μm筛式滤器)，并且包括毫微载体(即尺寸小于约1μm的载体)。优选地，选择上限尺寸约为9、7、5、2或1μm或900、800、700、600、500、400、300、250、200或100nm，而独立选择的下限尺寸约为4、2或11μm或约800、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25或10 nm的微载体，其中下限小于上限。在一些实施方案中，微载体具有的尺寸约1.0-1.5μm，约1.0-2.0μm或约0.9-1.6μm。在某些优选的实施方案中，微载体具有的尺寸为约10nm至约5μm，或约25nm至约4.5μm，约1μm，约1.2μm，约1.4μm，约1.5μm，约1.6μm，，约1.8μm，约2.0μm，约2.5μm或约4.5μm。当微载体为毫微载体时，优选的实施方案包括约25至约300nm，、50至约200nm、约50nm或约200nm的毫微载体。
可生物降解的固相微载体可由可生物降解的聚合物制备，其中所述可生物降解的聚合物包括但不限于可生物降解的聚酯如聚(乳酸)、聚羟基乙酸及它们的共聚物(包括嵌段共聚物)，以及聚(乳酸)和聚(乙二醇)的嵌段共聚物；聚原酸酯如以3，9--二亚乙基-2，4，8，10-四氧杂螺[5.5]十一烷(DETOSU)为基础的聚合物；聚酐类，如基于相对亲水单体如癸二酸的聚(酐)聚合物；聚二酰亚胺，如基于掺入氨基酸如甘氨酸或丙氨酸的癸二酸衍生单体(即利用二酰亚胺键通过氨基末端的氮与癸二酸连接)的聚(酐)聚合物；聚酐酯；聚磷腈，尤其是含有易水解酯基的聚(磷腈)，其中所述易水解酯基可以通过产生羧酸基团催化聚合物主链的降解(Schacht等人，(1996)Biotechnol.Bioeng 1996102)；和聚酰胺如聚(乳酸-共-赖氨酸)。
适用于制备微载体的大量不可降解物质也是公知的，其包括但不限于聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、乳胶、金以及铁磁性和顺磁性物质。某些实施方案不包括金、乳胶和/或磁珠。在某些实施方案中，微载体可由用第二种物质(如聚苯乙烯)包封的第一种物质(如磁性物质)制成。
固相微球体可用本领域公知的技术制备。例如，它们可通过乳液-溶剂提取/蒸发技术制备。一般，在此技术中，将可生物降解的聚合物如聚酐、聚(α-氰基丙烯酸烷基酯)和聚(α-羟基酯)，如聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)、聚(D，L-乳酸-共-羟基乙酸)和聚(己内酯)溶于合适的有机溶剂如二氯甲烷中，以构建乳液的分散相(DP)。该DP在过量体积的含有溶解的表面活性剂如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的连续水相(CP)中高速匀浆而乳化。CP中的表面活性剂可以确保形成离散的且合适大小的乳液小滴。然后将有机溶剂提取入CP并接下来通过升高系统温度来蒸发。固体微粒子然后通过离心或过滤分离，并干燥如通过冷冻干燥或应用真空干燥，然后置于4℃保存。
可测定干燥微粒子的物理化学特性如平均尺寸、尺寸分布和表面电荷。尺寸特性可以例如通过动态光散射技术测定，表面电荷通过测定ζ电位而确定。
液相微载体包括脂质体、微胶粒、油滴和其它其中掺入了可生物降解的聚合物或油类的基于脂或油的粒子。在某些实施方案中，可生物降解的聚合物为表面活性剂。在其它实施方案中，液相微载体为可生物降解的，因为其包含可生物降解的油如鲨烯或植物油。一种优选的液相微载体是在水包油乳液中的油滴。优选地，用作微载体的水包油乳液包含可生物降解的代用品如鲨烯。
IMP/MC复合体包含连接在微载体表面的IMP(即IMP不是被包裹在MC中)，并优选每一微载体连接有多个IMP分子。在某些实施方案中，不同IMP的混合物可与一种微载体复合，这样该微载体将连接有多种的IMP。IMP和MC之间的键可为共价或非共价的。本领域技术人员理解可以修饰或衍生IMP，并且可以选择和/或修饰微载体的组成以适应用于形成IMP/MC复合体的期望结合类型。
共价结合的IMP/MC复合体可用本领域公知的任一共价交联技术连接。一般，对IMP部分进行修饰，以掺入额外部分(如游离胺、羧基或巯基)或掺入修饰的(如硫代磷酸酯)核苷酸碱基，从而提供IMP部分可与微载体连接的位点。复合体中IMP和MC部分之间的连接可发生在IMP的3′或5′端，或在IMP内部经合适修饰的碱基处。通常也修饰微载体以掺入通过其可形成共价连接的部分，但也可利用正常存在于微载体上的官能团。通过将IMP与微载体在允许共价复合体形成的条件下(如在存在交联剂时或通过使用包含可与IMP形成共价键的活化部分的活化微载体)孵育来形成IMP/MC。
大量的交联技术为本领域所公知，并包括与氨基、羧基和巯基反应的交联剂。对本领域技术人员显而易见的是交联剂和交联法的选择取决于IMP和微载体的构型及所期望的IMP/MC复合体的最终构型。交联剂可为同双功能的或异双功能的。当使用同双功能交联剂时，交联剂利用IMP和MC上的相同部分(如当IMP和MC包含一个或多个游离胺时，可使用醛交联剂来共价连接IMP和MC)。异双功能交联剂利用IMP和MC上的不同部分(如马来酰亚胺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯可用于共价连接IMP上的游离巯基和MC上的游离胺)，并且其在使微载体间键的形成最小化方面是优选的。在大多数情况下，优选通过在微载体上的第一交联部分和在IMP上的第二交联部分来交联，其中第二交联部分不存在于微载体上。产生IMP/MC复合体的一种优选方法是通过与异双功能交联剂孵育来活化微载体，然后将IMP与活化的MC在适于反应的条件下孵育而形成IMP/MC复合体。交联剂可在两个反应部分之间掺入＂间隔臂＂，或交联剂中的两个反应部分可直接连接。
在一个优选的实施方案中，IMP部分包含至少一个游离巯基(如由5′-巯基修饰的碱基或接头提供)用于交联微载体，同时微载体包含游离氨基。可以使用与这两个基团反应的异双功能交联剂(如包含马来酰亚胺基团和NHS-酯的交联剂)，诸如琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯活化MC，然后共价交联IMP以形成IMP/MC复合体。
非共价IMP/MC复合体可通过任何非共价结合或相互作用连接，其中非共价结合或相互作用包括离子(静电)键、疏水相互作用、氢键、范德华引力、或两种或多种不同相互作用的组合，当利用结合对连接IMP和MC时通常就是这样。
优选的非共价IMP/MC复合体一般通过疏水或静电(离子)相互作用或它们的组合而复合(例如，通过IMP和连接至MC上的多核苷酸之间的碱基配对，即使用结合对)。由于多核苷酸主链的亲水特性，依赖疏水相互作用形成复合体的IMP/MC复合体通常需要修饰复合体的IMP部分以掺入高度疏水部分。优选地，疏水部分为生物相容的、非免疫原性的并天然存在于该组合物欲施用的个体体内(例如，该疏水部分可在哺乳动物，尤其是人体内找到)。优选的疏水部分的实例包括脂类、类固醇类、固醇类如胆固醇和萜类。当然，将疏水部分连接至IMP的方法取决于IMP的构型和疏水部分的特性。可在IMP中的任何适宜位点添加疏水部分，优选地在5′或3′端添加；在将胆固醇部分添加至IMP时，优选地使用常规化学反应将该胆固醇部分添加至IMP的5′端(参见如Godard等人(1995)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)232404-410)。优选地，用于通过疏水键连接的IMP/MC复合体中的微载体由疏水材料如油滴或疏水聚合物制成，但也可使用经修饰掺入了疏水部分的亲水材料。当该微载体为脂质体或其它包含腔的液相微载体时，在制备MC后通过混合IMP和MC而形成IMP/MC复合体，从而避免在MC制备过程中对IMP的包裹。
通过静电结合的非共价IMP/MC复合体一般利用多核苷酸主链的高负电荷。因此，用于非共价结合的IMP/MC复合体中的微载体通常在生理pH(如约pH 6.8-7.4)下为带正电荷的(阳离子)。微载体可本身就具有正电荷，但使用一般不具有正电荷的化合物制备的微载体可通过衍生或修饰而成为带正电荷的(阳离子)。例如，可衍生用于制备微载体的聚合物，以添加带正电荷的基团，如伯胺。另外，可在生产过程中将带正电的化合物掺入微载体制剂中(例如，在聚(乳酸)/聚(羟基乙酸)共聚物的生产过程中可使用带正电荷的表面活性剂，以在所得的微载体粒子上赋予正电荷)。
