专利名称：姜黄提取物注射剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及姜黄提取物的新注射剂型，更具体地说涉及这些制剂的脂质体剂型，纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型。本发明还涉及这些剂型的制备方法和用途。
背景技术：
近年来，在抗癌天然药物研究领域中的许多研究人员都致力于研究紫杉醇、榄香烯各种异构体、姜黄提取物、温郁金提取物等的抗癌活性和这些药物的各种制剂形式。
榄香烯是存在于某些植物中的一种倍半萜类化合物，拉丁名为Elemenum，英文名为Elemene，化学名是1-甲基-1-乙烯基-2，4-二异丙烯基环己烷，分子式C15H24。榄香烯有多种异构体，这些异构体中β-榄香烯，δ-榄香烯，γ-榄香烯已被证实有抗癌活性。榄香烯是可以从植物温郁金(Curcuma Wenyujin Y.H.Chen et C.ling)的根茎(俗称温莪术)的挥发油中提取的化合物，或是从植物香茅(Cymbopoqon citratus(DC.)Stapt)的油中提取的化合物，例如从香茅油中除掉柠檬醛、香茅醇之后余下的混合油状物，提取的化合物实际上是包含β-榄香烯的榄香烯异构体混合物。
上述植物温郁金与另外两种可作为天然药物使用的植物莪术和姜黄同属于姜科植物类群，产于中国的广东、四川、福建、广西、浙江等省。包含榄香烯的植物有温郁金、香茅、水菖蒲、土木香、人参等50多种，其中香茅是在中国分布广、资源充足的植物。目前，榄香烯类化合物主要从温郁金油和香茅油中提取。
有许多文献涉及直接采用天然药物制备防治癌症的草药制剂，例如中国专利公开CN1216256A公开了治疗肝癌的草药制剂，它包括含有白花蛇舌草、姜黄，虎杖和山豆根的提取物作为主要天然药物的可注射组合物(A)和含有白花蛇舌草、重楼、虎杖、山豆根、龙胆草、大黄、连翘、赤芍、姜黄和石菖蒲的提取物作为主要天然药物的口服组合物(B)。
在中国专利公开CN1302559中公开了姜黄素制剂，它是通过制备在水可混合的有机溶剂中或水和水可混合的有机溶剂的混合物中的姜黄素分子分散体，然后向该溶液添加保护胶体水溶液，姜黄素的疏水相形成毫微分散相。最终的制剂形式主要是水性分散体或干粉，在优选的情况下粒径小于10μm。
在CN1200266A中公开了通过二次分馏从香茅油中提取β-榄香烯的方法。
在中国专利公开CN1247756A中公开了用于治疗恶性肿瘤的姜郁注射液，其中姜黄与郁金的重量比为50-60∶50-40，该注射液是一种简单的混合物。
中国专利公开CN1076613A涉及榄香烯乳注射液及其制备方法，该注射液是一种乳状液，平均粒径一般不超过15微米，特别不超过2微米。
中国专利公开CN1244389A涉及榄香烯注射液及其制备方法，该注射液是一种简单混合物，不是脂质体。
中国专利公开CN1110134A涉及脂质体制备工艺及制剂，其中特别描述了榄香烯脂质体注射液制备方法和由该方法获得的榄香烯脂质体注射液，榄香烯的包封率达85％以上，但没有给出有关脂质体的平均粒径的数据。从制备方法可以判断该脂质体具有较大的平均粒径。
中国专利公开CN1221607A涉及利用CO2的临界或超临界方法来制备脂溶性药物脂质体的工艺和所制备的榄香烯脂质体注射液，虽然榄香烯的脂质体的包封率很高，但脂质体的平均粒径同样太大。
以上这些文献所公开的制剂在贮存稳定性和抗癌活性上都存在着不足。
另外，在一些专利文献中还公开了榄香烯的各种衍生物和榄香烯金属络合物。例如，在CN11531158A中公开了一种榄香烯金属络合物和它作为抗癌药物的使用。CN1153167A涉及榄香烯含氮衍生物及其作为抗癌药物的用途。CN1153168A涉及榄香烯羟基类衍生物及其作为抗癌药物的用途。
发明内容
本发明的目的是提供姜黄提取物注射剂，它含有从姜黄植物中提取的具有总倍半萜烯类含量≥70wt％的提取物，表面活性剂，和含水介质，该注射剂是一种水性分散体，分散相的平均粒径≤1微米，表面活性剂的量是总注射剂的1-5wt％，在注射剂中总倍半萜烯类(活性成分)的浓度是1-10mg/ml。更优选地，该含水介质是水。
本发明的另一目的是提供姜黄提取物的新注射剂型，更具体地说涉及该提取物的脂质体剂型，纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型或脂肪乳剂型。
本发明的另一个目的是提供这些注射剂型的制备方法。
本发明的再一个目的是提供这些新剂型的制剂用于制备治疗癌症或缺血性中风的药物注射剂的用途，这些注射剂型用于缓解肿瘤疼痛的用途，以及这些新剂型的制剂用于抑制和/或治疗肿瘤的用途。
本发明提供这些药物的新剂型。以姜黄提取物作为原料分别制备成其纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型。这些剂型的平均粒径一般小于或等于1微米，甚至小于或等于100纳米。
图1是实施例1的1A制剂的透射电镜照片。
本发明的详细说明现有技术领域中已经知道榄香烯某些异构体、姜黄提取物、温郁金提取物具备抑制肿瘤的作用，一些文献公开了这些天然药物的各种制剂形式(或剂型)，例如脂质体、乳剂、脂肪乳等制剂。但是，由于这些剂型的平均粒径普遍较大，注射到人或动物体内后会引起人或动物体内的各种反应，例如刺激性大，有时候发生溶血现象。
本发明人经过多年的研究工作，发现将倍半萜烯类化合物或从植物中提取的含倍半萜烯类的提取物制成平均粒径≤1微米或≤100纳米的各种注射剂型，其中包括脂质体剂型，纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米微球剂型，脂肪乳剂型等，可以克服现有技术的注射制剂中的诸多问题，尤其本发明的这些剂型在静脉注射应用中大大减少了刺激性，它们的稳定性得到进一步提高。本发明的新剂型显著提高了药物制剂的药效，但这些剂型的抑制癌细胞的机理目前还不是十分清楚。本发明人根据大量的试验结果作出以下推测由于本发明制剂具有小的平均粒径并且具有特殊的表面性质(例如亲水/亲脂平衡，表面电荷等)，使得这些制剂中的药物(或活性成分)对癌细胞有较强的亲和力，能够充分附着于癌细胞上，让活性成分直接作用于癌细胞，达到抑制或杀灭癌细胞的效果。另外，发现，纳米粒度的制剂起效快，防止癌细胞转移方面有一定效果。
