专利名称：提纯生物组合物的方法
技术领域：
本发明涉及从生物组合物(诸如血液)去除分析物(诸如蛋白感染素蛋白)的方法。
背景技术：
在输入病体以前，细胞血产品(诸如血红细胞(“RBC”)和血小板)可以经过大量的提纯和存储过程。提纯过程包括钝化、和/或去除污染的病原体(例如，病毒、细菌、原生动物)，以及清除不需要的蛋白和核酸。据认定，红细胞的提纯能够影响存储血产品的保存期，也能够影响输血后体内血细胞的成活率。
在存储期间，血液组合物、诸如血红细胞，经过形态学与生化方面的变化，能够发生细胞溶解，称为溶血作用。形态学与生化方面的变化能够影响红细胞膜的流动性，以及红细胞中血红蛋白向组织传递氧的能力。存储期间发生的形态学变化最终导致细胞上刺状体的出现(细胞刺状增多症echinocytosis)。这些刺状体能够以泡囊芽体的形式脱落，从而完全改变细胞表面积与体积的比率，以及其窄通路变形的能力。该非正常与受损的细胞通常应从血流中清除。相应地，如果最小数量的细胞(通常至少75％红细胞)在输血后能够循环24小时，那么该细胞会被认为适合输血。
在某些情况下，人们期望延长血细胞储存的时间。例如，自体的血产品，也就是手术过程之前从供体取出、并且在手术过程中或之后再输入供体的血产品，其在手术进行之前也许会过期。人们也计划，将血液产品存储数月，再次测定供体，以获得由传染物造成疾病的证据，该疾病会在感染供体的数周后显现。这些疾病包括，AIDS或肝炎病。
发明概述本发明部分地基于发明了从血细胞去除分析物的方法，该方法制备了明显减少细胞群体中残留分析物含量的血细胞。该方法适用大容积的血细胞悬液，此方法制备的细胞经长时间储存仍保持生活力，并且适用于治疗，诸如输血。可取的血细胞制备是含有红血细胞(RBC)群体的制备。
本发明提供了减少血细胞悬液中胞外液的含量(例如原生质)的方法。本方法包括，提供含有血细胞和胞外液的大容积血细胞悬液；用特定清洗溶液清洗血细胞悬液，与初始悬液中胞外液含量相比，血细胞悬液中胞外液含量足以减少了至少103倍。同时，也提供了本发明清洗方法制备的血细胞组合物。还提供了将本发明清洗方法制备的血细胞组合物输入受体的方法。
在优选的实施方案中，提供了待清洗的血细胞悬液，其容积大于40毫升、50毫升、75毫升、100毫升、200毫升、300毫升、400毫升或甚至1L。
在优选的实施方案中，清洗的血细胞在4℃下适当的储存溶液中经长时间保存，仍保持生活力。例如，在可取实施方案中，清洗的血细胞在1-6℃下(可取的是4℃)储存24天，仍保持生活力。在可取实施方案中，清洗的血细胞在1-6℃下(优选的是4℃)储存24小时、2天、7天、14天、21天、28天、35天、40天、42天、或更长时间，仍保持生活力。
相对于血细胞初始悬液中分析物浓度，本发明的清洗方法明显减少了血细胞悬液中任何残留分析物的浓度。在一些实施方案中，能够减少多种分析物的浓度。在一些实施方案中，分析物与细胞质膜有关，例如在质膜的细胞外表面上。在一些实施方案中，分析物出现在血细胞悬液的胞外液中。
在一些实施方案中，分析物是小分子。在本发明的可取实施方案中，提供了充分减少供体血细胞悬液中非需要小分子浓度的方法，该非需要小分子也许会对受体造成潜在的威胁，诸如药物、抗病原体或细胞保存剂。如文中所用，“小分子”指的是质量大约小于1000道尔顿的分子。能够用本发明方法去除的小分子实例有甘油、二甲亚砜(DMSO)、乙亚胺低聚物及其衍生物、吩噻嗪衍生物、补骨脂素、吖啶衍生物、核黄素或药物，诸如抗凝剂、或抗生素。在一些实施方案中，分析物是小分子，与血细胞初始悬液中分析物浓度相比，本发明的清洗方法以至少100的系数(可取的至少是1000)减少任何残留分析物的浓度。因此，在可取实施方案中，本发明的方法充分减少了供体血细胞悬液中非需要小分子的浓度，从而，在保持血细胞悬液治疗适用性同时，减少了对受体药理学、免疫学、毒理学的负面影响及其风险，甚至在输血前可以经过长期储存(血小板的储存期大于3天，血红细胞的储存期大于14天)。
在其它实施方案中，分析物是大于1000道尔顿的分子。例如，分析物可以是大分子，诸如核酸或蛋白。在可取实施方案中，本发明提供了充分减少供体血细胞悬液中非需要大分子浓度的方法，该非需要的大分子也许会给受体带来潜在危害，诸如，导致神经性失调的蛋白感染素蛋白；酶、抗体、以及能造成受体产生发炎和发热反应的细胞因子；能导致过敏反应的原生质蛋白。在血细胞悬液中，按照本发明方法减少的蛋白分析物实例有蛋白感染素蛋白、细胞因子(例如，白细胞间质素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞间质素6、白细胞间质素8、白细胞间质素10)、炎性酶(嗜中性弹性蛋白酶、组织蛋白酶、丝氨酸蛋白酶)、过敏毒素(例如，C3a、C5a、血管舒缓激肽)；免疫球蛋白(例如，IgG、IgM和IgA)。在可取实施方案中，本发明的方法充分减少了供体血细胞悬液中非需要大分子的浓度，甚至经长期储存后，在保持血细胞悬液治疗适用性同时，减少了受体非需要的反应及其风险。
在其它实施方案中，待去除、和/或减少的分析物是细胞，例如，细菌、原生动物、或毒粒，特别是细胞外毒粒。在特别可取实施方案中，由本发明方法去除、和/或减少的细胞是白细胞(包括白细胞膜片段)。在可取实施方案中，本发明的方法充分减少了供体血细胞悬液中非需要细胞和细胞片段的浓度，甚至经长期储存后，在保持血细胞悬液治疗适用性同时，减少了受体的非需要反应。
相应地，本发明提供了一种方法，通过减少供体血液制备的血细胞悬液中潜在有害分析物的浓度，减少了受体非需要反应的发生及其风险。在可取实施方案中，该方法包括，相对于其在血细胞悬液的初始浓度，非需要分析物浓度的减少达到10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、或106倍。非需要分析物可以是小分子或大分子。“小分子”指的是分子量小于1000道尔顿的分子。前述的实例包括甘油、DMSO、乙亚胺低聚物、补骨脂素、基于吩噻嗪的药剂、基于吖啶的药剂、核黄素、或由美国血液银行联盟或FDA或美国军方认定为不适合献血的任何药物。
分析物是可替换或添加的大于1000道尔顿的分子。例如，分析物可以是大分子，诸如核酸或蛋白。依据本发明方法，在血细胞悬液中其含量减少的蛋白分析物实例是蛋白感染素蛋白，特别是致病的蛋白感染素蛋白。用本发明方法去除的其它分析物实例有细胞，例如白细胞、微生物病原体(诸如细菌、真菌或原生动物有机体)、或传染性病毒体。
在优选的实施方案中，清洗包括，先离心血细胞悬液，生成粒状细胞碎片和含有胞外液的上清液；再从粒状细胞碎片去除上清液；接着，向粒状细胞碎片加入清洗溶液；最后，在清洗溶液中再悬浮粒状细胞碎片，生成再悬浮细胞悬液。如果需要，离心和再悬浮步骤可以重复进行，例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、或更多。重复离心和再悬浮步骤的次数将由胞外液和/或分析物需要减少的倍数、以及每个清洗步骤所用清洗溶液与胞外液的比率决定。为了达到胞外液的减少倍数，清洗溶液与胞外液比例越大，所需清洗循环的次数就越少。例如，50％血球比率的300毫升血红细胞浓缩物含有150毫升血红细胞与150毫升胞外液。如果血液经离心达到80％血球比率的红细胞沉淀，去除残留的胞外液，浓缩的血红细胞中残留的胞外液是30毫升。如果该血液再次悬浮在另加入的270毫升清洗溶液中，胞外液就稀释成原来的1/10。该过程可以重复多次。第一、第二、第三次循环分别实现了10倍、100倍、1000倍的细胞外稀释效果。
初始的和本发明方法清洗所得的血细胞悬液可用业内公知的方法测定，例如，使用特异于分析物的测定方法，测定分析物需要减少的倍数，和/或血细胞的生活力。
在一些实施方案中，本发明的清洗溶液是磷酸缓冲盐溶液。在一些实施方案中，本发明的清洗溶液含有50mM或更低浓度的磷酸盐，大约12到30mM磷酸盐。本发明的实施方案部分基于发现，与用非磷酸盐溶液清洗的细胞悬液相比，用磷酸盐缓冲液清洗血细胞悬液，造成了分析物(例如，乙亚胺低聚物或其衍生物)的持续减少。此外，与非缓冲盐溶液清洗的细胞悬液相比，用磷酸盐缓冲液清洗的本发明细胞悬液具有更低的溶血水平，并且维持更高的ATP浓度。
在优选的实施方案中，血细胞悬液包括哺乳动物血细胞。可取的是，获得的血细胞来源于人体、非人类的灵长动物、狗、猫、马、奶牛、山羊、绵羊、或猪。在可取实施方案中，血细胞悬液包括血红细胞、和/或血小板、和/或白细胞、和/或骨髓细胞。在特别可取的实施方案中，本发明方法可用于去除、和/或减少血细胞悬液中胞外液、或胞外液与分析物，该血细胞悬液含有哺乳动物(诸如人)的血红细胞浓缩物、或血小板浓缩物、或白细胞浓缩物。在可取实施方案中，血细胞悬液含有哺乳动物的无核细胞浓缩物。在特别可取的实施方案中，本发明方法可用于去除、和/或减少哺乳动物(诸如人)血红细胞浓缩物中胞外液、或胞外液与分析物。
在优选的实施方案中，与初始细胞悬液的含量相比，清洗至少将残留的胞外液减少了104倍、105倍、或106倍。在更可取的实施方案中，与初始细胞悬液的含量相比，清洗至少将残留的胞外液减少了107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。在更甚可取的实施方案中，与初始细胞悬液的含量相比，清洗至少将残留的胞外液减少了1012倍、1013倍、1014倍、1015倍、1016倍、1017倍、或1018倍。
在优选的实施方案中，与初始血细胞悬液中其浓度相比，清洗至少将分析物浓度减少了102倍、103倍、或104倍。在可取的实施方案中，与初始血细胞悬液中其浓度相比，清洗至少将分析物浓度减少了105倍、或106倍。在更可取的实施方案中，与初始血细胞悬液中其浓度相比，清洗至少将分析物浓度减少了107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。在附加可取的实施方案中，与初始血细胞悬液中其浓度相比，清洗至少将分析物的浓度减少了1012倍、1013倍、1014倍、1015倍、1016倍、1017倍、或1018倍。
在优选的实施方案中，减少的分析物是小分子，本发明方法用于将分析物浓度减少到药理学、免疫学、或病毒学钝化的水平。在可取实施方案中，减少的分析物是抗病原体，诸如乙亚胺低聚物、吩噻嗪衍生物、补骨脂素、吖啶衍生物，核黄素。可取的是，本发明方法用于将抗病原体浓度减少到不能在身体中发挥效力的水平。