如此处所述，为制备阳离子微球，可将阳离子脂类或聚合物，如1，2-二油酰基-1，2，3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)或聚赖氨酸根据它们在DP或CP相中的溶解度加至DP或CP中。
如此处所述，可以通过多核苷酸和微球粒子一起孵育，优选地在含水混合物中孵育，使多核苷酸吸附至阳离子微球上预形成IMP/MC复合体。此孵育可在任何期望条件下实施，包括环境温度(室温)(如，约20℃)或在冷藏下(如4℃)。由于阳离子微球和多核苷酸能相对快地结合，孵育可持续任一适宜的时间段，如5、10、15分钟或更多，包括过夜和更长的孵育。例如，通过将包含ISS的多核苷酸和微球于4℃过夜含水孵育可使其吸附至阳离子微球上。但是，由于阳离子微球和多核苷酸能自发结合，通过将多核苷酸和MC简单地共施用也可形成IMP/MC复合体。在多核苷酸结合前后可通过微球的大小和表面电荷对其进行表征。然后在如本文描述的建立的人外周血单核细胞(PBMC)和小鼠脾细胞试验中评估所选择批次与合适的对照相比的活性。也可在合适的动物模型中评估该制剂。
通过核苷酸碱基配对连接的非共价IMP/MC复合体可用常规方法制备。通常，用包含连接有，优选地共价连接有至少部分互补于IMP的多核苷酸(＂捕捉多核苷酸＂)的微载体制备碱基配对的IMP/MC复合体。IMP和捕捉核苷酸之间的互补片段优选至少有6、8、10或15个相邻碱基对，更优选至少20个连续碱基对。捕捉核苷酸可通过本领域公知的任一方法连接至MC，且优选在5′或3′端共价连接IMP。
在其它实施方案中，可使用结合对连接IMP/MC复合体中的IMP和MC。结合对可为受体和配体、抗体和抗原(或表位)、或任何其它以高亲和性结合的结合对(例如，Kd小于约10-8)。一类优选的结合对为生物素和链亲和素或为生物素和亲和素，它们可形成紧密的复合体。当使用结合对介导IMP/MC复合体的结合时，用结合对中的一员衍生IMP，一般通过共价键合衍生，且用结合对中的另一员衍生MC。这两种衍生化合物的混合将导致IMP/MC复合体的形成。
许多IMP/MC复合体的实施方案不包括抗原，且某些实施方案排除与疾病或紊乱相关的抗原，其中所述疾病或紊乱为IMP/MC复合体的治疗对象。在另外的实施方案中，IMP还结合一个或多个抗原分子。抗原可以以多种方式(包括共价和/或非共价相互作用)与IMP/MC复合体中的IMP部分偶联，这一点参见例如WO 98/16247中描述。另外，抗原可与微载体连接。IMP上连接有抗原的IMP/MC复合体中，抗原与IMP的连接可通过本文中描述的技术和本领域公知的技术来实现，这些技术包括但不限于直接的共价键合、通过交联剂部分(其可包括间隔臂)的共价偶联、通过特异结合对(如生物素和亲和素)的非共价偶联以及通过静电或疏水作用的非共价偶联。
本发明的方法本发明提供了调节个体免疫反应的方法，其中个体优选地为哺乳动物，更优选地为人，该方法包括施与个体此处所述的含有ISS的多核苷酸。免疫调节可包括刺激Th1-类免疫反应和/或抑制或降低Th2-类免疫反应。含有ISS的多核苷酸以足以调节免疫反应的量施用。如本文所述，免疫反应的调节可为对体液和/或细胞免疫反应的调节，并且该调节可用本领域的标准技术及按此处所述测定。
许多个体适于接受本文所述的免疫调节性多核苷酸。优选地(但非必需)，个体为人。
在某些实施方案中，个体患有与Th2-类免疫反应相关的疾病，如变态反应或变态反应-诱导的哮喘。含有ISS的多核苷酸的施用将导致免疫调节，提高一种或多种与Th1-类反应相关的细胞因子的水平，这可导致与个体的变应原反应相关的Th2-类反应特征的减少。对患有Th2-类反应相关疾病的个体的免疫调节可导致减轻或改善一个或多个疾病症状。如果疾病为变态反应或变态反应-诱导的哮喘，一个或多个症状的改善包括减轻一个或多个以下症状鼻炎、变应性结膜炎、循环IgE水平、循环组胺水平和/或对′抢救性′吸入器疗法(例如，通过计量给药吸入器或喷雾器而施用的吸入舒喘灵)的需要。
在进一步的实施方案中，接受本发明免疫调节治疗的个体为接受疫苗的个体。疫苗可为预防性疫苗或治疗性疫苗。预防性疫苗包含与个体可能有危险罹患的疾病相关的一个或多个表位(例如，分枝结核杆菌抗原作为疫苗用于预防结核病)。治疗性疫苗包含与感染个体的特定疾病相关的一个或多个表位，如结核病患者体内的分枝结核杆菌或牛结核分枝杆菌(M.bovis)表面抗原、在产生变态反应的个体体内使个体产生变应性的抗原(即变态反应脱敏疗法)、来自癌症患者的肿瘤细胞(例如，在美国专利号5,484,596中所述)、或癌症患者的肿瘤相关抗原。如以下实施例3中所示，将含有ISS的多核苷酸与肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原(HBsAg))联合施用导致灵长类体内的抗HBsAg抗体效价较仅施用HBsAg时产生的抗体效价升高。
含有ISS的多核苷酸可以与疫苗联用(例如，与疫苗一同注射或同时但分别注射)或含有ISS的多核苷酸可分开施用(例如，在疫苗施用前后至少12小时)。在某些实施方案中，疫苗的抗原是ISS的一部分，该抗原共价或非共价连接至ISS。与接受疫苗但不接受含有ISS的多核苷酸的个体比较，对接受疫苗的个体施用免疫调节性多核苷酸治疗导致对疫苗的免疫反应移向Th1-类反应。向Th1-类反应的偏移可通过如下来识别，即，出现对疫苗中抗原的迟发型超敏(DTH)反应、升高的IFN-γ和其它Th1-类反应相关细胞因子、特异针对疫苗中抗原的CTL的产生、特异针对疫苗中抗原的IgE水平的下降或减少、特异针对疫苗中抗原的Th2-相关抗体的减少、和/或对疫苗中抗原具有特异性的Th1-相关抗体的升高。在治疗性疫苗的情况下，含有ISS的多核苷酸和疫苗的施用可导致疫苗所欲治疗的疾病的一种或多种症状得以改善。正如本领域技术人员显而易见的，改进的确切症状和改进的方式取决于所欲治疗的疾病。例如，当治疗性疫苗针对结核病时，用含有ISS的多核苷酸与疫苗治疗导致咳嗽、胸膜或胸壁痛、发烧和/或本领域公知的其它症状减轻。当疫苗为用于变态反应脱敏疗法中的变应原时，所述治疗导致变态反应症状的减轻(例如，鼻炎、变应性结膜炎减轻、循环IgE水平和/或循环组胺水平降低)。
本发明的其它实施方案涉及对已患有疾病或紊乱如癌症或感染性疾病的个体的免疫调节治疗。癌症是有吸引力的进行免疫调节的靶标，因为大多数癌表达肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异性抗原，这些抗原在体内其它细胞上不存在。刺激针对肿瘤细胞的Th1-类反应导致免疫系统直接和/或旁观者杀伤肿瘤细胞，导致肿瘤细胞减少和/或症状减轻。将含有ISS的多核苷酸施用给患有癌的个体可导致刺激针对肿瘤细胞的Th1-类免疫反应。此免疫反应通过细胞免疫系统的细胞(如CTL)或体液免疫系统的组分的直接作用，或通过对免疫系统靶向细胞的邻近细胞的旁观者效应杀伤肿瘤细胞。参见如Cho等人(2000)，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)18509-514。在癌症的情况下，含有ISS的多核苷酸的施用还可包括一种或多种其它治疗剂如抗肿瘤抗体、化学治疗方案和/或放射治疗的施用。抗肿瘤抗体包括但不限于抗肿瘤抗体片段和/或其衍生物、以及单克隆抗肿瘤抗体、片段和/或其衍生物，它们是本领域公知的，且在肿瘤治疗中施用此类抗体制剂(例如，RITUXAN(rituximab)；HERCEPTIN(trastuzumab))也为本领域公知。一种或多种其它治疗剂的施用可在含有ISS的多核苷酸施用前、后和/或同时进行。