同时，尽管本发明制剂具有小的平均粒径，但是所获得的各种剂型的制剂同时具有高的稳定性，它们在长时间的贮存中不会发生凝聚问题，使得可以较长时间进行贮存而不降低稳定性。
本发明提供提取物注射剂，它含有从植物中提取的具有总倍半萜烯类含量≥70wt％的提取物，表面活性剂，和含水介质，该注射剂是一种水性分散体，分散相的平均粒径≤1微米，提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，在注射剂中总倍半萜烯类(活性成分)的浓度是1-10mg/ml。
本发明提供提取物注射剂的制备方法，它包括用总倍半萜烯类含量≥70wt％的从植物中提取的提取物作为原料，添加表面活性剂，利用旋转蒸发仪成膜或CO2临界或超临界方法来混合均匀，添加注射用水，进行高压均质化处理和/或超声波处理，一直处理到获得分散相平均粒径≤1微米的稳定水性分散体为止，从而制得注射剂，其中提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中总倍半萜烯异构体的最终浓度为1～10mg/ml。
能够在本发明中用来制成新剂型的从植物中提取的倍半萜烯类(在这里有时候称作活性成分)基本上包括全部倍半萜烯类化合物(C15H24)，倍半萜烯类化合物的混合物或从植物中提取的倍半萜烯类提取物，对于这些提取产物要求倍半萜烯类化合物的纯度在70％以上，优选在75％以上，更优选在85％以上，特别优选在90％以上，甚至特别优选在95％以上。
需要指出的是，在本发明中用于制备各种剂型的制剂的各种原料可以使用商购的产品如榄香烯产品(提取物)、β-榄香烯产品(提取物)、姜黄提取物或温郁金提取物，以及树兰花、香椿子、海风藤、丁香、没药、黄花杜鹃、葛缕子、百里香、欧芹、广藿香、茅苍术、蛇床子、啤酒花、檀香木、香柠檬、防风根、柏木、松节油以及香茅、人参等的提取物产品。如果在本申请中需要自己制备这些提取物，用于制备这些提取物的各种挥发油可以使用商购产品，也可以使用通过普通的水蒸汽蒸馏法或分子蒸馏法从植物中获得的挥发油。
倍半萜烯类包括榄香烯(elemene)，姜黄烯(curcumene)，姜烯(zingiberene)，波旁烯(bourbonene)，蛇麻烯(humulene)，金合欢花烯(farnesene)，杜松烯(cadinene)，芹子烯(selinene)，马阿里烯(maaliene)，檀香烯(santalene)，广藿香烯(patchonlene)，石竹烯(也称作丁香烯，caryophyllene)，吉马烯(大香叶烯，germacrene)，毕澄茄油烯(cubebene)，柏木烯(cedrene)，长叶烯(longifolene)，防风根烯(或红没药烯，bisabolene)，香柠檬烯(bergamotene)，古芸烯(gurjunene)，愈疮木烯(guaiene)，衣兰烯(ylangene)，异石竹烯(isocaryophyllene)，长蒎烯(longipinene)，白菖烯(calarene)，木罗烯(muurolene)，菖蒲二烯(acoradiene)，倍半水芹烯(β-sesquiphellandrene)等。
原则上，从植物中提取的含有60wt％以上倍半萜烯类的所有提取物都可用于制备本发明的新剂型，倍半萜烯类是所有剂型的活性成分。含有70wt％以上倍半萜烯类的提取物是理想的，含有75wt％以上倍半萜烯的提取物是优选的，含有85wt％以上倍半萜烯的提取物是更优选的，含有90wt％以上或甚至含有95wt％以上倍半萜烯类的提取物是特别优选的。
从天然植物中提取的含榄香烯的提取物通常含有α-榄香烯，β-榄香烯，δ-榄香烯，γ-榄香烯，波旁烯等。在本发明中作为特定的实施方案，以温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling挥发油、香茅油Cymbopoqon citratus(DC.)Stapt次要成分(香茅油除掉柠檬醛、香茅醇之后余下的混合油状物)为原料，经填料式真空精馏装置或分子蒸馏仪精制出榄香烯。
另外，每一种榄香烯异构体如α-榄香烯，β-榄香烯，δ-榄香烯或γ-榄香烯只要纯度在85wt％以上也能够用于制成本发明的新剂型。
目前根据国内榄香烯质量标准(参见2000年的国家药品监督管理局颁发的国家药品标准WS1-(X-094)-2000Z)，若分离出的产物(提取物)用气相色谱法(聚乙二醇20M为固定相，白色硅藻土担体60～80目，柱温为135～140℃，理论板数按β-榄香烯计算应不低于1000)检测总榄香烯异构体纯度达到≥85％则该产物称作榄香烯，若检测出β-榄香烯纯度达到≥95％则产物为β-榄香烯，实际上这是不准确的，因为使用灵敏度更高的色谱仪器例如30米长毛细管气相色谱-质谱联用仪(色谱仪Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5)来检测该≥95％纯度的β-榄香烯样品，会发现它仍然含有至少6％的波旁烯(在低灵敏度色谱仪的色谱图，β-榄香烯的峰与波旁烯的峰重叠成一个峰)，榄香烯样品是多种倍半萜烯的混合物，即含有β-榄香烯，δ-榄香烯，γ-榄香烯，波旁烯，丁香烯、吉马烯等。
姜黄Rhizoma Curcuma Longa L.提取物是从姜黄植物获取的挥发油中提取的产物。在本发明中作为特定的实施方案，姜黄提取物指姜黄挥发油经填料式真空精馏装置或分子蒸馏仪精制出的提取物，经GC-MS检测，姜黄提取物通常含有≥70wt％，优选≥75wt％，更优选≥80wt％，特别优选≥85wt％，甚至更优选≥90wt％的倍半萜烯类如姜黄烯、姜烯等和少量(相当于全部倍半萜烯类总重量的约1/25～1/5)的姜黄素。
