专利名称：一种重组胸腺素α1及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组胸腺素α1及其制备方法。
Gly-Tα1的制备方法如下以人胎盘cDNA为模板进行PCR，其产物经胶回收，EcoRI/BamHI双酶切，与pGEX-4T-1载体连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，经酶切、测序、鉴定后得到工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1。该工程菌采用分批补料培养技术进行发酵，以终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导3～5小时，终止发酵，收获菌体。按每克湿菌加入10ml的比例加入超声缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，离心，取上清用Glutathione Sepharose 4B柱进行亲和层析纯化融合蛋白。将GST-Tα1融合蛋白对酶切缓冲液透析，按每单位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反应2～16小时。将凝血酶酶切的裂解液过GlutathioneSepharose 4B柱，收集穿过峰，对50mmol/L Tris pH8.0透析后上sourceQ阴离子交换柱，用0～1mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集主峰。纯化出的Gly-Tα1纯度大于90％，表观分子量为3.1KD。
1.试剂与材料载体质粒pGEX-4T-1 由美国耶鲁大学医学遗传室潘星华博士赠送大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Ply S株 购自Stratagene公司人胎盘Marathon-RoadyTM-cDNA 购自Clontech公司限制性内切酶和T4DNA连接酶 购自上海华美公司PCR引物 由上海基康生物技术公司合成胶回收试剂盒 购自上海生工生物公司2.方法(1)寡核苷酸引物的设计与合成根据GenBank中(登录号S38640)设计出的上游引物5′-G GG G A T C CG A C G C A G C C G T A G A C-3′下游引物5′-G GG A A T T CT T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′上游引物内含BamHI酶切位点/G G A T C C，下游引物内含EcoRI酶切位点/G A A T T C。5′端去掉了ATG起始密码，3′端加上了终止密码。
(2)PCR扩增按照Takara生物公司Pre Mix PCR Kit说明书，取5微升人胎盘cDNA为模板，取上游引物和下游引物各100个pmol然后进行PCR反应，第一循环为94℃1分钟、42℃1分钟、72℃1分钟，然后进入94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共35个循环，再进入72℃延伸8分钟。
(3)重组质粒的构建将PCR扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收，然后用Eco RI和Bam HI分别双酶切回收的DNA片段和质粒载体pGEX-4T-1，再将两种酶切回收片段连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，通过酶切鉴定转化子。
将上述酶切鉴定的重组载体由上海基康生物公司测序，获得正确序列的重组质粒称为融合表达载体pGEX-4T-1/Tα1。重组胸腺素α1的核苷酸序列见表1，与其相应的氨基酸序列见表2。
上述含重组质粒pGEX-4T-1/Tα1的大肠杆菌BL21(DE3)为工程菌，将工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导表达融合蛋白。实施例2大肠杆菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1的发酵1.取少量大肠杆菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1于20ml含100μg/ml氨卞青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)37℃振荡培养过夜作为一级种子液。
2.取一级种子液，以4％接种量接种于含100μg/ml氨卞青霉素的200ml LB培养基，于三角摇瓶中37℃振荡培养6小时，作为二级种子液。
3.按发酵罐工作体积的4％接种量将二级种子液接入含半合成培养基[(每升含胰化蛋白胨5g、酵母提取物5g、甘油10g、KH2PO42g、K2HPO44g、Na2HPO4·12H2O 7g、(NH4)2SO41.2g、NH4Cl 0.2g)]和微量元素溶液(每升含MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O 0.004g、Na2MoO4·2H2O 0.002g、ZnCl20.002g、CuSO4·5H2O 0.001g、H3BO30.0005g、FeSO4·7H2O 0.02g、CaCl2·H2O 0.02g、MgSO4·7H2O 0.3g)的发酵罐中，控制温度为37℃、空气流速为10L/分钟、搅拌转速为250rpm，同时自动流加30％的氨水使pH值保持在7.0左右，培养8～12小时。
4.加入补料(每升含甘油170g、胰化蛋白胨71g、酵母提取物71g、MgSO4·7H2O 5.7g)，加快搅拌转速至400～700rpm，增大空气流速为12～15L/分钟，培养4小时左右。
5.继续补料，加入终浓度为1mmol/L的I PTG，诱导3～5小时，停止发酵，得发酵菌液。实施例3Gly-Tα1蛋白的制备与纯化1.将发酵菌液离心收集菌体，用磷酸缓冲液(PBSNaCl 140mmol/L KCl2.7mmol/L Na2HPO410mmol/L KH2PO41.8mmol/L pH7.3)离心洗涤一次，再按每克湿重菌体加入10mlPBS悬浮菌体沉淀。
2.置冰浴中超声破碎菌体，离心，取上清过Glutathione Sepharose 4B柱，弃去穿过峰，用50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L还原型谷胱甘肽(pH8.0)洗脱，收集洗脱峰，得GST-Tα1融合蛋白。