根据本发明的免疫调节治疗也可用于患有感染性疾病的个体，其中感染性疾病尤其是抗体液免疫反应的感染性疾病(例如，由分枝杆菌感染和胞内病原体引起的疾病)。免疫调节治疗可用于治疗由细胞病原体(如细菌或原生动物)或亚细胞病原体(如病毒)引起的感染性疾病。可将ISS治疗施与患有分枝杆菌疾病的个体，其中疾病如结核病(例如，分枝结核杆菌和/或牛结核分枝杆菌感染)、麻风病(即麻风分枝杆菌(M leprae)感染)或海分枝杆菌(M.marinum)或溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)感染。ISS治疗也可用于治疗病毒性感染，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒尤其是单纯疱疹病毒和乳头瘤病毒感染。由胞内寄生虫引起的疾病也可受益于ISS治疗，所述疾病如疟疾(例如，间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、恶性疟原虫(P.falciparum)和/或三日疟原虫(P.malariae)引起的感染)、利什曼病(例如，杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、热带利什曼原虫(L.tropica)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、巴西利什曼原虫(L.braziliensis)、秘鲁利什曼原虫(L.peruviana)、婴儿利什曼原虫(L.infantum)、L.chagasi和/或埃塞俄比亚利什曼原虫(Leishmania aethiopica)引起的感染)、以及弓形体病(即鼠弓形体(Toxoplasmosis gondii)引起的感染)。ISS治疗也可用于治疗寄生虫病如血吸虫病(即由血吸虫属血吸虫如埃及血吸虫(S.haematobium)、曼氏血吸虫(S.mansoni)、日本血吸虫(S.japonicum)和湄公血吸虫(S.mekongi)引起的血吸虫感染)和枝睾吸虫病(即由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)引起的感染)。将含有ISS的多核苷酸施与患有感染性疾病的个体可导致感染性疾病的症状改善。在一些实施方案中，感染性疾病非病毒性疾病。
本发明还提供了升高或刺激个体的至少一种Th1-相关细胞因子的方法，其中所述Th1-相关细胞因子包括IL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ和IFN-α。在某些实施方案中，本发明提供了升高或刺激个体体内的IFN-γ的方法，所述个体尤其是需要增高的IFN-γ水平的个体，其方式是通过给个体施用有效量的含有ISS的多核苷酸，从而升高IFN-γ。需要增高的IFN-γ水平的个体为那些患有一般对施用IFN-γ有反应的疾病的个体。此类疾病包括许多炎性疾病，包括但不限于溃疡性结肠炎。此类疾病也包括许多纤维化疾病，包括但不限于特发性肺纤维化(IPF)、硬皮病、辐射引发的皮肤纤维化、肝纤维化(包括血吸虫病引发的肝纤维化)、肾纤维化以及其它可通过施用IFN-γ而改善的疾病。施用本发明的含有ISS的多核苷酸将导致IFN-γ水平升高，并导致响应IFN-γ的疾病的一种或多种症状得以改善、一种或多种症状得以稳定和/或疾病的发展得以防止或减缓(例如，减轻或消除额外的损伤或症状)。
本发明的方法可与组成疾病护理标准的其它疗法联用，如对IPF与施用抗炎剂诸如全身皮质类固醇疗法(如考的松)联用。
在某些实施方案中，本发明提供了升高个体体内的IFN-α的方法，所述个体尤其是需要增高的IFN-α水平的个体，其方式是通过给个体施用有效量的含有ISS的多核苷酸，从而升高IFN-α水平。需要增高的IFN-α的个体为那些患有一般对施用IFN-α(包括重组IFN-α)有反应的疾病的个体，此类疾病包括但不限于病毒性感染和癌症。在某些实施方案中，如本文所述，能有效诱导IFN-α产生的免疫调节性多核苷酸除了包含ISS外，还包含一个或多个TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，尤其是包含在ISS的5’端。该额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列可紧挨着ISS的5′，或位于ISS的5′但两者之间有1个或多个碱基的间隔。在一些实施方案中，该额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列通过将T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而产生。在一些实施方案中，如果额外的TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列是通过将T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而产生的，则该额外的序列可与ISS一起产生TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
可特别有效地诱导IFN-α产生的免疫调节性多核苷酸的实例包括但不限于SEQ ID NO1、14、19、46、24、11、18、35、12、13、28和36。
施用本发明的含有ISS的多核苷酸可导致IFN-α水平升高，并导致响应IFN-α的疾病的一种或多种症状得以改善、一种或多种症状得以稳定和/或疾病的发展得以防止或减缓(例如，减轻或消除额外的损伤或症状)。本发明的方法可与组成疾病护理标准的其它疗法联用，如对于病毒性感染可与施用抗病毒剂联用。
本发明还提供了对患有IgE-相关疾病的个体降低其IgE水平，尤其是血清IgE水平的方法，其方式是向个体施用有效量的含有ISS的多核苷酸。在此类方法中，免疫调节性多核苷酸可单独施用(如，无抗原)或与抗原如变应原联合施用。IgE的降低将导致IgE-相关疾病的一种或多种症状得以改善。此类症状包括变态反应症状(如鼻炎、结膜炎)，症状改善包括对变应原的敏感性降低、发生变态反应的个体的变态反应症状减轻或变态反应的严重程度降低。因此，本发明也提供了治疗个体的变应性疾病的方法。在一些实施方案中，治疗变应性疾病的方法包括将免疫调节性多核苷酸与一定量或剂量的抗原联合施用。对于任何额外的抗原施用，所施用的抗原量或剂量在治疗期间可保持相同、或可减少或增加(如在常规的脱敏疗法中一样)。
在一些实施方案中，本发明提供了刺激个体产生CTL的方法，所述个体尤其是需要增高的CTL数目和/或活性的个体，该方法包括施用有效量的含有ISS的多核苷酸给个体，从而提高CTL的产生。需要增高的CTL产生的个体为那些患有一般对CTL活性有反应的疾病的个体。此类疾病包括但不限于癌症和胞内感染。施用本发明的含有ISS的多核苷酸将导致CTL水平升高，并导致响应CTL活性的疾病的一种或多种症状得以改善、一种或多种症状得以稳定和/或疾病的发展得以防止或减缓(例如，减轻或消除额外的损伤或症状)。
本发明的方法包括本文所述的任何实施方案，如以免疫调节性多核苷酸/微载体复合体形式(有或没有抗原，或在施用过程中有或没有抗原)，或与抗原紧邻连接的形式施用含有ISS的多核苷酸。
对本领域技术人员显而易见的是，对于施用含有ISS的多核苷酸的特定适应症，本发明的方法可与其它疗法联用。例如，ISS疗法可与抗疟疾药如氯喹联用施与疟疾患者、可与杀利什曼原虫药如戊烷脒和/或别嘌呤醇联用施与利什曼病患者、可与抗分枝杆菌药如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇联用施与结核病患者、或可与变应原脱敏疗法联用施与特应性(变态反应)患者。
如此处所述，含有ISS的多核苷酸的施用还可包括一种或多种其它免疫治疗剂(即通过免疫系统起作用的治疗剂和/或来自于免疫系统的治疗剂)的施用，其中所述免疫治疗剂包括但不限于细胞因子、佐剂和抗体(包括但不限于抗体片段和/或衍生物，以及单克隆抗体、其片段和/或衍生物)。治疗性抗体的实例包括那些用于癌症的抗体(如抗肿瘤抗体)。此类额外免疫治疗剂的施用适用于本文所述的所有方法。
含有ISS的多核苷酸也可与佐剂联用。与仅包含ISS和抗原的组合物所产生的免疫反应相比，抗原与ISS和佐剂联合施用可导致对抗原的免疫反应增强，并由此导致增强的免疫反应。佐剂为本领域公知，其包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、明矾(铝盐)、脂质体和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合适的佐剂还包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝杆菌细胞壁制品、单磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈及衍生物、以及免疫刺激复合物(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344873-875中描述的那些免疫刺激复合物、以及基于脂的佐剂和本文描述的其它佐剂。对于兽用及在动物体内产生抗体，可使用弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)的促有丝分裂组分。
施用和评估免疫反应如此处所述，含有ISS的多核苷酸可与其它药剂和/或免疫原性试剂和/或免疫刺激剂联合施用，并可组合其生理可接受载体(就此本发明包括这些组合物)。含有ISS的多核苷酸可为本文描述的任何此类多核苷酸。