温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling提取物包括从温郁金植物中获取的挥发油中提取的产物。在本发明中作为特定的实施方案，温郁金提取物指温郁金挥发油经真空填料式精馏装置精馏出的组分或经分子蒸馏仪精制出的产物，经GC-MS检测，姜黄提取物通常含有≥70wt％，优选≥75wt％，更优选≥80wt％，特别优选≥85wt％，甚至更优选≥90wt％的倍半萜烯类如各种榄香烯异构体、吉马烯、丁香烯等和较少量(相当于全部倍半萜烯类总重量的约1/50～1/10)的姜黄素。
术语的解释在本发明中所述的粒径或粒度是指分散相的粒径或粒度。
在本申请中，姜黄提取物指姜黄挥发油经真空填料式精馏装置精馏出的组分或经分子蒸馏仪精制出的组分，经GC-MS检测，姜黄提取物含有主要量的倍半萜烯类和少量的姜黄素。
如果在剂型前加“纳米”修饰，则指该剂型的平均粒径≤150纳米，在理想的情况下平均粒径≤100纳米。注射剂和注射制剂可互换使用。
脂质体剂型，在本发明中是指分散或悬浮在含水介质中的由磷脂和胆固醇等组成的脂双层结构，该脂双层结构类似于细胞膜结构。
纳米脂质体剂型，在本发明中是指平均粒径低于或等于150纳米的脂质体。
前体脂质体剂型，在本发明中是指在脂质体的配方基础上再添加赋形剂，通过真空冷冻干燥(真空冻干)方法所制备的冻干粉。该冻干粉在临床应用之前通过添加注射用水，经过振摇或振荡，使之恢复成脂质体形态。
长循环脂质体剂型，简单地说，在本发明中是指在脂质体的配方基础上再增加聚乙二醇磷脂酰乙醇胺所制备的脂质体。它注射到体内后比普通的脂质体在体内发挥效用的时间更长，或在体内消除缓慢。
纳米微乳剂型，指平均粒径≤150纳米，在理想情况下≤100纳米的乳剂。
静脉乳剂型，在本发明中指平均粒径≤1微米的注射乳。
脂质纳米微球剂型，在本发明中是指平均粒径≤150纳米的脂肪乳。
脂肪乳剂型，在本发明中要求它的平均粒径≤1微米；另外在中国国家药典中也规定平均粒径≤1微米。
nm是指纳米，μ是指微米。在本申请中纯度是指按重量计的百分纯度，除非另有说明。
在本申请中所使用的原料是姜黄提取物，它的总倍半萜烯类含量≥70wt％，理想的是75wt％，优选≥80wt％，更优选≥85wt％，特别优选≥90wt％，更特别优选≥95wt％。该提取物含有≤28wt％的姜黄素，理想地含有≤15wt％的姜黄素，优选含有≤10wt％的姜黄素，更优选含有≤5wt％的姜黄素。
使用这里所述的30米长毛细管气相色谱-质谱联用仪检测提取物，含有≥70wt％倍半萜烯类的提取物就可用于本发明中。本申请中所使用的姜黄提取物可以通过商业途径以提取物(各种异构体混合物)或纯异构体(要求纯度高于85wt％)产物形式购买获得，也可以根据需要自己制备，对于姜黄提取物的制备方法参见制备例。
本申请中所使用的姜黄提取物原料、试剂没有特别的限制，只要该提取物是从天然植物姜黄中提取并且总倍半萜烯类纯度≥70wt％就可在本发明中使用，更理想的是，该纯度≥75wt％，更理想≥80wt％，优选≥85wt％，特别优选≥90wt％。
除非另有说明，否则在本发明中使用的其它成分如胆固醇、大豆磷脂、卵磷脂、甘油、亚油酸、聚乙二醇磷脂酰乙醇胺、脂族胺、大豆油等一般要求符合国家药用标准，溶剂也应该符合国家药用标准，这些主要出于健康方面的考虑；类似地，对于一些原料用“精制”修饰，表明该原料必须符合国家药用标准，例如精制大豆磷脂是注射剂可用的产品，精制大豆油是注射剂可用的产品。
除非另有说明，否则在本申请中色谱分析所使用的气相色谱仪是Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱是BP-5。
本发明的各种剂型能够以静脉注射、局部给药方式用于治疗目的。
本发明的优选实施方案在下列的实施方案中作为原料主要使用提取物“榄香烯”、提取物“β-榄香烯”、姜黄提取物、温郁金提取物，还可以使用树兰花、香椿子、海风藤、丁香、没药、黄花杜鹃、葛缕子、百里香、欧芹、广藿香、茅苍术、蛇床子、啤酒花、檀香木、香柠檬、防风根、柏木、松节油以及香茅、人参等的提取物。显然，其中某一种倍半萜烯异构体的纯度较高(例如≥85wt％)的产品都能够作为原料，而且利用化学方法合成的各种倍半萜烯类及其衍生物都能够用于本发明中。
本发明提供了脂质体或纳米脂质体的制备方法，它包括将提取物与大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5进行混合；添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以使混合物充分溶解，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)，然后置入常规的超声波细胞粉碎机中进行超声波处理；取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪、电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径例如≤1微米(脂质体)，或≤100纳米(纳米脂质体)后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，利用色谱仪(气相或液相)测得活性成分的最终浓度(倍半萜烯类活性成分的重量(mg)/总制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。
纳米脂质体的包封率检测用分子筛法检测，即，利用SephadexG25层析系统，将提取物纳米脂质体制剂分成两个流份，即提取物纳米脂质体流份和游离的提取物流份，经气相色谱仪检测两个流份中含有的提取物含量。包封率计算公式＝提取物纳米脂质体流份的提取物含量÷(提取物纳米脂质体流份的提取物含量+游离的提取物含量)。显微镜或透射电镜验证是否为脂质体。