3.将GST-Tα1融合蛋白对PBS或50mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L CaCl2、150mmol/L NaCl(pH8.0)透析，按每单位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反应2～16小时，融合蛋白酶切后生成Gly-Tα1。
4.酶切裂解液过Glutathione Sepharose 4B柱，收集含Gly-Tα1的穿过峰。
5.将上述Gly-Tα1收集液对50mmol/L Tris pH8.0透析后上sourceQ阴离子交换柱，用0～1mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集主峰，即得纯Gly-Tα1。纯度为90％以上，表观分子量为3.1KD。
活性测定1.E玖瑰花结实验按常规方法分离健康人外周血单核细胞，小牛血清调整细胞数至2×106/ml。各取200ul细胞液入试管，分别加入样品。37℃水浴90分钟。每支试管中加入200μl绵羊红细胞(2×108/ml)，4℃放置2～3小时；涂片，染色，于高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玖瑰花结的细胞数(结合3个及3个以上绵羊红细胞)，计算玖瑰花形成细胞的百分数，按下述公式计算激活率。结果见表3
表3 Gly-Tα1对E-玫瑰花结形成率的影响E-玫瑰花结形成率激活率对照43.3±1.00 0Gly-Tα1(20μg/ml) 57.6±1.00**33.0％合成Tα1(20μg/ml) 60.3±2.08**39.3％n＝3，**P＜0.01，与对照相比由表3可见Gly-Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，且其作用与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
2.细胞增殖实验取小鼠脾脏，用无菌注射器芯将脾脏挤压过200目的钢丝网，得到单个细胞。用含10％小牛血清的1640培养液将脾细胞配成5×106个细胞/ml，将细胞悬液以200μl/孔铺96孔板，每孔加5μl不同浓度的Gly-Tα1及合成Tα1，复3孔，并设对照。37℃，5％CO2孵箱中培养72小时，MTT法测定。结果见表4表4 Gly-Tα1对小鼠脾细胞增殖的作用吸收值(630nm)浓度(mol/L) Gly-Tα1合成Tα1对照10-70.185±0.021**△△0.153±0.012**0.123±0.01210-80.160±0.020**0.167±0.000**10-90.177±0.019**0.178±0.016**10-100.146±0.001**0.146±0.002**10-110.121±0.0000.118±0.01510-120.122±0.0110.109±0.005n＝6，**P＜0.01，与对照相比；ΔΔP＜0.01，与合成Tα1相比由表4可见Gly-Tα1对小鼠脾细胞增殖具有显著促进作用，其活性与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
本发明具有以下优点1.采用基因工程方法制备重组胸腺素α1(Gly-Tα1)，克服了化学合成成本高，且污染环境的缺点。
2.获得的Gly-Tα1经E-玫瑰花结试验及脾细胞增殖试验显示，Gly-Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，对小鼠脾细胞增殖具有显著促进作用，且Gly-Tα1的生物学活性与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
表1Gly-Tα1基因核苷酸序列表5’-GGA TCC GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC AAGGAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCA GAA AAT-3’表2Gly-Tα1氨基酸序列表Gly Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu IleThr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu ValVal Glu Glu Ala Glu Asn
权利要求
1.一种重组胸腺素α1，其特征在于氨基酸组成较天然胸腺素α1的氨基酸序列的N端前多一个甘氨酸。
2.权利要求1所述重组胸腺素α1的制备方法，包括(1)融合表达载体的构建；(2)大肠杆菌工程菌的发酵；(3)重组胸腺素α1的制备与纯化；其特征在于所构建的融合表达载体为pGEX-4T-1/Tα1，所用的上游引物为5′-G G G G A T C C G A C G C A G C C G T A G A C-3′，下游引物为5′-G G G A A T T C T T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′，模板为人胎盘cDNA。
3.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于所用的大肠杆菌工程菌为DE3/pGEX-4T-1/Tα1。
4.权利要求1所述重组胸腺素α1用于制备免疫制剂药物的用途。
全文摘要
本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组胸腺素α1即Gly－Tα1及其制备方法。天然胸腺素α1都采用固相合成法全合成，不仅成本高，而且易污染环境。本发明采用基因工程方法，以5′－GGGGATCCGACGCAGCCGTAGAC－3′为上游引物、5′－GGGAATTCTTATTTTCTGCCTCTTCCAC－3′为下游引物，以人胎盘cDNA为模板进行PCR，扩增出目的基因片段，通过EcoRI/BamHI双酶切将目的基因定向克隆到质粒pGEX－4T－1上构建融合表达载体pGEX－4T－1/Tα1。制备的工程菌可表达出谷胱甘肽硫转移酶－胸腺素α1融合蛋白，亲和层析纯化融合蛋白，凝血酶酶切释放出Gly－Tα1，最后通过亲和层析和离子交换层析纯化出Gly－Tα1。经试验，Gly－Tα1的生物学活性不亚于合成的胸腺素α1。本发明制备方法简单，成本低廉，且不会造成环境污染。
文档编号A61P37/00GK1398899SQ02136180
公开日2003年2月26日 申请日期2002年7月25日 优先权日2002年7月25日
发明者郭葆玉, 苗红, 章杰, 袁鹏群, 道书艳, 邱磊, 张冉 申请人:中国人民解放军第二军医大学