因此，含有ISS的多核苷酸可与其它免疫治疗剂联用，所述免疫治疗剂包括但不限于细胞因子、佐剂和抗体。
如所有的免疫原性组合物一样，特定的含有ISS的多核苷酸制剂的免疫有效量和施用方法根据个体、欲治疗的疾病和为本领域技术人员显然的其它因素的不同而不同。待考虑的因素包括所施用抗原的抗原性、含有ISS的多核苷酸是否与佐剂、递送分子或和/或抗原联合施用或与它们共价连接、施用途径和欲施用的免疫给药次数。此类因素为本领域公知，并且不用过多试验而对它们作出确定也属于本领域技术人员的技术范围。合适的剂量范围是能为免疫反应提供所需调节(如刺激IFN-γ和/或IFN-α)的剂量范围。当针对抗原的免疫反应为所需要的时，合适的剂量范围为能为抗原免疫反应提供所需调节的剂量范围。通常，剂量由施用于患者的含有ISS的多核苷酸的量而不是由所施用的含有ISS的组合物的总量而确定。含有ISS的多核苷酸的有用剂量范围(以递送的含有ISS的多核苷酸的量给出)可以例如为下列任一个约1至500μg/kg，100至400μg/kg，200至300μg/kg，1至100μg/kg，100至200μg/kg，300至400μg/kg，400至500μg/kg。施与每一患者的绝对量取决于药理学特性如生物利用度、清除率和施用途径。
特定的含有ISS的多核苷酸制剂的有效量和施用方法根据患者个体、所需结果和/或疾病类型、疾病价段和本领域技术人员明了的其它因素可不同。具体应用时的施用途径对本领域技术人员是显而易见的。施用途径包括但不限于局部的、皮肤的、经皮肤的、经粘膜的、表皮的、肠胃外的、肠胃的以及鼻咽的和肺的(包括经支气管的和经肺泡的)施用途径。合适的剂量范围为这样的剂量范围，其提供了足够的含有ISS的组合物，通过测定血液水平足以达到约1-10μM的组织浓度。施与每一患者的绝对量取决于药理学特性如生物利用度、清除率和施用途径。
如此处所述，APC和具有高浓度APC的组织为含有ISS的多核苷酸的优选靶。因此，将含有ISS的多核苷酸施用至APC以相对高的浓度存在的哺乳动物皮肤和/或粘膜处是优选的。
本发明提供了适用于局部应用的含有ISS的多核苷酸制剂，包括但不限于生理可接受的植入物、软膏、霜剂、洗剂和凝胶。局部施用为例如通过其中分散有递送系统的敷料或绷带施用、将递送系统直接施用入切口或开放性伤口、或通过定向于目标位点的经皮肤施用装置来施用。其中分散有含有ISS的多核苷酸的霜剂、洗剂、凝胶或软膏适用于用作局部软膏或伤口充填剂。
优选的皮肤施用途径为那些对皮肤侵害最小的途径。这些方式中优选的为经皮肤递送、表皮施用和皮下注射。在这些方式中，由于预计皮内组织中存在较高浓度的APC，优选表皮施用。
经皮肤施用通过应用可使得含有ISS的多核苷酸透过皮肤并进入血流的霜剂、洗剂、凝胶等来实现。适于经皮肤施用的组合物包括但不限于直接应用于皮肤或掺入保护性载体如经皮肤载置(所谓＂贴剂＂)中的可药用混悬液、油、霜剂和软膏。合适的霜剂、软膏等的实例可例如在Physician′s Desk Reference中找到。
对于经皮肤递送，离子电渗是一合适的方法。离子电渗递送可通过市售的贴剂而完成，其中贴剂可以通过未破损皮肤持继递送它们的产物几天或更长时间。该方法的使用使得药物组合物能以相对大的浓度受控递送、并允许输注组合药物及同时使用吸收促进剂。
用于该方法中的示例性贴剂产品是Los Angeles，CA的GeneralMedical Company的商标为LECTRO PATCH的产品。该产品通过电子方式维持贮库电极在中性pH并能适应于提供不同浓度的剂量以及连续地和/或周期性地给药。贴剂的准备和使用应按照与LECTRO PATCH产品在一起的、厂商印制的说明书进行；这些说明书在此引用作为参考。其它封闭式贴剂体系也是合适的。
对于经皮肤递送，低频超声递送也是一合适的方法。Mitragotri等人(1995)科学(Science)269850-853。低频超声频率(约1MHz)的应用允许治疗组合物(包括那些具有高分子量的治疗组合物)的总体受控递送。
表皮施用基本上涉及机械刺激或化学刺激最外层表皮，而且所述刺激将足以激发对该刺激的免疫反应。具体而言，该刺激应足以将APC吸引至刺激位点。
一个示例性的机械刺激方式使用多个直径非常狭窄的短齿，其可用于刺激皮肤并将APC吸引至刺激位点，以摄取从齿的末端转移出的ISS。例如，法国Lyon的Pasteur Merieux生产的MONOVACC旧结核菌素试验包含适于导入含免疫调节性多核苷酸的组合物的装置。
该装置(由Swiftwater，PA的Connaught Laboratories，Inc.在美国供销)由在一端具有注射器推进器和在另一端具有齿盘的塑料容器组成。齿盘上固定着具有一定长度的多个直径狭窄的齿，以致其恰好能刮搔表皮的最外层细胞。MONO-VACC试剂盒中的每个齿都包被有旧结核菌素；在本发明中，每个针都包被有免疫调节性多核苷酸制剂的药物组合物。该装置的使用优选按照包括在该装置产品中的、厂商所写的说明书进行。在此实施方案中也可使用的类似装置为目前用于实施变态反应试验的那些。
表皮施用含有ISS的多核苷酸的另一合适方法是使用化学品，该化学品能刺激表皮的最外层细胞，因此激发可吸引APC至该区域的足够的免疫反应。一个实例为角质裂解剂，如由Noxema Corporation以商标NAIR卖出的市售局部脱毛霜剂中使用的水杨酸。该方法也可用于实现粘膜的上皮施用。化学刺激剂也可与机械刺激物联合应用(例如，如果MONO-VACC类齿也包被有化学刺激剂，则存在此联合应用)。含有ISS的多核苷酸也可悬于包含化学刺激剂的载体中或与该化学刺激剂共施用。
肠胃外的施用途径包括但不限于电注射(离子电渗)或直接注射如直接注射入中央静脉、静脉内注射、肌内注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射。适用于肠胃外施用的含有ISS的多核苷酸的制剂通常配制在USP水或注射用水中，并且还可包含pH缓冲剂、盐填充剂、防腐剂和其它可药用赋形剂。用于肠胃外注射的免疫调节性多核苷酸可配制在可药用无菌等渗溶液如注射用盐水和磷酸盐缓冲盐水中。
胃肠施用途径包括但不限于吞咽和直肠途径。本发明包括的适于胃肠施用的含有ISS的多核苷酸的制剂，包括但不限于用于吞咽给药的可药用粉剂、片剂或液体及用于直肠施用的栓剂。对本领域技术人员显而易见的是片剂或栓剂还将包含可药用固体如淀粉，以填充组合物。
鼻咽的和肺的施用可通过吸入实施，并包括递送途径如鼻内途径、经支气管途径和经肺泡途径。本发明包括适于吸入施用的含有ISS的多核苷酸的制剂，包括但不限于用于形成气雾的液态悬浮剂及用于干粉吸入递送系统的粉剂。对于吸入施用ISS制剂，适用的装置包括但不限于喷雾器、蒸发器、雾化器和干粉吸入递送装置。
本领域熟知，用于本文所述施用途径的溶液或悬液可包括任一或多种下列组分无菌稀释剂如用于注射的水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制品可封装在用玻璃或塑料制备的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
本领域熟知，适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(如果溶于水的话)或分散体和用于当时制备可注射的无菌溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑制细菌的水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须无菌并应为流动性达到易于注射程度的流体。该组合物在制备和存储条件下应是稳定的，并且必须在抗微生物如细菌或真菌的污染作用的条件下存储。载体可为含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适混合物的溶剂或分散介质。合适的流动性可以如通过使用包衣剂如卵磷脂、对于分散体通过保持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在组合物中包括等张剂，如糖、聚醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化钠可能是优选的。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶而产生。