本发明提供前体脂质体的制备方法将提取物与精制大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)，然后置入超声波细胞粉碎机进行超声处理，取样利用带标尺的显微镜或Coulter仪来检验平均粒径，当平均粒径≤1微米后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，加入占总制剂量的1-2wt％的赋形剂(例如乳糖或平均分子量Mw为约4000-40000的低分子右旋糖苷)，100℃蒸汽流灭菌，无菌条件下冷冻干燥、灌封。在使用之前添加注射水以达到最终活性成分浓度(倍半萜烯类活性成分的重量(mg)/制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为2～8mg/ml，更优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。
包封率的检测用分子筛法检测方法，即根据所要配制的最终制剂浓度(mg/ml)，将一定量的提取物前体脂质体制剂先添加余量体积的水振摇均匀，此时又变成了脂质体，利用Sephadex G25层析系统分成两个流份，即提取物脂质体流份和游离的提取物流份，经气相色谱仪检测两个流份中含有的提取物量。包封率计算公式＝提取物脂质体流份的提取物含量÷(提取物脂质体流份的提取物含量+游离的提取物量)。显微镜或透射电镜证实是否为前体脂质体。
本发明提供长循环提取物纳米脂质体的制备方法，该方法包括将提取物与精制大豆磷脂、聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺、胆固醇以重量比0.5-1.5∶1.5-3.5∶0.3-1.2∶0.8-2.0，优选以重量比0.8-1.2∶1.8-3.0∶0.4-1.0∶1.2-1.8，更优选以重量比0.9-1.1∶2.4-2.8∶0.6-1.0∶1.2-1.6，特别优选以重量比1∶2.6-2.7∶0.7-0.9∶1.3-1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)，然后置入常规的超声波细胞粉碎机进行超声波处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径(例如≤100纳米)后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，(气相或液相)色谱法测得活性成分的最终浓度(倍半萜烯类活性成分的重量(mg)/总制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为2～7.5mg/ml，更优选为2～8mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。对于聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺，其中“2000”指聚乙二醇链段的平均分子量(道尔顿)。
该注射剂的包封率的检测与前面的脂质体注射剂的包封率检测方法相同。
本发明提供带负电荷及带正电荷的提取物纳米微乳的制备方法制备方法1带负电荷的纳米微乳的制备将提取物与精制大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)，然后置入常规的超声波细胞粉碎机进行超声波处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径(例如≤100纳米)后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，活性成分的最终浓度(倍半萜烯类活性成分的重量(mg)/总制剂体积(ml))为1～10mg/ml，优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。显微镜、透射电镜检测，证实是否是纳米微乳。
制备方法2带正电荷的纳米微乳的制备将提取物、精制卵磷脂、C14-C22直链或支链脂族胺、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-3.5∶0.2-0.6∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.5-3.0∶0.3-0.5∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶2.7-2.9∶0.3-0.5∶1.4-1.6，特别优选1∶2.8∶0.4∶1.5进行混合，添加溶剂(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除溶剂成膜，然后添加余量的注射用水(根据所要配制的浓度计算出该余量)，然后置入常规的超声波细胞粉碎机进行超声处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径(例如≤100纳米)后，调节PH，使PH值为7.5～9.0，经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，倍半萜烯类活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。显微镜、透射电镜检测，证实是否为纳米微乳。