在一些优选的实施方案中，最终减少的抗病原体浓度大约少于1克/毫升，可取的是大约少于1毫克/毫升。在附加可取的实施方案中，抗病原体减少的最终浓度大约少于10-4克/毫升，大约少于10-5克/毫升，大约少于10-6克/毫升，大约少于10-7克/毫升，大约少于10-8克/毫升，大约少于10-9克/毫升，大约少于10-10克/毫升，大约少于10-11克/毫升，或大约少于10-12克/毫升。
在一些实施方案中，清洗过程是自动的。在一些实施方案中，清洗在密闭系统中进行，以避免导入环境微生物。
在一些实施方案中，用钝化病原体的化合物(诸如乙亚胺低聚物或其衍生物)预处理血细胞悬液后，进行清洗过程。
在一些实施方案中，在清洗前后将血细胞悬液通过生物相容的过滤器，可取的是白细胞减少过滤器。
在优选的实施方案中，减少的分析物是细胞，诸如白细胞，该血细胞悬液经乙亚胺低聚物处理后，例如二聚体、三聚体、或四聚体、或其衍生物，再进行本发明的清洗过程。相对于初始细胞悬液中细胞分析物浓度，细胞悬液中其浓度至少减少了100倍、103倍、104倍、或105倍。在更可取的实施方案中，细胞悬液中细胞分析物浓度至少减少了106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。当减少的细胞分析物是白细胞时，本发明的上述实施方案是部分地基于发现，用乙亚胺低聚物处理血红细胞悬液，再结合按照本发明方法的清洗过程，产生了充分去除白细胞的血红细胞悬液。
在另一优选的实施方案中，减少的分析物是白细胞，先用乙亚胺低聚物处理血红细胞悬液，再用过滤器减少白细胞，最后依照本发明方法进行清洗。按照本发明的上述方法，至少将细胞悬液中的白细胞减少了103倍、104倍、或105倍。在更可取的实施方案中，细胞悬液中的白细胞浓度减少了至少106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。
在优选的实施方案中，血细胞悬液中减少的分析物是蛋白感染素蛋白，与血细胞初始悬液中的含量相比，本发明方法将蛋白感染素蛋白含量至少减少了10倍，可取的是102倍。可取的是，与血细胞初始悬液中其含量相比，蛋白感染素蛋白(PrP)至少减少了103倍、104倍、或105倍。更可取的是，与血细胞初始悬液中其含量相比，清洗足以将蛋白感染素蛋白含量减少了至少106倍、107倍、或108倍。更可取的是，与血细胞初始悬液中其含量相比，蛋白感染素蛋白至少减少了109倍、或1010倍。
在本发明的实施方案中，本发明的清洗过程减少了血细胞悬液中蛋白感染素蛋白的含量。在另一实施方案中，本发明的清洗过程减少了血细胞悬液中蛋白感染素蛋白的含量，其中清洗溶液含有亲脂性的乳化液。在另一实施方案中，本发明的清洗过程结合血细胞悬液穿过血液相容过滤器(可取的是白细胞减少过滤器)的操作过程，减少了血细胞悬液中蛋白感染素蛋白的含量。在另一可取实施方案中，本发明的清洗过程减少了血细胞悬液中蛋白感染素蛋白的含量，其中清洗溶液含有亲脂性的乳化液，并且将血细胞悬液穿过血液相容的过滤器。
在优选的实施方案中，由本发明上述方法去除、和/或减少的蛋白感染素蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。虽然没有理论依据，但是人们仍认为血液、和/或血产品会在某些情况下传播蛋白感染素病原体。在特别可取的实施方案中，由本发明上述方法去除、和/或减少的蛋白感染素蛋白是内生血液运载的蛋白感染素蛋白。在特别可取的实施方案中，由本发明方法去除、和/或减少的蛋白感染素蛋白是致病的血液运载蛋白感染素蛋白。在特别可取的实施方案中，致病的血液运载蛋白感染素蛋白从哺乳动物红细胞悬液中去除，特别是从哺乳动物(例如人)全血或红细胞浓缩物中去除。
在优选的实施方案中，血细胞悬液中减少、和/或去除的蛋白感染素蛋白包括，由本发明清洗过程去除的可溶性蛋白感染素蛋白。在可取实施方案中，血细胞悬液中减少、和/或去除的蛋白感染素蛋白包括与膜相关的蛋白感染素蛋白，亲脂性乳化液可加入本发明的清洗缓冲液，并且/或将血细胞悬液通过血液相容的过滤器。在可取实施方案中，从血细胞悬液中减少、和/或去除的蛋白感染素蛋白含有不溶性蛋白感染素蛋白；亲脂性乳化液可加入本发明的清洗缓冲液，并且/或将血细胞悬液通过血液相溶的过滤器。在可取实施方案中，从血细胞悬液中减少、和/或去除的蛋白感染素蛋白包括其多种物理形式；清洗、过滤、和/或亲脂性乳化液的组合可用于实现上述对数水平的降低。
在优选的实施方案中，分析血细胞悬液，测定在本发明清洗过程、或清洗/过滤结合过程前后是否存在蛋白感染素蛋白。在特别可取的实施方案中，化验血红细胞悬液，测定在本发明清洗过程、或组合的清洗与过滤过程之后是否存在致病的蛋白感染素蛋白、和/或其聚集体。在任意浓缩蛋白感染素蛋白的步骤之后，检测残留的蛋白感染素蛋白；在本发明清洗过程、或组合的清洗与过滤过程后，如果有残留的话，残留的蛋白感染素蛋白结合于血红细胞组合物。
在特别优选的实施方案中，减少了血产品对蛋白感染素介质疾病的传播或其风险，特别是传染性海绵状脑病。在另一特别可取的实施方案中，从其通过血产品的潜伏时间来看，蛋白感染素介质疾病(特别是传染性海绵状脑病)的发作明显延迟。在可取的实施方案中，本发明下述方法提供了蛋白感染素介质疾病(特别是传染性海绵状脑病)发作中传染风险的减少或延迟。依据本发明方法，清洗、或清洗并过滤血细胞悬液，从而减少了胞外蛋白浓度，可取的是蛋白感染素蛋白，特别可取的是致病蛋白感染素蛋白。将清洗的血细胞悬液输入受体。在特别可取的实施方案中，受体是一位人类受体，清洗的血细胞悬液是人血细胞浓缩物，诸如RBCC。
本发明方法任意包括，测定减少的胞外蛋白浓度的步骤。胞外蛋白减少的测定包括，测定胞外免疫球蛋白G、血清白蛋白、蛋白感染素蛋白、和/或致病的蛋白感染素蛋白浓度的降低。
在优选的实施方案中，输入受体、清洗的血细胞悬液含有与第二清洗血细胞单元相关联的胞外蛋白浓度，生物测定第二清洗血细胞单元中的传染性蛋白感染素蛋白。在特别可取的实施方案中，与所观察未清洗对照发病率相比的动物生物测定中，第二清洗的血细胞单元造成了蛋白感染素介质疾病的低发病率，特别是传染性海绵状脑病。另一可取的实施方案中，与所观察未清洗对照发病率相比的动物生物测定中，第二清洗的血细胞单元造成了蛋白感染素介质疾病的延迟发作，特别是传染性海绵状脑病。在特别可取的实施方案中，用于输血的清洗血细胞悬液含有胞外免疫球蛋白G、血清白蛋白、蛋白感染素蛋白、和/或一定浓度的致病蛋白感染素蛋白，该浓度与血细胞单元的浓度相关，该血细胞单元未造成生物分析中蛋白感染素介质疾病(特别是传染性海绵状脑病)的发作或导致其延迟发作。
除非另有说明，文中所用的全部技术和科学名词都具有本发明所属行业中普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与文中所述相似或相同的方法或材料可用于本发明的实施或测定，但适合的方法与材料将在下文中描述。所有文献、专利申请、专利、和文中所提的其它参考全部通过在此引述而合并于本文。在矛盾的情况下，将以本说明书和其相关的定义为准。此外，这些材料、方法、和实例仅起到说明的作用，并非对本发明加以限制。
下文的发明详述和权利要求将使本发明的其它特征与优点显得清晰明了。
发明详述本发明部分基于意外发现，用盐溶液(特别是磷酸缓冲盐溶液)大量清洗大容积的血红细胞后，其仍保持着结构、新陈代谢与功能的特性。经长期储存后，清洗的血细胞仍保持其特性。本发明清洗的血细胞适合于输血。
本发明的方法通常可用于从生物组合物中去除、和/或减少分析物。“生物组合物”指的是含有细胞的组合物，或含有一种或多种生物分子的组合物，或含有细胞与一种或多种生物分子的组合物。含有细胞的组合物包括，例如血液、血红细胞浓缩物、血小板浓缩物、白细胞浓缩物、血浆、富含血小板的血浆、脐血、精液、骨髓、胎盘提取物、哺乳动物的细胞培养或培养介质，发酵产物和腹水。生物组合物也可以是游离细胞，并且至少含有一种生物分子。
“生物分子”指的是生命有机体中正常出现的任何种类的有机分子，包括，例如大分子，诸如核酸、多肽、翻译后的修饰蛋白(例如糖蛋白)、多糖、与脂类。含有生物分子的生物组合物包括，例如血清、血细胞蛋白、血浆浓缩物、血浆蛋白片段、提纯或部分提纯的血蛋白或其它成分、任何分离血浆的上清液或沉淀、提纯或部分提纯的血液成分(例如蛋白、或脂类)、乳液、尿液、唾液、细胞溶解产物、冷凝沉淀物、冷凝上清液、或其部分、或其衍生物、和含有正常或变形细胞培养产物的组合物。
生物组合物来源于任何需要的动物。例如，该方法可用于含有哺乳动物血细胞的细胞悬液(包括人、非人灵长动物、犬、猫、马、或鼠的血细胞)。可取的哺乳动物血细胞是血红细胞或血小板。
文中“血产品”涉及具有治疗作用(例如，给受体输血)、清洗的生物组合物。
文中定义的“蛋白感染素介质疾病”涉及发现不正常蛋白感染素蛋白相关的疾病，包括传染性海绵状脑病，诸如瘙痒病、牛海绵状脑病、CJD(Creutzfeldt-Jakob disease)、和变异型CJD。
总之，可以使用具有渗透相容性、并对要清洗的细胞类型无毒害的任何清洗溶液。对于血细胞，可取的清洗溶液包括盐溶液(0.9％氯化钠)、磷酸缓冲盐溶液(0.9％氯化钠、13mM磷酸钠，或0.9％氯化钠、30mM磷酸钠)、和葡萄糖盐溶液(0.2％葡萄糖、0.9％氯化钠)。
按照本发明方法清洗血红细胞，可取的清洗效果是，完成清洗过程后，清洗的血红细胞的血球比在50-70％。可取的是，作为清洗过程的结果，损失掉低于20％的红细胞。
如上所述，分析物包括小分子。“小分子”指的是分子量小于1000道尔顿的分子。前述实例包括甘油、DMSO、乙亚胺低聚物、补骨脂素、基于吩噻嗪的药剂、基于吖啶的药剂、核黄素、或由美国血液银行联盟或FDA或美国军方认定为不适合献血的任何药物。
如上所述，分析物也包括大于1000道尔顿的分子。例如，分析物可以是大分子，诸如核酸或蛋白。依据本发明方法，在血细胞悬液中其含量减少的蛋白分析物实例是蛋白感染素蛋白，特别是致病的蛋白感染素蛋白。用本发明方法去除的其它分析物实例有细胞，例如白细胞、微生物病原体(诸如细菌、真菌或原生动物有机体)、或传染性病毒体。