本领域熟知，无菌可注射液可通过将活性化合物以所需量掺入合适的溶剂中，然后过滤除菌而制备，其中所述溶剂根据需要具有上面列举的一种成分或多种成分的组合。一般，分散体通过将活性化合物掺入无菌赋形剂而制备，其中所述无菌赋形剂包含基本分散介质和所需的来自上述的其它成分。对于用于制备无菌可注射液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生含有来自前述无菌过滤溶液的活性成分及任何其它所需成分的粉末。
递送途径的选择可用于调节所引发的免疫反应。例如，当流感病毒载体通过肌内或表皮(基因枪)途径施用时，IgG效价和CTL活性是相同的；但是，肌肉接种主要产生IgG2a，而表皮途径主要产生IgG1。Pertmer等人(1996)，病毒学杂志(J.Virol.)706119-6125。因此，本领域技术人员可利用本发明免疫调节性多核苷酸的不同施用途径所引发的免疫原性的轻微差别。
上述组合物和施用方法旨在描述而不用于限制本发明含有ISS的多核苷酸制剂的施用方法。制备各种组合物和装置的方法在本领域技术人员的能力范围内，在此不再详述。
针对ISS的免疫反应可以按任一本领域公知的方法进行分析(定性和定量分析)，包括但不限于测定抗原特异性的抗体产生(包括测定特异的抗体亚类)、特异淋巴细胞群如CD4+T细胞、NK细胞或CTL的活化、细胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10或IL-12的产生和/或组胺的释放。测定特异性抗体反应的方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，并且为本领域熟知。特定类型淋巴细胞如CD4+T细胞数目的测定可例如用荧光激活的细胞分选法(FACS)完成。细胞毒性和CTL试验可例如如Raz等人(1994)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)919519-9523和Cho等人(2000)所述进行。细胞因子浓度可例如通过ELISA测定。这些和其它用于评估针对免疫原的免疫反应的试验为本领域熟知。参见如细胞免疫学中的选择方法(Selected Methods inCellular Immunology)(1980)Mishell和Shiigi编辑，W.H.Freeman andCo.。
优选地，刺激，即引发和/或增强Th1-类反应。关于本发明，对Th1-类免疫反应的刺激可通过体外或离体测定ISS处理的细胞的细胞因子产生并与未用ISS处理的细胞相比来确定。确定细胞的细胞因子产生的方法包括那些本文中描述的方法及本领域公知的任何方法。响应ISS处理产生的细胞因子的类型表明了细胞产生的是偏向Th1-类或Th2-类的免疫反应。如此处所用，术语＂偏向于Th1-类的＂细胞因子产生是指在存在刺激剂时Th1-类免疫反应相关细胞因子的产生与缺乏刺激时此类细胞因子的产生相比，前者可测量地升高。此类偏向于Th1-类的细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-12、IFN-γ和IFN-α。相反，＂偏向于Th2-类的细胞因子＂是指那些与Th2-类免疫反应相关的细胞因子，其包括但不限于IL-4、IL-5和IL-13。可用于测定ISS活性的细胞包括免疫系统的细胞、分离自宿主的原代细胞和/或细胞系，优选地为APC和淋巴细胞，甚至更优选地为巨噬细胞和T细胞。
对Th1-类免疫反应的刺激也可在使用含有ISS的多核苷酸处理的宿主中测定，并且可用本领域公知的任一方法测定，包括但不限于(1)任选地与接触过抗原的或接触过抗原并被攻击过的、未用ISS处理过的对照比较，在ISS处理的宿主中抗原攻击前后测定到IL-4或IL-5的水平降低；或检测到较低(或甚至没有检测到)IL-4或IL-5水平，(2)与接触过抗原的、或接触过抗原并被攻击过的未用ISS处理过的对照比较，在ISS处理的宿主中抗原攻击前后IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)的水平升高；或检测到较高的IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)水平；(3)与未用ISS处理的对照比较，在ISS处理的宿主中产生＂偏向于Th1-类的＂抗体；和/或(4)与接触过抗原的或接触过抗原并被攻击过的、未用ISS处理过的对照比较，在ISS处理的宿主中抗原攻击前后检测到抗原特异性IgE的水平降低；或检测到较低(或甚至没有检测到)抗原特异性IgE的水平。这些测定中的许多可通过使用此处描述的方法或任一本领域公知的方法体外或离体测量由APC和/或淋巴细胞，优选地由巨噬细胞和/或T细胞产生的细胞因子来实现。这些测定中的一些测定可通过使用此处描述的方法或任一本领域公知的方法测量抗原特异性抗体的类和/或亚类来实现。
应答含有ISS的多核苷酸处理所产生的抗原特异性抗体的类和/或亚类表明细胞产生的是偏向于Th1-类或偏向于Th2-类的免疫反应。如此处所用，术语＂偏向于Th1-类的＂抗体产生是指与Th1-类免疫反应相关的抗体(即Th1-相关抗体)的产生可测定地升高。可测定一种或多种Th1相关抗体。此类偏向于Th1-类的抗体的实例包括但不限于人IgG1和/或IgG3(参见如Widhe等人(1 998)Scand.J Immunol.47575-581和deMartino等人(1999)Ann.Allergy Asthma Immunol.83160-164)和鼠IgG2a。相反，＂偏向于Th2-类的抗体＂是指那些与Th2-类免疫反应相关的抗体，其包括但不限于人IgG2、IgG4和/或IgE(参见如Widhe等人(1998)和de Martino等人(1999))以及鼠IgG1和/或IgE。
由于施用含有ISS的多核苷酸而发生的对偏向于Th1-类的细胞因子的诱导可导致增强的细胞免疫反应，如那些由NK细胞、细胞毒杀伤细胞、Th1辅助细胞和记忆细胞实施的免疫反应。这些反应用在抗病毒、真菌、原生动物寄生虫、细菌、变应性疾病、哮喘及肿瘤的预防性或治疗性疫苗接种上尤其有益。
在一些实施方案中，Th2反应被抑制(减少)。Th2反应的抑制可通过如Th2相关细胞因子(诸如IL-4和IL-5)水平的降低、Th2相关抗体水平的降低、及应答变应原的IgE的降低和组胺释放的减少来确定。
本发明的试剂盒本发明提供了试剂盒。在某些实施方案中，本发明的试剂盒一般包含一个或多个容器，容器中包含有本文所述的任何含有ISS的多核苷酸。试剂盒还可包含一套有关含有ISS的多核苷酸的用途的适当说明书，通常为书面说明书，所述用途为在任一本文所述的方法中的应用(例如，免疫调节、改善感染性疾病的一种或多种症状、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相关疾病)。
试剂盒可包含包装在任一方便合适的包装中的含有ISS的多核苷酸。例如，如果该含有ISS的多核苷酸为干燥制剂(例如，冷冻干燥的或干粉)，通常使用带弹性塞的小瓶，这样通过弹性塞注入液体可容易地将含有ISS的多核苷酸重悬。带有无弹性可摘取封口(如封口玻璃)的安瓿或带有弹性塞的安瓿最适用于含有ISS的多核苷酸的液体制剂。也可考虑使用与特定的装置如吸入器、鼻施用装置(如喷雾器)或输注装置如微型泵组合应用的包装。
有关含有ISS的多核苷酸的用途的说明书通常包括剂量、给药方案及针对预期使用方法的施用途径的信息。用于含有ISS的多核苷酸的容器可为单位剂量、大包装(如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明试剂盒中提供的说明书一般为标签或包装插入物上的书面说明书(如，包括在试剂盒中的纸片)，但可机读的说明书(如在磁盘或光存储盘上携带的说明书)也可接受。
在一些实施方案中，试剂盒还包含抗原(或包含一种或多种抗原)，该抗原可与或不与含有ISS的多核苷酸包装在同一容器(制剂)中。文中已描述了抗原。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包含以免疫调节性多核苷酸/微载体复合体(IMP/MC)形式存在的含有ISS的多核苷酸，并还可包含一套涉及该IMP/MC复合体用途的说明书，通常为书面说明书，所述用途为在任一此处所述的方法中的应用(例如，免疫调节、改善感染性疾病的一种或多种症状、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相关疾病)。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于产生IMP/MC复合体的材料，通常包括分开装有IMP和MC的容器，但在某些实施方案中提供的是用于产生MC的材料而不是预形成的MC。IMP和MC优选以如下形式提供，所述形式允许所提供的IMP和MC在混合后可形成IMP/MC复合体。当IMP/MC复合体通过非共价键连接时，优选这种配置。当IMP和MC待通过异双功能交联剂交联时；当IMP或MC以＂活化＂形式(例如，连接在异双功能交联剂上，这样可获得与IMP反应的部分)提供时，也优选这种配置。