本发明还提供提取物脂质纳米球的制备方法，该方法包括取提取物与大豆磷脂一起加入大豆油中，升温控制成油相(保持为油相)，将该油相加入到含甘油的水溶液中。其具体重量比例为提取物占最终配制剂总量的0.08～0.8wt％，大豆磷脂0.8～2.5wt％，大豆油8-12wt％，甘油1.8-2.8wt％，注射用水加至5000ml；优选的重量比例为提取物占最终配制剂总量的0.1wt％～0.5wt％，大豆磷脂1.2wt％～2.0wt％，大豆油10wt％，甘油2.25～2.5wt％，注射用水加至5000ml。然后高速搅拌，调节PH为4.5～6.5，再经过普通的高压均质机(例如M110-E/H型(日本MIZUHO产))处理，然后进行前面所述的超声波处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，在其脂质球的平均粒径达到规定值例如≤100nm之后，再经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。(气相或液相)色谱法测得倍半萜烯类活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为2～7.5mg/ml，更通常为2～5mg/ml，更理想为2.0～3.0mg/ml。根据需要可以在该最终制剂中加入适量胆固醇、亚油酸等。
本发明提供提取物静脉注射乳的制备方法，该方法包括将提取物、精制大豆磷脂、胆固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，优选0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更优选0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特别优选1∶3.2∶1.5，与余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度来计算该余量)进行混合，用常规的高压均质机(例如M110-E/H型(日本MIZUHO产))乳化，取样利用带标尺的显微镜或Coulter仪来检验平均粒径，在达到规定的平均粒径例如≤1微米后，调节PH，使PH值为4.5～6.5，经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，经100℃～120℃灭菌，得到提取物静脉乳，(气相或液相)色谱法测得倍半萜烯类活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为2～7.5mg/ml，更通常为5～7.5mg/ml。
本发明提供提取物脂肪乳的制备方法，该方法包括取提取物与大豆磷脂加入大豆油中，升温控制成油相(保持为油相)，将该油相加入到含甘油的水溶液中。其具体重量比为提取物占最终配制剂总量的0.08～0.8wt％，大豆磷脂0.8～2.5wt％，大豆油8-12wt％，甘油1.8-2.8wt％，注射用水加至5000ml；优选的重量比例为提取物占最终配制剂总量的0.1wt％～0.5wt％，大豆磷脂1.2wt％～2.0wt％，大豆油10wt％，甘油2.25～2.5wt％，注射用水加至5000ml。然后高速搅拌，调节PH为4.5～6.5，再经过普通的高压均质机(例如M110-E/H型(日本MIZUHO产))处理，使其粒径小于1μ，再经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。倍半萜烯类活性成分的最终浓度为1～10mg/ml，优选为2～7.5mg/ml，更理想为2.0～3.0mg/ml或为5～7.5mg/ml。根据需要可以在该最终制剂中加入适量胆固醇、亚油酸等。
根据需要，本发明的制剂可以用不同尺寸例如1.2μ、1.0μ、0.9μ、0.8μ、0.7μ、0.6μ、0.5μ等的微孔滤膜进行过滤，可以截取平均粒径≤0.8μ、≤0.7μ、≤0.6μ、≤0.5μ、≤0.45μ、≤0.4μ、≤0.3μ等的分散相。
下面的制备例和实施例用于举例说明本发明，但不应认为限制本发明的范围。本发明的保护范围由权利要求来定义。
制备例姜黄提取物的制备制备方法A姜黄挥发油的分子蒸馏以姜黄挥发油为原料，经广州汉维机电公司MD-S80型分子蒸馏仪精制，其工艺条件蒸馏温度35～45℃，蒸馏压力70～90Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，物料流速15～30毫升/小时，得到馏出物，仅收集馏余物，积累到足够量，继续进行分子蒸馏。蒸馏温度45～60℃，蒸馏压力30～70Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，分别收集馏出物与馏余物，将得到的二次馏余物积累到足够量，继续进行分子蒸馏。蒸馏温度30～70℃，蒸馏压力10～50Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，收集馏出物，放掉馏余物，将溜出物再添加到分子蒸馏仪中继续重复蒸馏一直到用气相色谱仪(利用30米长毛细管气相色谱-质谱联用仪气相色谱仪检测，色谱仪Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5)检测时总倍半萜烯含量≥75wt％为止。该提取物经上述气相色谱仪检测，还含有相当于全部倍半萜烯类总重量的约1/20的姜黄素。用气相色谱法制定供检测用指纹图谱。该产物称作姜黄提取物A。
制备方法B填料式真空精馏将姜黄挥发油经填料式真空精馏装置精馏，填料式真空精馏装置由装姜黄挥发油的釜、填料精馏塔、回流器、真空泵构成，由上海化工研究院新型填料技术开发中心设计，填料为狄克松填料(Q网环填料)，真空度为1-3mmHg，收集82℃/3mmHg以上的馏分，经气相色谱仪(利用30米长毛细管气相色谱-质谱联用仪气相色谱仪检测，色谱仪Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5)分析为倍半萜烯化合物。总倍半萜烯含量≥75wt％，还含有相当于全部倍半萜烯类总重量的约1/20的姜黄素。用气相色谱法制定供检测用指纹图谱。该产物称作姜黄提取物B。
另外，将姜黄经CO2超临界提取得到的挥发油留下的渣，添加甲醇，加热抽提3小时得到黄色粘稠液，将甲醇蒸馏掉，得到棕黄色膏状物，将这些膏状物用硅胶制备色谱纯化，用氯仿洗脱得到纯度≥90wt％的姜黄素产物。将上述产物A和产物B以50∶50重量比混合，将所形成的混合物与该姜黄素产物按20∶1(重量)的比例进行混合而获得另一种混合物，称作提取物C。