名词蛋白感染素是造成传染性海绵状脑病传染物的同义词，例如人变异的CJD、牛海绵状脑病、和羊瘙痒症。本发明方法可用于去除、和/或减少生物组合物(特别是血细胞悬液)中任何形式的蛋白感染素蛋白。文中所用的名词蛋白感染素蛋白(PrP)包括天然型、非传染型(通常称为PrPC)、致病型(通常称为PrPSc)、β-折叠型、应用DNA重组技术在细菌或真核细胞中制备的PrP(通常称为重组的PrP或recPrP)、以及主要带有α-螺旋(α-recPrP)或β-(β-recPrP)第二结构的生命体外重折叠型、或这些类型中一种或多种组合的超分子聚合体(聚合的PrP或PrPAG)。文中所用的名词蛋白感染素蛋白包括PrP的任何物理形式，例如以可溶、不可溶、蛋白酶敏感、或蛋白酶不敏感、与膜相关、与膜无关、聚集或非聚集为特征的蛋白感染素蛋白。文中所用的致病蛋白作为广义的传染性蛋白、和/或单纯的疾病产物。因此，本发明的致病蛋白感染素蛋白包括具有传染性、和/或作为疾病产物的任何前述蛋白。
蛋白感染素蛋白包括致病的蛋白感染素蛋白、还包括血液运载的致病蛋白感染素蛋白，其可以通过各种方法测定，其中包括使用下列的一种或多种方法使用抗体，参见，例如美国专利5,846,533；DELFIA测定，参见Hemmila，Scand.J.Clin.Lab.Invest，48389-399，1988，和MacGregor等人，Vox Sang，7788-96，1999；核酸分子，参见，例如WO97/15685；应用动物生物测定法，参见，例如Crozet，C，Flamant，F，Bencsik，A，Aubert，D，Samarut，J，和Baron，T(2001)。在表达绵羊蛋白感染素蛋白基因的转基因鼠中，离析出两种不同绵羊瘙痒症的有效传播，JVirol75，5328-34；Manson，J.C.Barron R，Jamieson，E，Baybutt，H，Tuzi，N，McConnell，I，Melon，D，Hope，J，和Bostock，C.(2000)。鼠蛋白感染素蛋白的单个氨基酸变化显著改变了TSE的潜伏时间，Arch Virol Suppl95-102；Scott，M.R，Will，R，Ironside，J，Nguyen，H.O，Tremblay，P，DeArmond，S.J，和Prusiner，S.B(1999)。牛海绵状脑病蛋白感染素传播给人类的强迫输异基因的证据，Proc Natl Acad Sci USA96，15137-42 Moore，R.C和Melton，D.W(1997)。蛋白感染素疾病的转基因分析，Mol Hum Reprod3，529-44.Race，R.E，Priola，S.A，Bessen，R.A，Ernst，D，Dockter，J.Rall，GF，Mucke，L，Chesebro，B，和Oldstone，M.B.(1995)。在转基因鼠中，仓鼠蛋白感染素蛋白小基因的神经元特异性表达诱发了对仓鼠瘙痒症介质的敏感性，神经元15，1183-91；Telling，G.C，Scott，M，Hsiao，K.K，Foster，D，Yang，S.L，Torchia，M，Sidle，K.C，Collinge，J，DeArmond，S.J，和Prusiner，S.B(1994)。从人向表达嵌合的人-鼠蛋白感染素蛋白的转基因鼠传播CJD，Proc NatlAcad Sci USA91，9936-40；7.Westaway，D，Mirenda，C.A，Foster，D，Zebarjadian，Y，Scott，M，Torchia，M，Yang，S.L，Serban，H，DeArmond，S.J，Ebeling C，等人(1991)。通过表达来源于长潜伏期鼠的蛋白感染素蛋白转基因，奇异性地缩短了瘙痒症潜伏时间，神经元7，59-68；Prusiner，S.B，Scott，M，Foster，D，Pan，K.M，Groth，D，Mirenda，C，Torchia，M，Yang，S.L，Serban，D，Carlson，G.A，等人(1990)。转基因研究暗示了瘙痒症蛋白感染素复制过程中相似的蛋白感染素蛋白异构体之间的相互作用细胞63，673-86，应用基于细胞的生物测定，参见，例如Birkett，C.R，Hennion，R.M，Bembridge，D.A，Clarke，M.C，Chree，A，Bruce，ME，和Bostock，CJ (2001)。在培养的细胞系增殖中，瘙痒症菌株保持着生物表型，EMBOJ 20，3351-8；Vilette，D，Andreoletti，O，Archer，F，Madelaine，MF，Vilotte，J.L，Lehmann，S，和Laude，H(2001)。在表达绵羊蛋白感染素蛋白的异种上皮细胞中，传染性绵羊瘙痒症介质的体外增殖，Proc Natl Acad Sci USA98，4055-9；并依照文中所述的实施例。
通过观察动物的临床病征，在动物生物测定中检测出蛋白感染素介质疾病的发作，包括传染性海绵状脑病。例如，绵羊传染性海绵状脑病的临床病症是多变的，但是包括普遍的神经性功能失调、行为改变、神经过敏、共济失调、puritis和调节能力低下。这些病征能够在数小时、数天或数周内逐步表现出来，实验动物需要每天定时观察。即使未发现临床病症，也应该将死牲畜认为是疾病的潜在受害者。可疑情况的进一步确定可以通过脑病理学的尸检(post-mortem examination)，寻找TSE损伤的致病三合体—神经纤维网的析稀、神经胶质细胞的肥大与增生、以及神经元的损失。一些情况下，在荧光显微镜下也可以发现可见的淀粉状沉淀。推荐使用免疫组织化学与蛋白质印迹分析，筛选一些分离的脑切片与外围淋巴组织切片，测定是否存在不正常的蛋白感染素蛋白，以进一步确定TSE疾病。
虽然没有特殊的理论依据，可以假定，受污染的血细胞制剂中传染粒子的尺寸范围是从高次序的纤维状聚集体、到非正常折叠的单体蛋白。相应地，蛋白感染素可以i)出现在环境液体中，ii)通过离子相互作用或疏水性相互作用非共价连接到红细胞的表面，或iii)通过其GPI膜锚着点部分地并入RBCC膜。因此，可以假定，通过彻底清洗，依照本发明可以实现蛋白感染素的降低，在彻底清洗中周围的致病蛋白感染素蛋白不断减少，从而改变了RBCC表面的结合平衡。
本发明的一个优点是，与对应的非清洗细胞悬液相比，清洗的血细胞含有明显减少的分析物含量。
本发明的另一个优点是，能够清洗大容积的生物悬液，诸如血细胞。因此，在一些实施方案中，血细胞提供在容量至少50毫升的悬液中。在另一些实施方案中，提供的悬液容积至少是100毫升、125毫升、250毫升、400毫升、甚至1L或更大。
本发明方法所用的血细胞悬液包括有核细胞或无核细胞。“无核细胞”指的是当成熟时缺少细胞核的细胞。无核细胞的实例有血小板与血红细胞。因为输血通常涉及无核细胞的迁移，人们期望从其它血液成分中分离出这些细胞，诸如白细胞(例如，淋巴细胞、中性白细胞、和单核细胞)与生物分子(例如，白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子和补体)。例如，输血以前，全血可以分成血红细胞部分(含有小部分的白细胞)和血浆(其也含有低百分比的白细胞)。基于其密度差异，可以使用标准方法，诸如Ficoll或Percoll梯度法，实现全血不同成分的分离。实现无核细胞分离的多种系统都是商业可得的，包括Haemonetics公司(Braintree，MA)的MCS去除系统。按照本发明的方法，清洗上述血细胞悬液。
在可取的实施方案中，使用离心法，从生物组合物中去除、和/或减少分析物。例如，该方法包括，先离心血细胞，生成包裹的细胞碎片和含有胞外液的上清液。再从包裹的细胞碎片中去除上清液。接着，将清洗溶液加入包裹的细胞碎片中，在清洗溶液中再次悬浮包裹的细胞碎片，生成再悬浮的细胞悬液。再悬浮的细胞可以进行再次的离心与悬浮。在一些实施方案中，细胞经过如文中所述的2次、3次、4次、或5次、或更多次的离心与再悬浮过程。本发明不限定清洗的特定次数，相反，离心与再悬浮步骤的次数将由需要的胞外液减少倍数、或需要的胞外液与分析物减少倍数、以及清洗溶液与胞外液的比率决定。与本发明和材料共同使用的离心系统，包括与离心系统共同使用的一次性装置，都是商业可得的。离心系统包括Baxter(Deerfield，Illinois)的Haemonetics V215离心机(Braintree，MA)、CS-30000和Amicus，来自Gambro(Arvada，colorado)的Spectra和Cobe 2991细胞处理机。
可以在1℃-40℃下，采取本发明的清洗方法，可取的是20-30℃，更可取的是室温。离心速度可以是5,000-11,000转/分钟，可取的是6,000-10,000转/分钟。
清洗步骤可以在无菌条件下人工进行，或自动进行。例如，血红细胞可以放置于无菌容器中，诸如塑料袋。然后，将此塑料袋与机器相连，此机器在无菌条件下将袋中细胞泵出，用清洗溶液任意清洗此塑料袋，并用无菌的清洗溶液稀释血红细胞，在所需的温度下温和地持续搅拌溶液，达到所需的时间，通过离心收集血红细胞，清除用过的清洗溶液(例如，盐溶液、葡萄糖盐溶液、磷酸盐缓冲液)。接着，再加入新鲜的清洗溶液，并将清洗与离心步骤重复需要的次数。经过最后一轮清洗，细胞再次悬浮在储存溶液中，并返回初始容器。最后，该细胞可以按照需要立即使用、储存、或冷冻。
当细胞储存达到7天时，储存液可以是，例如葡萄糖盐溶液、盐溶液、或磷酸缓冲盐溶液。当细胞在4℃下储存超过7天时，储存溶液是含有葡萄糖与磷酸盐的储存营养液，诸如Pall公司的NUTRICEL[AS-3]；Baxter(Deerfield)的AS-1，Terumo的AS-5，Pall公司的CPDA-1、CPD、CP2D。当细胞冷冻贮存时，贮存液含有甘油、或DMSO。
当以自动方式进行本发明的清洗方法时，血细胞悬液可以泵入离心机的适当管道。选择泵速率与管道尺寸，在保证泵效率最大化同时，使细胞损伤与总清洗时间最小化。然而，可取的泵速率达到，不需要动力调节，避免渗透冲击。相应地，本发明的泵速率可以在50-200毫升/分钟。一次性血液管道装置通常由医用级聚氯乙烯制成，并可从多种商业来源购买，例如Pall公司.EastHills，NY，Baxter International，Deerfield，Illinois，Haemonetics，Braintree，MA和Cobe，Arvada，Colorado。
白细胞悬液可以穿过血液相容过滤器，可取的是白细胞减少过滤器。对于血红细胞与全血，减少白细胞的商业过滤器能够减少99.9％的白细胞含量(大于1000倍的减少)，并可从下列公司获得，Pall公司、East Hills，NY；Hemasure，Marlborough，MA；和Baxter Healthcare，Deerfield，Illinois。