对于包含液相MC的IMP/MC复合体，试剂盒优选地包含一个或多个容器，容器中含有用于产生液相MC的材料。例如，对于水包油的乳液MC，IMP/MC试剂盒可包含一个或多个含有油相和水相的容器。乳化容器中的内容物以产生MC，然后其可与IMP混合，优选地与已修饰而掺入了疏水部分的IMP混合。此类材料包括用于产生水包油乳液的油和水，或者包括含有冷冻干燥脂质体组分(如磷脂、胆固醇和表面活性剂的混合物)的容器加上含有水相(例如，可药用的水性缓冲液)的一个或多个容器。
提供下列实施例来举例阐述而非限制本发明。
实施例实施例1含有ISS的多核苷酸对鼠细胞的免疫调节试验了免疫调节性多核苷酸(即含有ISS)或对照多核苷酸(即不合ISS)对小鼠脾细胞的免疫调节活性。受试多核苷酸为充分修饰的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。在受试多核苷酸中设置了5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO59)(阳性对照)和5′-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO60)(阴性对照)。
BALB/c小鼠脾的碎片用溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的胶原酶/分散酶(0.1U/mL/0.8U/mL)于37℃消化45分钟，然后将消化的碎片通过金属筛机械分散。离心沉淀分散的脾细胞，然后重悬于新鲜培养基(具10％胎牛血清的RPMI 1640，加上50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺和0.05mM β-巯基乙醇)中。
将小鼠脾细胞分散在96孔板的孔中(7×107个细胞/ml)并于37℃孵育1小时。加入2倍浓度的试验样本或对照100μL，并再孵育细胞24小时。从每孔收获培养基并通过ELISA试验细胞因子浓度。在多个浓度包括5.0、1.0和0.1μg/ml下试验多核苷酸。对照样本包括单独的培养基和PANSORBIN热灭活的、福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(SAC)(CalBiochem)。
用夹心ELISA测定IFN-γ。来自小鼠脾细胞试验的培养基在包被有抗IFN-γ单克隆抗体的微滴定板(Nunc)中孵育。用生物素化的抗IFN-γ抗体和链亲和素-辣根过氧化物酶偶联的二级抗体检测结合的IFN-γ，用生色过氧化物酶底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)在过氧化物酶存在下显色，并用Emax精确微板读数仪(Molecular Devices)在450nm处测定光吸收值而定量。
与对照多核苷酸相比，含有ISS的免疫调节性多核苷酸实质性地提高了小鼠脾细胞IFN-γ的分泌。表2-5总结了应答5μg/ml多核苷酸所产生的IFN-γ的试验结果。
表2.小鼠脾细胞试验-IFNγ(pg/ml)
表3.小鼠脾细胞试验-IFNγ(pg/ml)
表4.小鼠脾细胞试验-IFNγ(pg/ml)
表5.小鼠脾细胞试验-IFNγ(pg/ml)
实施例2含有ISS的多核苷酸对人细胞的免疫调节试验了免疫调节性多核苷酸(即含有ISS)或对照样本对人外周血单核细胞(PBMC)的免疫调节活性，其中所述对照样本包括不含ISS的多核苷酸(5′-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO60)和5′-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO61))、SAC及仅培养基。受试多核苷酸为充分修饰的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。
用肝素抗凝的注射器通过静脉穿刺从自愿者收集外周血。将血液置于FICOLL(Amersham Pharmacia Biotech)垫层上并离心。收集位于FICOLL分界处的PBMC，然后用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次。重悬细胞，在24孔板或48孔板中以2×106个细胞/mL在含10％热灭活的人AB血清加上50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素、300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1×MEM非必需氨基酸(NEAA)的RPMI1640中培养细胞。
细胞在存在20μg/ml受试样本(免疫调节性多核苷酸或对照)时培养24小时，然后从每孔收集无细胞培养基并检测IFN-γ和IFN-α浓度。用来自BioSource International，Inc.的CYTOSCREENTMELISA试剂盒按照厂商的说明书检测IFN-γ和IFN-α。
含有ISS的多核苷酸刺激人PBMC分泌IFN-γ和/或IFN-α。在人PBMC试验中，IFN-γ的背景水平可随着供体的不同而不同，甚至是明显不同。但其它细胞因子如IFN-α显示了大体稳定的活化模式并且在未受刺激的情况下常规显示低的背景水平。来自独立PBMC供体的此类试验结果的例子总结在表6中。
如表6中所示，对人细胞而言，某些免疫调节性多核苷酸可有效升高IFN-γ水平。同样如表6中所示，对人细胞而言，某些免疫调节性多核苷酸在提升IFN-α水平方面尤其有效。此类多核苷酸通常包括那些在ISS的5′含有至少一个TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列的多核苷酸，或那些通过将T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而产生的含有至少一个TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列的多核苷酸。此类免疫调节性多核苷酸的例子包括但不限于SEQ ID NO1，14，19，46，24，11，18，12，13，28和36。
表6.人PBMC试验-IFN(pg/ml)
表6(续)
表6(续)
表6(续)
表6(续)
表6(续)
表6(续)
实施例3灵长类动物对抗原+ISS的免疫反应检测了狒狒对存在本发明的含有ISS的多核苷酸时施用的乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫反应。
HBsAg为酵母中产生的重组HBsAg。在研究开始时，狒狒的组中(每组5只)包括雄性和雌性狒狒，体重范围为8-31kg(组平均体重为13-16kg)。
通过肌内注射(IM)1ml体积的20μg HBsAg免疫狒狒三次，间隔期为两个月(第0、2和4月)。如下所列出的，一些组还接受了ISS加HBsAg。
在免疫前和免疫后2周收集所有动物的血。如下测定抗HBsAg IgG效价。用包被有来自人血浆的HBsAg的珠，使用AUSAB EIA商业试剂盒(Abbott Labs Cat.#9006-24和1459-05)分析狒狒血清样本。一系列范围在0-150mIU/ml的来自人血浆的HBsAg阳性和阴性标准品与试验样本一起进行测试。生物素偶联的HBsAg和兔抗-生物素-HRP偶联的抗体用作检测用的二级抗体复合体。该试验用邻苯二胺(OPD)显色，并在492nm处测定吸光值，在600nm处扣除本底(Quantum II分光光度计，Abbott Labs)。根据厂商确定的参数绘制标准曲线，应用样本的吸光值从此曲线确定相应的抗HBsAg浓度，以毫国际单位/ml(mIU/ml)表示。对于稀释的样本，以样本产生的导致0-150mIU/ml值的吸光度为基础来定量，然后乘以稀释系数可得到终浓度。
用单因素分差设计的比较(α＝0.05)，通过方差分析(NCSS97统计软件程序，Kaysville，UT)对对数变换数据进行统计学分析。认为p≤0.05时具有显著性。