实施例1姜黄提取物的纳米脂质体注射剂的制备程序1A将制备例的产品A与精制大豆磷脂、胆固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合，添加乙醚，添加量足以充分溶解该混合物，置入旋转蒸发仪上脱除乙醚成膜，添加余量的注射用水(根据所要配制的最终浓度即5mg/ml来计算该余量)，然后置入山东济宁超声电子仪器厂出产的超声波细胞粉碎机(型号JCS-204)超声处理，取样利用带标尺的显微镜、Coulter仪或电子显微镜来检验平均粒径，当平均粒径≤100纳米后，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜(上海新亚净化器件厂生产，规格0.8μ)过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，所获得的注射剂产品简称1A。取样用气相色谱法(利用30米长毛细管气相色谱-质谱联用仪气相色谱仪)测得活性成分(总倍半萜烯类活性成分的重量(mg)/制剂体积(ml))的最终浓度为5±0.10mg/ml。
用分子筛法检测包封率，即，利用Sephadex G25层析系统将提取物纳米脂质体制剂分成两个流份，即提取物纳米脂质体流份和游离的提取物流份，经气相色谱仪检测两个流份中含有的提取物含量。包封率超过85％。包封率计算公式＝提取物纳米脂质体流份的提取物含量÷[提取物纳米脂质体流份的提取物含量+游离的提取物量]。显微镜、透射电镜检测，证实是纳米脂质体，在附图1中给出该注射剂的透射电镜照片(标尺50nm)。
程序1B重复上述1A程序，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A。显微镜、透射电镜检测，证实制剂是纳米脂质体。制剂中总倍半萜烯类的浓度为约5±0.10mg/ml。包封率高于85％。该注射剂简称1B。
实施例2姜黄提取物的前体脂质体的制备2A按照与实施例1的1A程序中相同的方法和原料配比，重复进行实施例1的1A程序，只是超声波处理后要求分散相的粒径≤1微米以及在过滤之后和在装瓶之前，加入占总制剂重量的1-2％的乳糖，然后利用100℃蒸汽流灭菌，无菌条件下冷冻干燥、灌封(分装)。用Coulter仪检测证实制剂是前体脂质体。该注射剂产品简称2A。包封率高于85％。该制剂在注射应用之前添加注射水以达到最终活性成分(总倍半萜烯类)浓度为5±0.10mg/ml。
2B重复上述2A，只是用制备例的B产物代替制备例的产物A，用平均分子量Mw为约40000的低分子右旋糖苷代替乳糖。该注射剂简称2B。用Coulter仪检测证实制剂是前体脂质体。包封率高于85％。该制剂在注射应用之前添加注射水以达到最终活性成分浓度(总倍半萜烯类的重量(mg)/制剂体积(ml))为5±0.10mg/ml。
实施例3姜黄提取物的长循环纳米脂质体的制备3A按照与实施例1的1A程序中相同的方法，重复进行实施例1的1A程序，只是原料和它们的重量配比是姜黄提取物A∶大豆磷脂∶聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺∶胆固醇＝1∶2.6∶0.8∶1.4。该注射剂简称3A。取样检验平均粒径≤100nm。制剂中总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。包封率高于85％。
3B重复上述3A，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A。所获得的注射剂简称3B。平均粒径≤100nm。制剂中总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。包封率高于85％。
实施例4带负电荷及带正电荷的姜黄提取物的纳米微乳的制备4A-1带负电荷的纳米微乳的制备重复实施例1的1A程序，只是不测定包封率。取样测得总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。用Coulter仪证实是纳米微乳。该注射剂产品简称4A-1。
4A-2带正电荷的纳米微乳的制备重复实施例1的1A程序，只是原料和它们的重量配比是提取物A∶卵磷脂∶正十八烷基胺∶胆固醇＝1∶2.8∶0.4∶1.5，不测定包封率。取样测得总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。用Coulter仪证实是纳米微乳。该注射剂简称4A-2。
4B-1带负电荷的纳米微乳的制备重复上述4A-1，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A。取样测得总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。用Coulter仪证实是纳米微乳。所获得的注射剂简称4B-1。
4B-2带正电荷的纳米微乳的制备重复上述4A-2，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A。取样测得总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。用Coulter仪证实是纳米微乳。所获得的注射剂简称4B-2。
实施例5姜黄提取物的脂质纳米球制剂的制备5A取制备例的提取物A与大豆磷脂一起加入大豆油中，升温控制成油相(即保持为油相)，将该油相加入到含甘油的水溶液中。其具体重量比为提取物占总制剂重量的0.2％，大豆磷脂1.6％，大豆油10％，甘油2.5％，余量为注射用水，然后高速搅拌，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH为4.5～6.5，再经M110-E/H型(日本MIZUHO产)高压均质机处理，然后按照实施例3中相同方法进行超声波处理，使其脂质球的平均粒径≤100nm，再经0.8μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。取样测得总倍半萜烯类的最终浓度为2±0.04mg/ml。所获得的注射剂简称5A。根据需要可以在原料中包括适量的胆固醇、亚油酸等。