将亲脂的乳化液加入本发明清洗溶液，特别是，从血细胞悬液中去除、和/或减少的分析物是蛋白感染素蛋白或脂类包裹的病毒。该亲脂的乳化液由静脉营养的组合物构成(reviewed inAdvances in intravenous lipid emulsion.Carpentier YA，Dupont IE，Deloyers World J Surg2000 Dec；24(12)1493-7)，该组合物通常以10-20％组分的长链甘油三酸脂(LCT)乳化液配制。在稳定的乳化液中，中等长度的链状甘油三酸脂也增强了从血液中脂类可溶性产物的洗出。脂类乳化液作为非溶血溶剂，有利于从血液中去除亲脂的溶解剂。在清洗溶液中，脂类乳化剂的可取浓度范围是0.1％-20％，其有利于从血液中去除毒性的亲脂物质。
可取的是，清洗在密闭系统中进行，例如，功能性密闭系统。密闭系统中的清洗允许细胞在清洗后长期贮存(例如，多于1、7、14、21、28、35、40、42、甚至50天)，并且不引入环境污染物，诸如微生物污染物。
清洗可以在30分钟到5小时内完成，并且需要大于4升清洗溶液。在可取实施方案中，清洗在4小时内完成，并且使用不到10升清洗溶液。在特别可取实施方案中，清洗在30-60分钟内完成，并且使用多于3升但少于6升的清洗溶液。在特别可取实施方案中，具有40-98％血球比的140-260毫升，可取的是200-220毫升血红细胞，用5至5.5升的溶液清洗，用时是170-195分钟。
在一实施方案中，使用无菌非缓冲盐溶液(例如，0.9％NaCl)稀释全血，以离心方式浓缩细胞，离析血红细胞成分。然后，在无菌盐溶液中再次悬浮血红细胞成分，并在22℃下搅拌10分钟(平缓的机械搅动下)。重复清洗与再悬浮过程，直到达到分析物需要的去除率。相似的过程可用于清洗离析的血小板。
细胞清洗的其它方法包括中空纤维渗析，其中从红细胞中分离可溶性材料，是通过将红细胞再循环穿过带孔的中空纤维，该孔径足够小、能够保留红细胞，并且也足够大、允许大分子穿过(0.2-1微米孔径)。用清洗液不断冲洗毛细管外腔室，该冲洗用来置换和去除穿过中空纤维壁扩散的细胞外可溶性物质。该设备与材料可以从下列来源获得，例如，Mission Medical(SanFrancisco)、Baxter(Deerfield)、Gambro(Lund，Sweden)和Asahi(Tokyo，Japan)。
此外，可以使用自旋膜。将胞外可溶的物质从红细胞浓缩物中分离，是通过使用多孔膜实现的，该孔径足够小、能够保留红细胞，并且也足够大、允许可溶性分子穿过(0.2-1微米)。该膜被封装成中空圆柱体，当此圆柱体旋转时，将红细胞导入。旋转膜以透膜方式去除红细胞外液。商业公司包括Nexell(Santa Ana，CA)，以及Baxter Healthcare的Fenwal部门，提供了基于旋转膜方法的血浆去除装置(Auto C System)。
如果需要，增强血细胞稳定性或钝化、去除传染物的试剂可用于清洗过程。该试剂的实例有抗菌剂与抗病毒剂。举例包括乙亚胺低聚物，诸如二聚体、三聚体、四聚体和其衍生物。乙亚胺低聚体钝化剂优选应用于清洗无核血细胞之前，诸如血细胞或血小板。在本发明清洗过程之前和过程中使用乙亚胺低聚物时，优选的清洗溶液不含淬灭剂。乙亚胺低聚物和生物组合物中的使用方法参见专利WO00/18969和WO98/51660。
意外地发现，按照本发明方法清洗的血红细胞，表现出体内或体外存活期的延长，或两者兼有。例如，在一些实施方案中，在清洗和任意贮藏后，红细胞仍维持其体内的生活力，诸如大于75％清洗细胞在输血后仍保持循环24小时。如下文实施例所述，生活力可以用业内公知的方法测定(例如，使用51Cr放射标记法)。按照本发明方法清洗的红细胞表现出细胞外长期的稳定性。例如，在一些实施方案中，按照本发明清洗血细胞制备中的细胞保存期至少达到7天。在一些实施方案中，清洗的血细胞具有14、21、28、40、或42天或更长的保存期。可取的是，按照本发明清洗并长期贮存的血细胞平均溶血含量小于，例如5％、2.5％、1％甚至0.5％。优选的ATP含量保持在1.5微克/摩尔。
本发明将在下列非限定实施例中进一步说明。
实施例1从血红细胞悬液中去除分析物1A.5000毫升血红细胞的清洗过程在无菌密闭容器中，使用自动系统清洗减少白细胞的血红细胞悬液。在室温下完成此清洗过程。该过程在Haemonetics V215(Haemonetics，Braintree，MA)中进行。离心机转筒的尺寸是275毫升或325毫升。此RBCC清洗循环使用大约5000毫升盐溶液，用时大约190分钟。
血球比为50-70的280-400毫升抗凝结血红细胞浓缩物放置在培养袋中，并与V215无菌连接。首先，将300毫升清洗溶液(例如，0.2％葡萄糖和0.9％盐溶液)加入培养袋中，并使其均衡45秒。将培养袋内含物泵入以8000转/分钟速度旋转的离心机转筒中。泵速度是在50-200毫升/分钟。用80毫升清洗溶液漂洗此培养袋，再将此漂洗液移入转筒中。再次用50毫升清洗溶液漂洗转筒。将转筒内含物返回上述培养袋中，用300毫升清洗溶液稀释，并自然均衡45秒。再将培养袋内含物移入转筒。第二次用80毫升清洗溶液冲洗培养袋。将第二冲洗液加入转筒。用50毫升清洗溶液作为转筒第二漂洗液，漂洗此转筒。将转筒内含物返回培养袋中，并第三次加入300毫升清洗溶液稀释，再均衡45秒。如上所述，清洗培养袋和转筒。十多次地重复上述过程(稀释、冲洗、漂洗、返回)。在第十二次循环中，稀释步骤如上所述，但在移入转筒后将转筒停止，再启动95毫升的清洗循环。
将30毫升转筒内含物移入培养袋，经过10秒延迟后，再次启动离心机，将培养袋中30毫升悬液返回转筒。转筒以8000转/分钟速度旋转30秒，再将95毫升清洗溶液移入转筒。离心机转筒再次停止，并将30毫升转筒内含物移入培养袋，经过10秒延迟后，重新启动离心机，将培养袋中30毫升悬液返回转筒。转筒以8000转/分钟速度旋转30秒。该过程另外重复3-5次。经过7次清洗后，向含有血红细胞的离心机转筒加入240毫升贮存溶液，再将转筒内含物移入最终产物袋中。取出最终产物袋，并密封。
因此，清洗过程由12次300毫升清洗溶液的稀释与7次清洗组成，总共需要大约5L清洗溶液，并清洗用时190分钟。
1B.5500毫升血红细胞的清洗过程在无菌密闭系统中，使用自动系统，清洗血红细胞悬液。在室温下进行此清洗过程。该过程在Haemonetics V215(Haemonetics，Braintree，MA)中进行。离心机转筒的尺寸是275毫升或325毫升。RBCC清洗循环使用大约5500毫升盐溶液，用时大约190分钟。
将50-70血球比、通常具有250-450毫升容积的抗凝结血红细胞浓缩物放置在培养袋中，并与V215无菌连接。为了启动此过程，用100毫升清洗溶液清洗最终产物袋线路。在此过程中，周期性地使用5毫升清洗溶液冲洗与入口线路相通的T-连接、最终产物袋线路、血液泵线路。冲洗T-连接，以防止分析物对最终产物袋线路的污染。为了启动预稀释程序，将培养袋内含物泵入以8000转/分钟速度旋转的离心机转筒中。泵速度在50-200毫升/分钟。一旦清空培养袋，将泵反送、输出150毫升清洗溶液到培养袋中，作为冲洗体积。在传输冲洗体积的过程中，使用偏离水平5.5度倾斜的振动台，搅动培养袋(180赫兹，1.5英寸峰到峰振幅)。当150毫升清洗溶液送入培养袋后，振动器仍继续振动45秒后停止。冲洗体积从培养袋中腾空，并泵入离心机转筒。接着，将5毫升清洗溶液泵出最终产物袋线路，冲洗T-连接(T-冲洗)，再泵入离心机转筒。T-冲洗后，使用前述步骤过程中移入此线路的冲洗溶液，净化供体压力监视器(DPM)线路。此步骤的完成是通过打开内部连接供体压力监视器线路的净化阀，穿过此线路中的抗菌过滤器抽入大约8毫升空气，将线路驻留的液体抽入转筒中。在此过程中周期性地进行DPM线路的净化，以防止DPM线路中捕集分析物，其能够在处理过程后期污染处理液。在净化DPM线路后，制动离心机，使其停止。一旦离心机转筒不再旋转，就将大约30毫升转筒内含物泵回培养袋中。再次启动离心机并加速至8000转/分钟之前，将转筒内含物均衡30秒。以50-100毫升/分钟速度将30毫升培养袋内含物送回离心机转筒。接着，当离心机保持转动时，使泵停止。15秒钟后，培养袋振动器开始工作，向培养袋泵送传输150毫升清洗溶液的冲洗体积。振动器继续工作，大约45秒后停止。然后，将冲洗体积从培养袋中泵出，再泵入旋转的离心机转筒。如上所述地重复T-冲洗和DPM线路的净化。接着，以大约50毫升/分钟速度将清洗溶液泵入转筒，并使用大约130毫升清洗溶液，漂洗转筒内含物。然后，关闭离心机，将转筒内含物送回培养袋中。完成此过程的预稀释程序。稀释程序如下开始稀释程序，启动振动器，将300毫升清洗溶液(例如，0.2％葡萄糖和0.9％盐溶液)加入培养袋，稀释培养袋内含物。10秒钟后关闭振动器，再将培养袋内含物均衡45秒。接着，将培养袋内含物泵入以8000转/分钟旋转的离心机转筒。泵速度在50-200毫升/分钟。重复T-冲洗与DPM线路的净化。用80毫升清洗溶液冲洗培养袋，并在振动台上搅动30-45秒，再将冲洗体积转移至转筒中。接着，以50-100毫升/分钟泵速率用50毫升清洗溶液漂洗转筒。将转筒内含物返回培养袋中。一旦腾空转筒，就将系统压力监视器线路(关闭转筒流出线路)的内含物排净到转筒中。使用前述步骤中并入此线路的清洗溶液，净化系统压力监视器(SPM)线路。此过程的完成是通过打开内部连接系统压力监视器的净化阀，穿过此线路中的抗菌过滤器抽入大约8毫升空气，将线路驻留的液体抽入转筒中。在此过程中，周期性地进行SPM线路的净化，以防止SPM线路中分析物的捕集，其能够在处理过程后期污染产品。将转筒中的SPM净化体积腾空到培养袋中。
接着，用振动器搅动培养袋的内含物，用300毫升清洗溶液第二次稀释，并静置均衡45秒。接着，将培养袋内含物移入转筒中。重复T-冲洗和DPM路线的净化。随后，用80毫升清洗溶液第二次冲洗培养袋。将第二冲洗液加入转筒。用50毫升清洗溶液第二次漂洗转筒。将转筒内含物送回培养袋中。重复SPM线路的净化。加入第三次稀释的300毫升清洗溶液，再均衡45秒。将培养袋内含物送回转筒。重复T-冲洗和DPM线路的净化。如上所述，漂洗培养袋和转筒。净化SPM线路。上述过程(稀释、T-冲洗、DPM线路净化、袋冲洗、转筒漂洗、返回、SPM线路净化)重复十次以上。只在前十次的稀释过程中，进行DPM和SPM线路的净化。在第12次稀释中的最后T-冲洗将彻底清空产物袋线路的清洗溶液，因此该线路被整理干净。在第12轮中，稀释步骤如上所述，但是在移入转筒和T-冲洗后，开始95毫升清洗循环程序。