试验动物组如下进行免疫组1-20μg HBsAg；组2-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO59(ISS)；组3-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO60(无ISS)；组4-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO38(ISS)；组5-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO2(ISS)；组6-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO18(ISS)；组7-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO35(ISS)；研究结果如下表7所示。与仅施用HBsAg或施用HBsAg和无ISS的寡核苷酸相比，联合施用包含ISS序列的寡核苷酸与HBsAg导致增高的抗HBsAg抗体效价。在成对比较中，组2(ISS寡核苷酸)中检测到的免疫反应与组3(无ISS寡核苷酸)中检测到的免疫反应有显著性差异(第一次免疫后p＜0.05，第三次免疫后p＝0.06)。在与组2的成对比较中，组2和其它接受ISS寡核苷酸的组(组4、组5、组6和组7)在产生的免疫反应方面无显著性差异。表7.免疫后血液样本中的抗HBsAg
与仅施用HBsAg(组1)的成对比较**p＜0.05；*p＝0.05
实施例4可生物降解的阳离子微球的制备如下制备阳离子聚(乳酸、羟基乙酸)(PLGA)微球。将本身粘度为0.41dl/g(0.1％，氯仿，25℃)的0.875g聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)5050聚合物以10％w/w的浓度溶解于7.875g二氯甲烷中，同时加入0.3g DOTAP。然后将澄清的有机相在500ml聚乙烯醇(PVA)水溶液(0.35％w/v)中用实验室混合器(Silverson L4R，Silverson Instruments)室温下以4000转/分钟均化30分钟而乳化。然后用通过混合器套管的循环热水升高系统温度至40℃。同时，将搅拌速率降低至1500转/分钟，并维持这些条件2小时以提取和蒸发二氯甲烷。用循环冷水将微球悬液冷却至室温。
室温下8000转/分钟离心(Beckman Instruments)10分钟分离微粒子并通过温和的浴内超声处理将其重悬于去离子水中。该离心洗涤再重复两次，以从粒子表面去除过量的PVA。将粒子的最终离心沉淀悬于约10ml水中，并过夜冷冻干燥。鉴定干燥阳离子微球粉末的大小和表面电荷平均大小(所称重的数目，μ)＝1.4；ζ电位(mV)＝32.4。
实施例5IMP/MC复合体对人细胞的免疫调节用人PBMC试验测试了多核苷酸单独的免疫调节活性和与阳离子PLGA微球(cPLGA)复合的多核苷酸的免疫调节活性。人PBMC试验如实施例2中所述进行。阳离子PLGA微球如实施例4中所述制备。测试了单独的多核苷酸，或与cPLGA微球组合的多核苷酸。受试多核苷酸为SEQ IDNO59、60、1和132。所有多核苷酸含有100％的硫代磷酸酯键，并以20μg/ml的浓度试验。以100μg/ml的浓度加入cPLGA。当多核苷酸与cPLGA复合进行测试时，将多核苷酸和cPLGA室温下预混合15分钟，然后加至培养物中。SAC(PANSORBINCalBiochem，1/5000稀释)和IMP(含ISS)(SEQ ID NO59)用作阳性对照，对照多核苷酸SEQ ID NO60和单独的细胞用作阴性对照。还单独测试了阳离子PLGA。SAC含有金黄色葡萄球菌(Cowan I)细胞物质。每次试验在四个健康供者中对样本进行测试。
如下表8中所示，含有ISS的多核苷酸(IMP)，SEQ ID NO59、1和132单独使用时可诱导IFN-γ和IFN-α。这些IMP与cPGLA阳离子微载体(cat MC)的复合显著增强了对这两种细胞因子的诱导。对照多核苷酸SEQ ID NO60当单独使用或与cPLGA复合时，均既不诱导IFN-γ也不诱导IFN-α。
表8IFN-γ(pg/ml)IFN-α(pg/ml)样本Ex1Ex2Ex3Ex4平均值Ex1Ex2Ex3Ex4平均值SEQ ID NO59 324 1036 529 653 636 9 432210843SEQ ID NO60 430 19483534 0 0 4 54 15SEQ ID NO1 287 278 2679 1057 1075 230 268 295 798398cat MC 9 5 597236 7 0 9811254SEQ ID 601 358 1474 1941 1093 115 116 515 1298 511NO59/cat MCSEQ ID 1313466534 5 0 0 43 12NO60/cat MCSEQ ID NO1/cat 1645 770 3322 3355 2273 1896 1078 2691 1728 1848MC仅细胞 114 0 1378 2 3 64 19表8(续)IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)样本Ex1Ex2Ex3Ex4平均值Ex1Ex2Ex3Ex4平均值SEQ ID NO591508344144104525 50 172 234 72 132SEQ ID NO60124 24 16 40 512 32 474 2 128SEQ ID NO132 29289363801081088 4968 72 129011821878cat MC 32 8 72 1205810 2 60 92 41SEQ ID 16409689602300 1467 948260 12981470994NO59/cat MCSEQ ID 72 16 32 316109 14 14 22 2 13NO60/cat MCSEQ ID 10604584 5172 1188 3001 5292 1050377232143332NO132/cat MC仅细胞 44 24 20 28 2920 2002 2 56为了清楚和理解的目的，对前述发明以阐述和实施例方式较详细地进行了描述，但对本领域技术人员来讲，显然可实施某些变化和改变。因此，详述和实施例不构成对本发明范围的限制，本发明范围在所附权利要求书中描述。
权利要求
1.一种包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫调节性多核苷酸，其中ISS包括下式5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)其中X1为T、G、C或Z，其中Z为5-溴胞嘧啶；其中X2为T、G、A或U；其中X3为T、A或C；其中X4为T、G或U；且其中ISS不为5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
2.根据权利要求1的免疫调节性多核苷酸，其中ISS选自TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)、TGACCGTTCG(SEQ ID NO68)、TGATCGGTCG(SEQ ID NO69)、TGATCGTTCG(SEQ ID NO70)、TGAACGGTCG(SEQ ID NO71)、GTAACGTTCG(SEQ ID NO72)、GTATCGGTCG(SEQ ID NO73)、GTACCGTTCG(SEQ ID NO74)、GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)、ZGACCGTTCG(SEQ ID NO76)，其中Z为5-溴胞嘧啶、CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)、CGACCGTTCG(SEQ ID NO78)、ZGAACGTTCG(SEQ ID NO79)，其中Z为5-溴胞嘧啶、TTAACGUTCG(SEQ ID NO82)、TUAACGUTCG(SEQ ID NO81)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO80)。
3.根据权利要求2的免疫调节性多核苷酸，其中ISS选自TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)、GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)和CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)。