5B重复上述5A程序，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A。脂质球的平均粒径≤100nm。色谱法测得总倍半萜烯类的最终浓度为2±0.04mg/ml。所获得的注射剂简称5B。
实施例6姜黄提取物的静脉注射乳的制备6A将制备例的姜黄提取物A、精制大豆磷脂、胆固醇以重量比1∶3.2∶1.5与余量的注射用水(根据所需最终的浓度即5mg/ml来计算该余量)混合，用M110-E/H型(日本MIZUHO产)高压均质机乳化，一直用Coulter仪检验粒径小于1μ为止。然后，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH，使PH值为4.5～6.5，经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，经100℃～120℃灭菌，得到姜黄提取物静脉乳，取样测得总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。该注射剂简称6A。
6B重复以上6A，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A。用Coulter仪检验粒径小于1微米。制剂中总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。所获得的注射剂简称6B。
实施例7姜黄提取物脂肪乳的制备7A取制备例的产物A与大豆磷脂加入大豆油中，升温控制成油相，将该油相加入到含甘油的水溶液中。其具体重量比为提取物A占总制剂重量的0.2％，大豆磷脂1.2％，大豆油l0％，甘油2.5％，余量为注射用水。然后高速搅拌，用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH为4.5～6.5，再经M110-E/H型(日本MIZUHO产)高压均质机处理，一直到用Coulter仪检验粒径≤1μ为止，再经1.2μ微孔滤膜过滤和然后装瓶，100℃～120℃灭菌。测得总倍半萜烯类的最终浓度为2±0.04mg/ml。所获得的注射剂简称7A。根据需要可以在原料中包括适量胆固醇、亚油酸等。
7B重复上述7A，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A。测得在制剂中总倍半萜烯类的最终浓度为2±0.04mg/ml。所获得的注射剂简称7B。
实施例8CO2超临界法制备脂质体8A将占胆固醇重量的10wt％的三氯甲烷加入胆固醇中使之浸润，将大豆磷脂和制备例的提取物A加入其中进行混合(提取物A∶大豆磷脂∶胆固醇＝重量比1.2∶3.2∶1.5)，将所获得的混合物放入CO2超临界提取仪(广州汉维机电公司生产，型号SFE100ml)的萃取器中，通入CO2(压力50-80kg)，体系温度50℃，进行临界或超临界分散，使混合物均匀混合，然后缓慢减压释放CO2，让CO2将三氯甲烷带出，取出萃取器，在萃取器中加入余量的注射用水(根据注射剂的最终浓度计算该余量)，用搅拌器搅拌，将所形成的分散体用超声波处理，一直到脂质体的分散相粒径≤1微米为止(称作脂质体)，或根据需要，超声波处理一直到分散相平均粒径≤100纳米为止(称为纳米脂质体)。然后将脂质体用1M磷酸二氢钠水溶液调节PH，使PH值为4.5～6.5，经0.8μ微孔滤膜(上海新亚净化器件厂生产，规格0.8μ)过滤和然后装瓶，100℃蒸汽流灭菌，所获得的注射剂产品简称8A。取样用气相色谱法测得总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。包封率高于88％。
8B重复上述8A，只是用制备例的产物B代替制备例的产物A，制得脂质体。测得在制剂中总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。所获得的注射剂简称8B。包封率高于88％。
8C重复上述8A，只是用制备例的提取物C代替制备例的产物A，制得脂质体。测得在制剂中总倍半萜烯类的最终浓度为5±0.10mg/ml。所获得的注射剂简称8C。包封率高于88％。
药效学试验药物制剂的体内抗肿瘤效果的评价方法已在以上列举的某些专利文献中有描述(例如参见CN1153168A)。
在本发明中，各种剂型的制剂对皮下接种的人体肿瘤异种移植模型QGY肝癌、MKN-45胃癌的疗效，可以通过以80mg(倍半萜烯类)/kg(体重)、40mg/kg和20mg/kg的剂量，每天尾静脉给药1次，连续给药10天的治疗方案来确认，其中没有给药的作为对照组。具体的操作过程和肿瘤抑制率(抑瘤率)的计算按照目前(指本申请的申请日以前)的国家药品监督管理局的相关规定“抗肿瘤药物的药效评价办法”来实施。
抑瘤率％＝[(没有给药的模型的肿瘤重量-给药的模型的肿瘤重量)/没有给药的模型的肿瘤重量]×100％表1.人体肿瘤异种移植模型QGY肝癌的抑瘤率
表2.人体肿瘤异种移植模型MKN-45胃癌的抑瘤率
表3对颅内原位接种小鼠脑瘤G422模型的疗效(抑瘤率)。
表4对皮下接种小鼠脑瘤G422模型的疗效(抑瘤率)。
另外，各种剂型的注射剂对荷Lewis肺癌的小鼠NK细胞与对照组比活性提高21％～23％。
各种剂型的注射剂对荷Lewis肺癌的小鼠淋巴细胞增殖活性影响、刺激指标提高了1.5～1.45。
总之，从上述表中数据可以看出，各种制剂经QGY肝癌、MKN-45胃癌、小鼠脑瘤G422模型药理学试验有效。对免疫功能影响试验，荷Lewis肺癌的小鼠NK细胞与对照组比提高21％～23％。淋巴细胞增值活性影响、刺激指标提高了1.5～1.45.