首先，将95毫升清洗溶液以75毫升/分钟速度泵入转筒。随后，离心机停止工作，并将30毫升转筒内含物移入培养袋中，经过45秒延迟，再次启动离心机。转筒以8000转/分钟速度旋转30秒，将培养袋中30毫升悬液送回转筒。再将第二个95毫升清洗溶液移入转筒中。再次关闭离心机，并将30毫升转筒内含物移入培养袋中，经过45秒延迟，再次启动离心机。转筒以8000转/分钟速度旋转30秒，再将培养袋中30毫升悬液送回转筒。此过程另重复5次。在第7次清洗后，关闭离心机，并将30毫升转筒内含物腾空到产物袋中。以8000转/分钟速度再次启动离心机，并旋转45秒。接着，以75毫升/分钟速度将250毫升贮存溶液加入含有血红细胞的离心机转筒中。关闭离心机，将转筒内含物送入最终的产物袋。取出最终产物袋，并密封。
因此，清洗过程由预稀释程序、12次300毫升清洗溶液的稀释和7次95毫升清洗溶液的清洗组成，总共需要大约5.5升清洗溶液和190分钟的用时。
实施2清洗的血红细胞在生命体外的生化特征与生命体内的生活力在CP2D储存营养液中，采集健康人类受检者的对照血液单位，并且在室温下通过Pall WBF2白细胞减少过滤器减少白细胞含量。采集后4小时，通过强力旋转(5,000g×5分钟，20℃)，将细胞转化为AS-3血红细胞(Medsep，Covina，CA)。将实验单元采集到CPD储存营养液中，并用Sepacell白细胞减少过滤器(Baxter，Round Lake，IL)减少白细胞。室温下保持4小时后，通过在20℃下以1,615g离心4分钟，将血红细胞转化为包裹的细胞，达到75-80％血球比率。然后，将乙亚胺低聚物以0.1％体积比无菌加入该单元中，使其浓度达到大约920微克/毫升。接着，在密闭系统装置(Haemonetics215，Braintree，MA)中，依照实施例1A所述的过程，用6升5％葡萄糖和0.9％NaCl清洗，该密闭系统装置是大约270毫升的转筒。加入硫代硫酸盐溶液，获得0.2mM最终浓度，再将100毫升AS-3储存营养液加入该单元。
单元在1-6℃监控冰箱中放置42天。在此过程前后以及储存21天、28天、35天、42天后，通过无菌连接装置(SCD312，Terumo，Elkton，MD)提取等分试样。应用计算的比重，将单元质量转化为体积(1412*质量)/(旋转的血球比率+1436)，参见，例如Halling等人，Transfusion3121S，1991。
储存28天后，提取等分试样，应用标准技术，以51Cr作为放射性标记，参见，例如血液学标准化国际委员会推荐的方法，用于放射性同位素血红细胞生存的研究.Blood；38378-86，1971；以及Moroff等人，Transfusion24109-114，1984。
在同一天早晨，将从人类受检者采集新鲜的样品放入肝素中，同时使用99mTc放射性标记确定血红细胞体积。参见，Bandy等人，J.Nucl.Med，16435-437，1975。同时注射两种放射性标记后，到30分钟时多静脉取样(通过99mTc测定红细胞体积)，在24小时取样为了以51Cr确定其恢复状况。在培养期结尾的清洗步骤后，经过21天与28天储存时，基于加入化学品后溶解细胞与上清液的提取样品，使用敏感度为0.03微克/毫升的高压液相色谱法，测定乙亚胺低聚物的浓度。
除了减少白细胞过程后的白细胞计数外，使用自动计数器(Advia120，Bayer，Norwood，MA)，进行细胞计数，该白细胞计数是通过Nageotte容器进行的，参见，Dzik等人，Transfusion33272-273，1993。
此单元的上清液以3600转/分钟(MP4R，国际设备公司，Needham Height，MA)，旋转2次持续10分钟，再使用COBASFARA(Roche，Nutley，NJ)自动进行的Drabkin试剂法分析血红蛋白，并以浊度校正。使用离子特异性电极(Hitachi917，Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，IN)，确定上清液电解质浓度。使用葡萄糖氧化酶(Hitachi917)，测定葡萄糖浓度。乳酸盐的测定是通过乳酸盐氧化酶与过氧化酶的终点反应(Hitachi917)。用血气分析机测定PH值(Model855，Bayer)，并在37℃下读取数据。用3M碳酸钾中和红细胞高氯酸的提取物，在COBAS FARA上使用适当的试剂盒(sigma)分析其ATP含量(在以磷酸甘油酸磷酸激酶消耗ATP后，通过甘油醛磷酸脱氢酶测定NADH的氧化作用)和其DPG含量(通过测定NADH的氧化作用)。在-70-80℃下将加工的样品存储至4个月后，分批测定上清液。按双份样品进行生化分析，平均所得的结果，并反复分析数值悬殊很大的双份样品。
在储存期结束时，在各单元上打出ABO和Rh标记。同时，使用标准技术，在抗球蛋白相中，将各单元与受检者血浆交叉匹配。参见，例如技术手册，第13期.Bethesda美国血液银行协会，1999。
参与研究的受检者经历了一系列实验，在每次再输血前后，使用医学中心临床实验室的标准方法。这些分析包括全血计数、尿分析、血清电解质、磷酸盐、尿酸、BUN、肌酸酐、天冬氨酸、和丙氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、全胆红素、葡萄糖、碱性磷酸酶、全蛋白、白蛋白、甘油三酯、和胆固醇。
以双t实验进行统计分析，该双t实验选择0.05两个尾数的概率，作为丢去无效假说的标准。所有数据以平均值±1标准的偏差表示。
加入乙亚胺低聚物，立即达到期望的浓度920微克/毫升。在清洗步骤后立即取样、以及在存储的第21天和第28天取样，其浓度均低于分析系统可测的界限，表明其浓度减少了104倍。
由于对照单元的定义，使对照与实验单元的处理中出现差别，该对照单元被假设为在受检者红细胞储存中，保证不含非典型的结果，而不是作为识别实验系统特殊特征效果的平均值。因而，在贮存期开始，对照与实验单元之间(64.9±1.3％对应50.8±3.4％)，单元的旋转血球比存在差别(p＜0.05)，在第0天对照组的PH值略高，与实验组相比(15-16小时)对照组的储存期更短(5-6小时)。此外，清洗过后，实验单元几乎不含有血浆，而对照单元还含有残留的10-15％血浆。所有单元都储存在聚氯乙烯袋中，但是清洗的实验单元储存在Haemonetics袋中，而对照单元储存在Medsep袋中。所有单元含有小于1×106个白细胞。
对于经处理和清洗的细胞，血球比率，从强力旋转产生的“包裹的红细胞单元”的相似含量，下降到穿过Haemonetics215的含量。由此过程恢复的红细胞，大约80％，受限于此装置转筒的容量(总容量275毫升)。视觉上未发现溶血作用。维持着清洗溶液电解质、PH、葡萄糖、内含物、以及ATP的变化。DPG降低到大约初始浓度的一半。
存储过程中，葡萄糖浓度降低，乳酸盐浓度升高。葡萄糖消耗速率相接近(对照0.37±0.09对应0.26±0.09毫摩尔/106个红细胞)，但统计上并不明显，然而，对照单元中生成的乳酸盐更多(对照0.91±0.12对应0.42±0.09毫摩尔/106个红细胞)。实验单元中上清液的钾含量更低。清洗后第0天纪录的PH值差别在整个存储期内一直存在，在第42天最显著。
在整个存储期内，所有单元的溶血作用低于1％。在实验单元中存在溶血增加的趋势，更长的存储期内该作用更加明显(第42天，对照0.23±0.11对应，实验0.70±0.24％；p＞0.05)。在整个存储过程中，各组之间ATP含量差别并不明显(第42天，对照2.89±0.65对应实验1.79±0.50微摩尔/克Hb；p＞0.05)。
储存28天后，将红细胞再注入受检者体内。应用双标记技术将对照组与实验组恢复24小时，两者之间没有差别，如表1所示。
表1.红细胞的恢复与存活24小时51Cr恢复(双标记法)实验单元85.0±5.0％对照单元85.9±2.7％实施例3白细胞的减少采集10个抗凝结全血单元，在4℃下使用Pall BPF4B降低白细胞过滤器，减少白细胞。按照实施例1A的过程清洗9个单元。用0.1％体积比的乙亚胺低聚物处理11个血液单元，在23℃下达到大约920微克/毫升浓度并持续24小时，再按照实施例1A的过程清洗。
在白细胞过滤以前，清洗、或用乙亚胺低聚物处理再清洗，每个血液单元含有2.4-4.7×109个白细胞。单独的白细胞过滤将白细胞含量减少到0.4-56×106个白细胞/血液单元。单独的清洗将白细胞含量减少到11-1100×106个白细胞/血液单元。用乙亚胺低聚物处理和清洗，但不进行白细胞过滤，将白细胞含量减少到1.3-4.1×106个白细胞/血液单元。
实施例4磷酸盐缓冲清洗溶液与非缓冲清洗溶液的比较4A.在清洗与储存42天后的生化参数在23℃下用0.1％体积比[920微克/毫升]乙亚胺低聚物处理12对相同的标准抗凝固、过滤白细胞的RBCC单元24小时。将2％体积比的0.25M过滤-无菌NaH2PO4中的乙亚胺低聚物原液加入RBCC单元。按照实施例1A的过程，用磷酸缓冲盐(PBS)清洗缓冲液(0.9％NaCl，12.5mM磷酸钠，PH7.7)清洗每对中的一个处理单元，另一个处理单元用标准的非缓冲盐溶液(0.9％NaCl，0.2％葡萄糖，Baxter)清洗。在1-6℃下，所有单元在AS-3溶液中储存42天。42天后，测定生化参数。经过42天储存，用PBS与盐溶液清洗单元的平均值分别是溶血作用0.55±0.21％和0.74±0.34％；ATP含量3.28±0.61微摩尔/克血红蛋白和2.3 3±0.44微摩尔/克血红蛋白；细胞外K+浓度43±7.4me/L和40±2.8me/L。