4.根据权利要求3的免疫调节性多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19和SEQ ID NO132的序列。
5.一种包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫调节性多核苷酸，其中ISS包含下式5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)其中Z为5-溴胞嘧啶；其中X1为T、G、C或Z，其中Z为5-溴胞嘧啶；其中X2为T、G、A或U；其中X3为T、A或C；其中X4为T、G或U；且其中ISS不为5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66)，其中Z为5-溴胞嘧啶。
6.根据权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中ISS选自TGAAZGUTCG(SEQ ID NO83)、TGACZGTTCG(SEQ ID NO84)、TGATZGGTCG(SEQ ID NO85)、GTATZGGTCG(SEQ ID NO86)、GTACZGTTCG(SEQ ID NO87)、GAACZGTTCG(SEQ ID NO88)、GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)、ZGACZGTTCG(SEQ ID NO90)、CGAAZGTTCG(SEQ ID NO91)、ZGAAZGTTCG(SEQ ID NO92)、ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)、TTAAZGUTCG(SEQ ID NO94)、TUAAZGUTCG(SEQ ID NO95)和TTAAZGTTCG(SEQ ID NO96)，其中Z为5-溴胞嘧啶。
7.根据权利要求6的免疫调节性多核苷酸，其中ISS选自ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)和GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，其中Z为5-溴胞嘧啶。
8.根据权利要求7的免疫调节性多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO35和SEQ ID NO36的序列。
9.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸还包含至少一个TCG序列。
10.根据权利要求9的免疫调节性多核苷酸，其中TCG序列邻近于ISS的5’端。
11.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸还包含TCGA序列。
12.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸还包含至少一个T，5-溴胞嘧啶，G序列。
13.根据权利要求12的免疫调节性多核苷酸，其中T，5-溴胞嘧啶，G序列邻近于ISS的5’端。
14.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸还包含T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
15.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸的长度小于约150个碱基或碱基对。
16.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸的长度小于约100个碱基或碱基对。
17.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸的长度小于约50个碱基或碱基对。
18.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸为单链。
19.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸为双链。
20.根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸，其中该免疫调节性多核苷酸是经稳定化处理的。
21.根据权利要求20的免疫调节性多核苷酸，其中该多核苷酸包含硫代磷酸酯键。
22.包含根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸的免疫调节性组合物。
23.根据权利要求22的免疫调节性组合物，其还包含可药用赋形剂。
24.根据权利要求22的免疫调节性组合物，其还包含抗原。
25.根据权利要求24的免疫调节性组合物，其还包含可药用赋形剂。
26.一种免疫调节性多核苷酸/微载体(IMP/MC)复合体，其包含连接至可生物降解的微载体(MC)上的根据权利要求1的多核苷酸，其中该MC的尺寸小于10μm。
27.一种免疫调节性多核苷酸/微载体(IMP/MC)复合体，其包含连接至可生物降解的微载体(MC)上的根据权利要求5的多核苷酸，其中该MC的尺寸小于10μm。
28.一种调节个体免疫反应的方法，其包括将根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸以足以调节所述个体的免疫反应的量施与个体。
29.权利要求28的方法，其中所述个体患有与Th2-类免疫反应相关的疾病。
30.权利要求29的方法，其中所述与Th2-类免疫反应相关的疾病为变态反应或哮喘。
31.权利要求28的方法，其中所述个体患有感染性疾病。
32.升高个体的γ-干扰素(IFN-γ)的方法，其包括将根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸以足以升高所述个体的IFN-γ的量施与该个体。
33.权利要求32的方法，其中所述个体患有特发性肺纤维化。
34.升高个体的α-干扰素(IFN-α)的方法，其包括将根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸以足以升高所述个体的IFN-α的量施与该个体。
35.权利要求34的方法，其中所述个体患有病毒性感染。
36.升高个体的α-干扰素(IFN-α)的方法，其包括将根据权利要求9的免疫调节性多核苷酸以足以升高所述个体的IFN-α的量施与该个体。
37.权利要求35的方法，其中所述个体患有病毒性感染。
38.升高个体的α-干扰素(IFN-α)的方法，其包括将根据权利要求11的免疫调节性多核苷酸以足以升高所述个体的IFN-α的量施与该个体。
39.权利要求38的方法，其中所述个体患有病毒性感染。
40.改善个体的感染性疾病的症状的方法，其包括将有效量的根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸施与个体，其中有效量为足以改善所述感染性疾病的症状的量。
41.权利要求40的方法，其中所述感染性疾病为由细胞病原体引起的感染性疾病。
42.权利要求41的方法，其中所述由细胞病原体引起的感染性疾病选自分枝杆菌病、疟疾、利什曼病、弓形体病、血吸虫病和枝睾吸虫病。
43.改善个体的IgE-相关疾病的症状的方法，其包括将有效量的根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸施与患有IgE-相关疾病的个体，其中有效量为足以改善所述IgE-相关疾病的症状的量。
44.权利要求43的方法，其中所述IgE-相关疾病为变态反应。
45.权利要求43的方法，其中所述IgE-相关疾病为变态反应相关疾病。
46.权利要求43的方法，其中所述IgE-相关疾病为哮喘。
47.一种试剂盒，其包含根据权利要求1或权利要求5的免疫调节性多核苷酸。
48.权利要求47的试剂盒，其还包含使用免疫调节性多核苷酸对个体进行免疫调节的说明书。
全文摘要
本发明提供了免疫调节性多核苷酸和用该免疫调节性多核苷酸对个体进行免疫调节的方法。
文档编号A61P33/12GK1483079SQ01821490
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月27日 优先权日2000年12月27日
发明者K·L·费伦, D·迪纳, K L 费伦 申请人:戴纳瓦克斯技术公司