所以，注射剂能够用于抑制和/或治疗肿瘤。另外，经过试验，该制剂还能够用于抑制癌细胞转移，用于缓解肿瘤疼痛，用于预防或治疗缺血性中风。
权利要求
1.一种姜黄提取物注射剂，其特征在于该种姜黄提取物注射剂含有从姜黄植物中提取的具有总倍半萜烯类含量≥70wt％的提取物，表面活性剂，和含水介质，其特征在于该注射剂是一种水性分散体，分散相的平均粒径≤1微米，提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中总倍半萜烯类的最终浓度为1～10mg/ml。
2.根据权利要求1的姜黄提取物注射剂，其特征在于其中注射剂的剂型包括脂质体剂型，纳米脂质体剂型，长循环脂质体剂型或长循环纳米脂质体剂型，其中这些注射剂的总倍半萜烯类的浓度是2-7.5mg/ml，这些制剂的包封率≥80％。
3.根据权利要求1的姜黄提取物注射剂，其特征在于其中注射剂时剂型包括纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型或脂肪乳剂型；其中注射剂的总倍半萜烯类的浓度是2-7.5mg/ml。
4.根据权利要求2的姜黄提取物注射剂，其特征在于进一步包括前体脂质体剂型，它是通过先制备脂质体，添加赋形剂，然后冻干而制得，包封率≥80％，该前体脂质体制剂在注射之前添加注射水以达到最终活性成分浓度(总倍半萜烯类的重量(mg)/制剂体积(ml))为2～8mg/ml。
5.根据权利要求2或3的注射剂，其特征在于其中纳米脂质体剂型、长循环纳米脂质体剂型、纳米微乳剂型或脂质纳米球剂型的注射剂的分散相平均粒径≤100纳米，当剂型为前体脂质体、脂质体或长循环纳米脂质体时包封率≥85％；和其中表面活性剂是磷脂和/或胆固醇。
6.根据权利要求3或5的注射剂，其特征在于脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型的注射剂的总倍半萜烯类的浓度为2.0-3.0mg/ml。
7.根据权利要求1-6中任何一项的注射剂，其特征在于它是静脉注射剂。
8.根据权利要求1或4的注射剂，其特征在于其中姜黄提取物含有相当于倍半萜烯类总重量的约1/25～1/5的姜黄素。
9.根据权利要求1或3的注射制剂，其特征在于其中注射剂进一步含有选自植物油和动物油的油或作为等渗透剂的甘油。
10.根据权利要求1或3的注射制剂，其特征在于其中当表面活性剂是卵磷脂时，注射剂进一步含有C14-C22直链或支链脂族胺。
11.一种如权利要求1所述的姜黄提取物注射剂的制备方法，其特征在于它包括用总倍半萜烯类含量≥70wt％的从姜黄植物中提取的提取物作为原料，添加表面活性剂，利用旋转蒸发仪成膜或CO2临界或超临界方法来混合均匀，添加注射用水，进行高压均质化处理和/或超声波处理，一直处理到获得分散相平均粒径≤1微米的稳定水性分散体为止，从而制得注射剂，其中提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射剂中总倍半萜烯类的最终浓度为1～10mg/ml。
12.根据权利要求11的制备方法，其中注射剂的剂型包括脂质体剂型，纳米脂质体剂型，长循环脂质体剂型或长循环纳米脂质体剂型，其中这些注射剂的总倍半萜烯类的浓度是2.0-7.5mg/ml，这些制剂的包封率≥80％。
13.根据权利要求11的制备方法，其中注射剂的剂型包括纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型或脂肪乳剂型；其中这些注射剂的总倍半萜烯类的浓度是2.0-7.5mg/ml。
14.根据权利要求12的制备方法，进一步包括在制备脂质体之后，添加赋形剂，然后冻干，从而制备前体脂质体剂型的制剂。
15.根据权利要求11的制备方法，其中姜黄提取物含有相当于倍半萜烯类总重量的1/25～1/5的姜黄素。
16.根据权利要求11或13的制备方法，其中与表面活性剂一起还添加选自植物油和动物油的油或作为等渗透剂的甘油。
17.权利要求1-10中任何一项的姜黄提取物注射剂用于抑制和/或治疗肿瘤，用于抑制癌细胞转移，用于缓解肿瘤疼痛，用于预防或治疗缺血性中风的用途。
18.权利要求1-10中任何一项的姜黄提取物注射剂用于制备抑制或治疗癌症的药物的用途。
19.由权利要求11-16中任何一项的方法制备的注射剂。
全文摘要
本发明涉及姜黄提取物的新剂型，更具体地说涉及它们的纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型。
文档编号A61K31/122GK1451379SQ0211721
公开日2003年10月29日 申请日期2002年4月17日 优先权日2002年4月17日
发明者李德山, 陈泽平 申请人:大连医大安鹏生物医药技术有限公司