4B.分析物的减少在23℃下用0.1％(体积比)[920微克/毫升]乙亚胺低聚物处理7套相同的标准抗凝固、过滤白细胞的RBCC单元。将2％体积比的0.25M过滤-无菌NaH2PO4中的乙亚胺低聚物原液加入RBCC单元。处理的单元按照实施例1A或1B的过程，用清洗的盐溶液(0.9％氯化钠，0.2％葡萄糖)，或含有下列三种组合物之一的磷酸缓冲盐(PBS)清洗0.9％氯化钠，12.5mM磷酸钠(PBS)；0.9％氯化钠，50mM磷酸钠(PBS-50)；0.9％氯化钠，75mM磷酸钠(PBS-75)。清洗后，使用敏感度大于等于30毫微克/毫升的高压液相色谱法，测定乙亚胺低聚物的浓度。在使用盐溶液清洗RBCC的通常实验条件下，检测出72毫微克/毫升残留的乙亚胺低聚物；在12.5mM磷酸盐缓冲液清洗的RBCC中，检测出54毫微克/毫升残留的乙亚胺低聚物；在50mM磷酸盐缓冲液清洗的RBCC中，检测出36毫微克/毫升残留的乙亚胺低聚物；在75mM磷酸盐缓冲液清洗的RBCC中，检测出15毫微克/毫升残留的乙亚胺低聚物。所有处理的和清洗的单元在1-6℃下储存42天。用盐溶液、PBS、PBS-50、和PBS-75清洗并经42天储存的单元平均值分别是溶血作用0.8±0.28％，0.42±0.06％，0.43±0.13％，0.68±0.17％；ATP含量2.05±0.06微摩尔/克血红蛋白，3.42±0.18微摩尔/克血红蛋白，3.67±0.33微摩尔/克血红蛋白，4.25±0.41微摩尔/克血红蛋白；细胞外K+浓度是38.5±5.1mEq/L，36.6±4.3mEq/L，35.7±3.1mEq/L，36.3±3.2mEq/L。
实施例5分析清洗的血红细胞中蛋白分析物的去除5A.分析人血清白蛋白的去除依照实施例1A的方法不断反复清洗血红细胞浓缩物，使用蛋白印迹化学发光测定法，测定去除的蛋白含量。
将每个待测人血清白蛋白(HSA)含量的样品分成等分试样。每个样品的等分试样(1毫升)以2500转/分钟离心10分钟，再去除上清液。分析每套中标记A、B、C的3个样品是否含有白蛋白。样品A指的是处理前的血液。样品B是对照清洗的血液，样品C是在室温下用0.1％体积比、920毫微克/毫升乙亚胺低聚物处理24小时再清洗的血液。在装入SDS凝胶前，将预处理试样(试样A)稀释10,000倍。不稀释试样B和C。用降低试样缓冲液的2X SDS凝胶稀释所有试样，并煮沸3分钟。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离10微升的每种试样，并使用Bio-Rad semi-dry系统将其电泳迁移到硝酸纤维膜上。室温下(或者，在4℃下放置过夜)在阻塞溶液(3％Dry-Powder mild，made in1X PBS)中放置1小时，通过振动膜阻塞非特异性结合位点。印迹与人血清白蛋白特异性单克隆抗体(克隆#HAS-11，Sigma，lot#127H4847)共同培养。抗体在1X PBS溶液中以1∶2000稀释，并与膜连接。在膜结合了第一抗体后，用1X PBS/Tween清洗膜两次，持续5分钟，再用大量的DD水清洗。接着，将膜与按1∶30,000比例稀释的蛋白A-HRP配合物共同培养45分钟。用1X PBS漂洗印迹，一次5分钟，接着用水冲洗。使用AmershamPharmacia溶液装置，应用化学发光测定法，完成酶标记第二抗体的显影。
为了制备标准，将来自Alpha Biotech(5％)的纯人血清白蛋白缓冲交换到5mM磷酸钠(PH7.4)中。蛋白浓度是31.1毫克/毫升。
结果表明使用此检测方法，有可能检测出试样中低到10毫微克浓度的人血清白蛋白。检测7个试样中每个试样，4个试样表明，对照与处理的试样具有非常相似的白蛋白去除量。残留的蛋白含量比所用的最低标准低很多，10毫微克。
正常人类血浆中白蛋白浓度在30-50毫克/毫升，因此，按照实施例1A的方法白蛋白去除量应该至少在106倍。
5B.分析人血清白蛋白与免疫球蛋白G的去除依照实施例1A的方法不断反复清洗去除白细胞的血红细胞浓缩物，使用蛋白印迹化学发光测定法，测定去除的蛋白含量。
将每个样品分成等分试样。每个样品的等分试样(1毫升)以5000g离心5分钟，去除上清液，以16,000g离心10分钟，再将上清液从沉淀中移出。定量分析样品，确定其是否含有人血清白蛋白和免疫球蛋白G。样品A指的是处理前的血液。为了分别分析人血清白蛋白与免疫球蛋白G，在装入SDS凝胶前，以1∶2000或1∶10,000稀释预处理试样(样品A)。清洗后的样品不必稀释。用不减少样品缓冲液的2X SDS凝胶进一步稀释所有样品，并煮沸3分钟。
使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离10微升的每种试样，并将其电泳迁移到硝酸纤维膜上。室温下(或者，在4℃下放置过夜)在阻塞溶液(3％Dry-Powder mild，made in 1X PBS)中放置1小时，通过振动膜阻塞非特异性结合位点。为了分析人血清白蛋白，印迹与人血清白蛋白特异性单克隆抗体(克隆#HAS-11，Sigma，A8763)共同培养。抗体在1X阻塞溶液中以1∶2000稀释，并与膜连接。在膜结合了第一抗体后，用1X PBS/Tween清洗膜4次，持续5分钟。将膜与按1∶10,000稀释的羊抗鼠免疫球蛋白G HRP配合物共同培养60分钟。用1X TBST漂洗印迹4次，持续5分钟。为了检测免疫球蛋白G，除了用1∶30,000稀释的蛋白A HRP配合物(Pierce#32400)进行测定外，步骤与上述相同。应用化学发光测定法(ECL+，Pharmacia Amersham)，完成酶标记第二抗体的显影。应用Flour S化学发光成像仪(BioRad)捕捉图像，进行定量处理，使用第一定量软件(BioRad)进行分析。
为了制备标准，再次悬浮纯人血清白蛋白，主要是来自Sigma(A8763)的免疫球蛋白，并在PBS缓冲液中稀释至需要的浓度。将纯人免疫球蛋白G(Alpha Biotech)作为免疫球蛋白的标准。结论表明，使用此检测方法，可能在初始样品中检测出低至98毫微克/毫升(0.49毫微克)浓度的HAS和小于等于18毫微克/毫升免疫球蛋白G。清洗后残留的白蛋白与免疫球蛋白G浓度分别是440毫微克/毫升和140毫微克/毫升。
在初始RBCC上清液中，白蛋白和免疫球蛋白G的浓度分别是28±4毫克/毫升和9.7±3.3毫克/毫升，因此，依照实施例1A所述的方法，白蛋白和免疫球蛋白G的去除量大约应是残留量的104.8倍。
实施例6蛋白感染素蛋白掺合材料的制备A.瘙痒病仓鼠脑组织均浆的制备在冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)中将瘙痒病(菌株263K)感染的仓鼠脑搅均，最终达到10％(重量/体积)浓度。组织均浆经声波处理(Microsonix Cup超声波仪设置8-10，3×1分钟)，生成均匀的悬液，用于掺合。
B.瘙痒病仓鼠脑微神经元致病蛋白感染素蛋白的制备如上所述，搅均、并用超声波处理瘙痒病(菌株263K)感染的仓鼠脑。将此制备物低速(5,000g，持续10分钟)离心，沉淀粗碎片。去除上清液，超离心(200,000g，持续30分钟)沉淀致病的蛋白感染素蛋白。小心去除并丢弃上清液和脂外皮。在PBS中再悬浮此沉淀，将其声波处理致均匀，再用于掺合。
C.正常牛脑组织均浆的制备使用超声波处理，搅均正常的牛脑。用2％Triton X100从组织均浆中抽提非传染性蛋白感染素蛋白。使用SP-琼脂糖凝胶色谱法、与金属螯合色谱法，部分地提纯抽提的混合物。含有非传染性蛋白感染素蛋白的片段用于掺合。
D.来自人血小板的正常蛋白感染素蛋白(huPltPrPC)1.984毫微克/毫升的制备物用HEPES缓冲液清洗来自一个去除单元的血小板。加入CaCl2和钙离子载体，诱导血小板的活性。将活化的血小板以230,000g超离心1小时，沉淀出不可溶的蛋白。将含有984毫微克/毫升可溶非传染蛋白感染素蛋白的上清液用于掺合。
2.5400毫微克/毫升的制备物用HEPES缓冲液清洗来自6个去除单元的血小板。加入CaCl2和钙离子载体，诱导血小板活性。加入蛋白酶抑制剂，阻止蛋白水解。在230,000g下，超离心活化的血小板1小时，沉淀出细胞碎片和非可溶的蛋白。使用10KDa公称分子量分界的离心浓缩器，将含有可溶的非传染蛋白感染素蛋白的上清液浓缩大约10倍，并将浓缩物用于掺合。该45毫升掺合液(spike)含有5400毫微克/毫升非传染性蛋白感染素蛋白。
E.叙利亚仓鼠重组的蛋白感染素蛋白(Sha rPrP)从动物健康研究所TSE资源中心(Compton，Berkshire，UK)获得重组α和β型的全长蛋白感染素蛋白。主要在大肠杆菌中表达该蛋白，并且在还原和变性条件下，应用IMAC和阳离子交换色谱法，提取并提纯。使用Jackson和其同事的CuCl2渗析法，将此蛋白氧化、并重折叠成其α型(Jackson，G.S.等人(1999)。不同表达人蛋白感染素蛋白的多种折叠途径，Biochim Biophys Acta1431，1-13。从重组的蛋白感染素蛋白α型制备重组的蛋白感染素蛋白β型(Jackson，G.S.等人，1999)。由SDS凝胶分析、质谱分析、和循环二色性提供了重组蛋白α和β型的质量控制数据。在掺合实验中使用以前，用100,000g离心重组的蛋白1小时，去除在存储或冷冻中形成的不溶蛋白，并用紫外光谱法测定其浓度。
实施例7使用自动清洗过程去除蛋白感染素蛋白A.从RBCC中去除瘙痒病感染的仓鼠脑组织均浆使用白细胞过滤器，例如PALL RCXL11，降低抗凝结RBCC单元的白细胞。以5％体积比，将按照实施例6制备的10％瘙痒症感染的仓鼠脑组织均浆加入RBCC(大约2个脑或200微克致病蛋白感染素蛋白)，再人工混合此单元1分钟。室温下搅拌培养此RBCC单元1小时。接着，按照实施例1A清洗此RBCC单元。
从清洗的RBCC单元提取0.5毫升样品，再用等体积的10％sarkosyl溶解。室温下以130,000g旋转此样品30分钟。内生的非传染蛋白感染素蛋白是可溶的，并与保留在上清液中的其它血液成分共同倾析。然后，用5％sarkosyl清洗一次沉淀，再在室温下以130,000g超离心30分钟。用PBS溶液清洗一次沉淀，去除残留的sarkosyl，再在室温下以130,000g超离心30分钟。将最后的沉淀再次悬浮在PH7.4、小容积的6M胍盐酸、50mM Tris溶液中，用声波处理使其均匀，再煮沸10分钟。然后，使用时间增强的溶解性分解荧光免疫分析法(DELFIA，参见，HemmilaScand.J.Clin.lab Invest，48389-399，1988，和MacGregor等人，Vox Sang，7788-96，1999)，直接化验样品的蛋白感染素蛋白、或致病的蛋白感染素蛋白(在GdnCl中变性后)。
与未清洗的掺合对照中瘙痒症脑组织均浆浓度相比，瘙痒症仓鼠脑组织均浆的浓度降低了101.2-103.0倍。通过将样品与标准曲线比较，测定了文中所述自动和人工清洗过程中以对数表示的去除率，该标准曲线的生成是通过将最初掺合的WB有限地稀释到非掺合的类似WB中。此外，使用由非传染性蛋白感染素蛋白校验剂血小板生成的标准曲线，量化非传染的蛋白感染素蛋白含量。先使用洗涤剂(1.0％Triton X100)处理清洗的血小板，随后以2000g离心20分钟，去除粗糙的细胞碎片，得到非传染性蛋白感染素蛋白校验剂。校验剂参照SHa重组蛋白感染素蛋白公知浓度的标准曲线，进行校准，并测定为709毫微克/毫升。
B.从全血中去除瘙痒病感染的仓鼠脑组织均浆按实施例6所述，制备10％仓鼠瘙痒病脑组织均浆(菌株263K)。用5％体积的10％SBH(大约3个脑或300微克致病的蛋白感染素蛋白)掺合全血(WB)单元，并在22℃下培养1小时。将该单元分离成RBCC成分(1300g，4分钟)，该RBCC成分再悬浮在AS-3溶液中，并通过Pall RCXL1白细胞降低过滤器减少白细胞。按照实施例1A清洗白细胞减少的单元。在白细胞减少前、后和清洗过程之后，提取试样用于分析。去除内生非传染的蛋白感染素蛋白，利用超离心过程从样品中获得致病蛋白感染素蛋白，并按实施例7A所述测定。
致病的蛋白感染素蛋白的减少量大于10-102.9倍。100.1-100.8的清除率归因于减少白细胞的过程，101.6-102.1的清除率归因于所述的清洗过程。
C.去除人内生非传染的蛋白感染素蛋白应用标准血液存储技术(1300g，4分钟)，将全血单元分离成RBCC。将该RBCC穿过PALL RCXL1白细胞减少过滤器，过滤白细胞。按照实施例1A的过程，清洗过滤了白细胞的RBCC单元(LR-RBCC)。
使用实施例7A所述的时间增强的溶解性分解荧光免疫分析法，量化与RBCC连接的残留非传染蛋白感染素蛋白。人内生蛋白感染素蛋白的浓度降低到分析测定的水平。与未清洗对照中人内生非传染蛋白感染素蛋白的浓度相比，人内生蛋白感染素蛋白的浓度降低了102(101.8-102)。
D.去除人内生非传染性蛋白感染素蛋白和掺合的人血小板派生的非传染性蛋白感染素蛋白使用标准的血液存储技术(1300g，4分钟)，将两个相容的全血单元分离成RBCC。将两个单元合并，再分配到两个相同的单元中。将实施例6D2所述制备的人血小板派生的非传染性蛋白感染素蛋白(240ug)掺合到一个RBCC单元中，并培养1小时。第二个单元容纳了等体积的HEPES缓冲液。将RBCC单元通过PALL RCXL1白细胞减少过滤器，过滤其白细胞。按照实施例1A的过程(n＝5)清洗白细胞减少的RBCC单元。使用实施例7A所述的时间增强的溶解性分解荧光免疫分析法，测定细胞片段和游离细胞片段中内生和掺合的蛋白感染素蛋白浓度。通过标准曲线测定游离细胞样品中蛋白感染素蛋白的浓度，该标准曲线是由血小板派生的非传染性蛋白感染素蛋白校准剂产生的。细胞片段的减少是基于，将掺合原材料连续地稀释到非掺合的清洗血液中。
对细胞片段的分析表明，单独的清洗过程造成了huPltPrPC的103倍降低。此外，在减少白细胞以前，内生PrPC和huPltPrPC的含量分别是32.4毫微克/毫升和1140毫微克/毫升；清洗前分别是16.3毫微克/毫升和850毫微克/毫升；清洗后，分析出的非细胞成分小于等于0.14毫微克/毫升。内生非传染性蛋白感染素蛋白减少总量达到大于102.35倍，其中100.3是由白细胞过滤去除的，清洗进一步减少了大于102倍内生非传染蛋白感染素蛋白的含量。同样，huPltPrPC减少总量达到大于103.9倍，其中100.13倍是由白细胞过滤去除的，清洗进一步减少了大于等于103.7倍内生非传染蛋白感染素蛋白的含量。
E.去除叙利亚仓鼠重组的蛋白感染素蛋白使用标准的血液存储技术(1300g，4分钟)，将两个相容的全血单元分离成RBCC。将两个单元合并，再分配到两个相同的单元中。将RBCC单元通过PALL RCXL1白细胞降低过滤器，过滤白细胞。按实施例6E所述制备来源于大肠杆菌的叙利亚仓鼠rPrP重组体(400毫微克)，将其掺合到一个RBCC单元之中，并培养1小时。第二个单元容纳了等体积的HEPES缓冲液。按照实施例1A的过程，清洗过滤了白细胞的RBCC单元。使用实施例7A所述的时间增强的溶解性分解荧光免疫分析法，测定细胞和游离细胞片段中掺合的蛋白感染素蛋白浓度。通过与标准曲线相比较，测定游离细胞样品中蛋白感染素蛋白的浓度，该标准曲线是由血小板派生的非传染性蛋白感染素蛋白校准剂生成的。细胞片段的减少是基于，将掺合的原材料连续地稀释到非掺合的清洗血液中。
在清洗前，游离细胞悬液中α型Sha重组蛋白感染素蛋白的含量是1405毫微克/毫升，清洗后小于等于0.12毫微克/毫升，蛋白感染素蛋白减少量大于等于104倍。对细胞片段的分析证明了大于等于103倍的减少量。
实施例8通过人工清洗过程去除蛋白感染素蛋白使用白细胞过滤器，例如PALL RCXL1，减少抗凝结RBCC单元的白细胞。将含有或不含掺合剂的25毫升样品移入50毫升圆锥管中。再向此圆锥管中加入等体积的盐溶液和葡萄糖溶液，混合2分钟。离心此材料，沉淀出红细胞(2000g，持续4分钟)。在不搅混红细胞层的情况下，轻轻倒出上清液。加入盐溶液与葡萄糖溶液，将试管内含物恢复到其初始体积(25毫升)。重复此过程，共清洗11次。将最后的RBCC沉淀再悬浮在AS-3贮存介质中。
当RBCC不含掺合剂时，使用实施例7A所述的时间增强的溶解性分解荧光免疫分析法，测定内生非传染性的蛋白感染素蛋白。与未清洗对照的人内生非传染性蛋白感染素蛋白的浓度相比，清洗的样品中人内生非传染蛋白感染素蛋白的浓度至少减少了100倍。
将如实施例6所述制备的牛非传染蛋白感染素蛋白或huPltPrPC以10％体积比掺入25毫升RBCC样品，使用实施例7A所述的时间增强的溶解性分解荧光免疫分析法，测定非传染的蛋白感染素蛋白。与未清洗对照的牛非传染性蛋白感染素蛋白或huPltPrPC的浓度相比，清洗的样品中牛非传染蛋白感染素蛋白或huPltPrPC浓度降低。
将如实施例6所述制备的瘙痒病仓鼠脑组织均浆的致病蛋白感染素蛋白或瘙痒病仓鼠脑微神经元的致病蛋白感染素蛋白，以10％体积比掺入25毫升RBCC样品，采取离心样品的步骤，并使用实施例7A所述的时间增强的溶解性分解荧光免疫分析法，测定致病的蛋白感染素蛋白。与未清洗对照中其浓度相比，瘙痒病仓鼠脑组织均浆的致病蛋白感染素蛋白或瘙痒病仓鼠脑微神经元的致病蛋白感染素蛋白的浓度降低。
实施例9-将HSA和IgG的去除与PrP去除相比较将RBCC单元与实施例7D和E所述的huPlt PrPc或α型SHarPrP掺合，并按照实施例1A的方法清洗。在每次清洗循环后移出样品，使用实施例5B的方法，定量分析游离细胞片段，测定是否存在HSA和IgG，并且如实施例7A所述，定量蛋白感染素蛋白。HAS(n＝5)、IgG(n＝5)、huPltPrPc(n＝5)、和rPrP(n＝2)的平均初始含量分别是27.9毫克/毫升、9.67毫克/毫升、850毫微克/毫升、和1405毫微克/毫升。在初始的4次清洗循环中，蛋白感染素蛋白的去除率与人血清白蛋白和免疫球蛋白G的去除率相同，在这4次清洗循环后，蛋白感染素蛋白含量降低到DELFIA测定法的敏感含量之下。第一次清洗循环结束时，人血清白蛋白和免疫球蛋白G、huPltPrPc、rPrPc的全部去除率分别是101.63、101.58、101.60和101.52。第二次清洗循环结束时分别是102.78、102.69、102.76、102.71；第三次清洗循环结束时分别是103.60、103.39、103.61、103.13；第四次清洗循环结束时分别是104.17、103.88、103.88、103.62。在最后清洗的样品中，人血清白蛋白和免疫球蛋白G的含量分别进一步降低到0.44ug/毫升和0.14ug/毫升，说明总减少量分别是104.8和104.83。由于含量降低到分析法敏感度水平以下(0.14ng/毫升)，因此不可能在第四次清洗后定量蛋白感染素蛋白。
实施例10对减少海绵状脑病血液介质传播的分析10A.对减少传染性海绵状脑病血液介质传播的羊生物鉴定用上述多倍计量的牛海绵状脑病传染的牛脑组织均浆，喂食1-5只VRQ/VRQ北英格兰切维厄特绵羊，例如Houston，F；Foster，J.D；Chong，A；Hunter，N，和Bostock，C.J.通过输血在羊中传播牛海绵状脑病.Lancet.2000年9月16日；356(9234)999-1000。优选的是，在前三个月中，以每月间隔喂食1-2克剂量。在10天、六个月、12个月、18个月和所选时间，从每只羊，采集两个或多个血液单元。依照实施例1A或1B的过程，在每个时间点清洗采集的血液，剩余的单元在室温下保存，作为对照。按照实施例5、7、或9任一所述，测定通过实施例1A或1B过程中胞外蛋白的减少，例如，免疫球蛋白G、和/或血清白蛋白、和/或细胞蛋白感染素蛋白、和/或传染的蛋白感染素蛋白的减少。
用至少来自一个时间点(组A受体羊)的清洗RBCC单元，输入NZ切维厄特羊受体(ARQ/ARQ)，并用来自相同时间点未清洗对照的未清洗全血、或天然的血浆衰竭红细胞片段输入第二受体(组B受体羊)。
观察受体羊5年，寻找本发明详细说明所述的传染性海绵状脑病的病征，并且/或测定该疾病的生化指标。例如，在第二次传染一组近交实验鼠后，采用蛋白感染素蛋白甘油型(Hope，J Wood，S.C Birkett，CR，Chong，A，Bruce，M.E，Cairns，D，Goldmann，W，Hunter，N和Bostock，CJ(1999)。对绵羊蛋白感染素蛋白的分子分析鉴别出牛海绵状脑病与天然瘙痒病实验离析物之间的相似性，CH1641.J Gen Virol80(Pt1)，1-4)或传统的损伤轮廓印迹型操作法，获得将牛海绵状脑病传染给输血受体的有力证据。
与组B受体相比，作为传染性海绵状脑病通过输血传播风险的正向降低，记录下了组A受体中发病率或疾病生化指标的明显降低。与组B受体相比，作为通过输血疾病从潜伏到发作所需时间的正向延长，纪录下了组A受体中疾病发作的明显延迟或疾病的生化指标。
10B.对减少传染性海绵状脑病血液介质传播的鼠生物鉴定将按照实施例1A或1B(受体组A)清洗的20uL潜在传染的RBCC注入受体鼠脑内，并将20ul对应的未清洗全血、或天然血浆衰竭的红细胞片段对照(受体组B)注入第二组受体鼠。测定潜在传染的清洗RBCC单元和未清洗对照中的胞外蛋白浓度，诸如，免疫球蛋白G或血清白蛋白、如实施例5、7或9所述的细胞蛋白感染素蛋白、和/或致病的蛋白感染素蛋白。受体鼠可以是敏感的转基因系，诸如公知系Tg101L、或TgHu101L、或Tg BoPrP或常规的RIII或C57B1鼠(Bruce，M.E，Will，RG，Ironside，J.W，McConnell，I，Drummond，D，Suttie，A，McCardle，L，Chree，A，Hope，J，Birkett，C，Cousens，S，Fraser，H，and Bostock，CJ(1997).对鼠的传播表明CJD的“新型变异”是由牛海绵状脑病介质造成的.Nature 389,498-501；Bruce，M.E(1993).瘙痒病菌株变异和突变.Br Med Bull49,822-38)。
作为降低传染性海绵状脑病通过输血传播风险的证据，与组B受体相比，将明显降低的组A受体发病率或疾病生化指标纪录在案。作为通过输血疾病从潜伏到发作所需时间的延长，与组B受体相比，将组A受体疾病发作的明显延迟或疾病的生化指标纪录在案。
实施例11降低了传染性海绵状脑病通过输血的传播按照实施例1A或1B清洗人RBCC单元。测定人RBCC胞外蛋白的浓度，诸如免疫球蛋白G或血清白蛋白、如实施例5、7、或9所述的蛋白感染素蛋白、和/或致病的蛋白感染素蛋白。含有一定胞外蛋白浓度的RBCC与上述输入受体实施例10纪录的RBCC单元相对应。
其它实施方案通过上述描述，业内技术人员容易确定本发明的重要特征。在不超出本发明范围和思想的情况下，业内技术人员能够对本发明进行多种变化和改进，使其适应不同的用途和条件。其它实施方案也在权利要求范围之内。
权利要求
1.一种减少血细胞悬液中分析物浓度的方法，该方法包括(i)提供容积大于50毫升血细胞初始悬液，其中含有血细胞和胞外液；(ii)用特定清洗溶液清洗血细胞初始悬液，与血细胞初始悬液的分析物浓度相比，分析物浓度足以减少了至少103倍，其中血细胞悬液的血细胞在4℃下于储存液中保存超过21天，仍保持生活力。
2.根据权利要求1的方法，其中清洗包括(i)离心血细胞初始组合物，生成粒状细胞碎片和上清液；(ii)从粒状细胞碎片去除上清液；(iii)向粒状细胞碎片加入清洗溶液；(iv)清洗溶液中再悬浮粒状细胞碎片，生成再悬浮的细胞悬液；(v)任意重复步骤(i)-(iv)；(vi)在储存液中再悬浮粒状细胞碎片。
3.根据权利要求2的方法，其中分析物是小分子。
4.根据权利要求3的方法，其中小分子是乙亚胺低聚物，吩噻嗪衍生物、吖啶衍生物、补骨脂素衍生物或核黄素。
5.根据权利要求3的方法，其中小分子是治疗剂。
6.根据权利要求2的方法，其中分析物是蛋白。
7.根据权利要求6的方法，其中蛋白是蛋白感染素蛋白。
8.根据权利要求7的方法，其中蛋白感染素蛋白是致病蛋白。
9.根据权利要求2的方法，其中分析物是细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中细胞是白细胞。
11.根据权利要求10的方法，其中该方法还包括，用抗病原体处理血细胞的初始悬液。
12.根据权利要求11的方法，其中抗病原体是乙亚胺低聚物，吩噻嗪衍生物、吖啶衍生物、补骨脂素衍生物或核黄素。
13.一种减少血细胞悬液中胞外液浓度的方法，其中包括(i)提供容积大于50毫升血细胞初始悬液，血细胞悬液含有血细胞和胞外液；(ii)用特定清洗溶液清洗血细胞初始悬液，与血细胞初始悬液中胞外液含量相比，血细胞组合物中胞外液浓度足以减少了至少103倍，其中血细胞组合物中的血细胞在4℃下于储存液中保存至少超过28天，仍保持生活力。
14.根据权利要求13的方法，其中清洗包括(i)离心血细胞初始组合物，生成粒状细胞碎片和上清液；(ii)从粒状细胞碎片去除上清液；(iii)向粒状细胞碎片加入清洗溶液；(iv)在清洗溶液中再悬浮粒状细胞碎片，生成再悬浮的细胞悬液；(v)任意重复步骤(i)-(iv)；(vi)储存液中再悬浮粒状细胞碎片。
15.根据权利要求14的方法，其中血细胞组合物中的血细胞在4℃下于储存液中保存至少35天，仍保持生活力。
16.根据权利要求14的方法，其中血细胞悬液的胞外液含有分析物，与血细胞初始悬液中分析物浓度相比，清洗减少了分析物的浓度。
17.根据权利要求16的方法，其中与血细胞初始悬液中分析物浓度相比，分析物浓度至少减少了104倍。
18.根据权利要求17的方法，其中血细胞悬液主要含有哺乳动物的血红细胞。
19.根据权利要求18的方法，其中分析物是小分子。
20.根据权利要求19的方法，其中小分子是抗病原体。
21.根据权利要求20的方法，其中抗病原体减少到对哺乳动物血细胞受体无毒害的浓度。
22.根据权利要求21的方法，其中抗病原体是乙亚胺低聚物，吩噻嗪衍生物、吖啶衍生物、补骨脂素衍生物或核黄素。
23.根据权利要求19的方法，其中小分子是治疗剂。
24.根据权利要求22的方法，其中抗病原体是乙亚胺低聚物及其衍生物。
25.根据权利要求18的方法，还包括将哺乳动物血红细胞悬液穿过血液相容过滤器的步骤。
26.根据权利要求25的方法，其中血液相容过滤器是白细胞减少过滤器。
27.根据权利要求18的方法，其中分析物是蛋白。
28.根据权利要求27的方法，其中蛋白是蛋白感染素蛋白。
29.根据权利要求28的方法，其中蛋白感染素蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。
30.根据权利要求29的方法，还包括对致病蛋白感染素蛋白减少的测定。
31.根据权利要求26的方法，还包括对致病蛋白感染素蛋白减少的测定。
32.根据权利要求18的方法，还包括，向清洗溶液加入脂类乳化液。
33.根据权利要求32的方法，还包括对致病蛋白感染素蛋白减少的测定。
34.根据权利要求26的方法，还包括，向清洗溶液加入脂类乳化液。
35.根据权利要求34的方法，还包括对致病蛋白感染素蛋白减少的测定。
36.根据权利要求18的方法，还包括，用乙亚胺低聚体处理血细胞悬液。
37.根据权利要求36的方法，其中减少的分析物是细胞。
38.根据权利要求37的方法，其中该细胞是白细胞。
39.根据权利要求38的方法，包括对蛋白感染素蛋白减少的测定。
40.根据权利要求39的方法，包括对致病蛋白感染素蛋白减少的测定。
41.根据权利要求18的方法，其中清洗溶液是磷酸缓冲盐溶液。
42.根据权利要求41的方法，其中与用盐溶液或葡萄糖盐溶液清洗的血红细胞相比，血红细胞保留了更高的ATP含量。
43.根据权利要求18的方法，其中清洗是在密闭系统中进行。
44.根据权利要求43的方法，其中清洗自动进行。
45.一种血细胞组合物，其特征在于以权利要求13的方法制备。
46.根据权利要求45的血细胞组合物，其中血细胞组合物是有效的药用血产品。
47.一种输血的方法，包括将权利要求46的血细胞产品输入受体。
48.一种减少血细胞组合物中致病蛋白感染素蛋白浓度的方法，该方法包括(i)提供含有血红细胞和胞外液的哺乳动物血细胞初始悬液；(ii)用特定清洗溶液清洗血细胞悬液，与哺乳动物血细胞初始悬液中致病蛋白感染素蛋白浓度相比，充分减少了致病蛋白感染素蛋白的浓度。
49.根据权利要求48的方法，还包括分析血细胞悬液，测定是否含有致病蛋白感染素蛋白。
50.根据权利要求49的方法，还包括，与哺乳动物血细胞初始悬液的致病蛋白感染素浓度相比，检测出致病蛋白感染素蛋白浓度至少减少10倍。
51.根据权利要求48的方法，还包括分析血细胞组合物，测定是否含有蛋白感染素蛋白。
52.根据权利要求51的方法，还包括对蛋白感染素蛋白浓度至少减少100倍的检测。
53.根据权利要求48的方法，还包括，向清洗溶液加入脂类乳化液。
54.根据权利要求48的方法，还包括，将血细胞悬液透过血液相容过滤器。
55.根据权利要求48的方法，还包括，用抗病原体处理血细胞的初始悬液。
56.根据权利要求55的方法，其中抗病原体是乙亚胺低聚体。
57.一种血红细胞悬液，其特征在于是依照权利要求50获得的。
58.根据权利要求57的血红细胞悬液，其中血红细胞组合物是有效的药用血产品。
59.一种输血方法，包括将权利要求58的血细胞产品输入受体。
60.一种减少血产品传播传染性海绵状脑病风险的方法，包括充分减少血产品中可测细胞外蛋白含量的步骤。
61.根据权利要求60的方法，其中细胞外蛋白的减少是通过清洗血细胞悬液中的血细胞。
62.根据权利要求61的方法，其中清洗包括(i)提供了含有血细胞与胞外液的血细胞悬液；(ii)离心血细胞初始组合物，生成粒状细胞碎片和上清液；(ii)从粒状细胞碎片去除上清液；(iii)向粒状细胞碎片加入清洗溶液；(iv)在清洗溶液中再悬浮粒状细胞碎片，生成再悬浮的细胞悬液，并任意重复步骤(ii)-(iv)。
63.根据权利要求62的方法，其中减少的细胞外蛋白是蛋白感染素蛋白。
64.根据权利要求63的方法，其中减少的蛋白感染素蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。
65.根据权利要求62的方法，还包括对细胞外蛋白浓度减少的检测。
66.根据权利要求65的方法，其中细胞外蛋白选自血清白蛋白、免疫球蛋白G、细胞因子和蛋白感染素蛋白。
67.根据权利要求66的方法，其中细胞外蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。
68.根据权利要求62的方法，还包括用乙亚胺低聚物处理血细胞初始悬液的步骤。
69.根据权利要求62的方法，其中血产品是血红细胞的浓缩物。
70.根据权利要求62的方法，其中血细胞产品是人类血红细胞的浓缩物。
71.一种抑制传染性海绵状脑病通过血产品发作的方法，其中包括充分减少血产品中可测的细胞外蛋白含量的步骤。
72.根据权利要求71的方法，其中胞外蛋白的减少是通过清洗血细胞悬液中的血细胞。
73.根据权利要求71的方法，其中清洗包括(i)提供了含有血细胞与胞外液的血细胞悬液；(ii)离心血细胞初始组合物，生成粒状细胞碎片和上清液；(ii)从粒状细胞碎片去除上清液；(iii)向粒状细胞碎片加入清洗溶液；(iv)清洗溶液中再悬浮粒状细胞碎片，生成再悬浮的细胞悬液，并任意重复步骤(ii)-(iv)。
全文摘要
本发明是基于发明了从血细胞去除分析物的方法，该方法制备了明显减少细胞群体中残留分析物含量的血细胞。该方法能够适用大容积血细胞悬液，以此方法制备的细胞经长时间储存仍保持生活力，并且适用于治疗，诸如输血。可取的血细胞制备是含有血红细胞(RBC)群体的制备。
文档编号A61K35/18GK1681521SQ02805093
公开日2005年10月12日 申请日期2002年1月22日 优先权日2001年1月22日
发明者约翰·查普曼, 安德烈·珀马尔, 詹姆斯·霍普 申请人:V·I·技术有限公司